TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12971:2020 (ISO 15819:2014) VỀ MỸ PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH – CÁC NITROSAMIN: PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH N-NITROSODIETANOLAMIN (NDELA) BẰNG HPLC-MS-MS

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12971:2020

ISO 15819:2014

MỸ PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH – CÁC NITROSAMIN: PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH N-NITROSODIETANOLAMIN (NDELA) BẰNG HPLC-MS-MS

Cosmetics – Analyticai methods – Nitrosamines: Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics by HPLC-MS-MS

Lời nói đầu

TCVN 12971:2020 hoàn toàn tương đương với ISO 15819:2014.

TCVN 12971:2020 do Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC217 Mỹ phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

Lời giới thiệu

Con người có thể bị phơi nhiễm với N-nitrosamin qua nhiều nguồn như môi trường, thực phẩm hoặc các sản phẩm chăm sóc cá nhân. Do có khả năng gây ung thư đối với một số loài động vật, giảm thiểu phơi nhiễm với N-nitrosamin được ghi nhận là quan trọng đối với việc bảo vệ sức khỏe của con người. Trong số các N-nitrosamin, N-nitrosodietanolamin (NDELA) đã được thừa nhận là chất gây ô nhiễm tiềm ẩn đốt với mỹ phẩm.

Trong tiêu chuẩn này, một số phương pháp phân tích đã được xây dựng để phát hiện và xác định sự có mặt của chất này trong mỹ phẩm, như phân tích năng lượng nhiệt/sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được kết hợp hoặc với định lượng quang phân và sắc kế hoặc với xác định khối phổ (MS). Phương pháp xác định khối phổ sử dụng công nghệ tiên tiến để đảm bảo tính đặc hiệu tối đa theo NDELA, để giảm thiểu nguy cơ hình thành nhân tạo của chất phân tích này và cho phép định lượng chính xác.

Phương pháp phân tích này sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao được kết hợp với khối phổ để phân tách và phát hiện mức vết của NDELA từ thành phần mỹ phẩm hoặc nền sản phẩm có tính đặc hiệu tối đa đối với NDELA.

MỸ PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH – CÁC NITROSAMIN: PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH N-NITROSODIETANOLAMIN (NDELA) BẰNG HPLC-MS-MS

Cosmetics – Analyticai methods – Nitrosamines: Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics by HPLC-MS-MS

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát hiện và định lượng N-nitrosodietanolamin (NDELA) trong mỹ phẩm và nguyên liệu được sử dụng trong mỹ phẩm.

Phương pháp này không áp dụng đối với phát hiện và/hoặc định lượng các nitrosamin ngoài NDELA, không áp dụng đối với phát hiện và/hoặc định lượng NDELA trong các sản phẩm ngoại trừ mỹ phẩm hoặc nguyên liệu được sử dụng trong mỹ phẩm.

Nếu một sản phẩm có khả năng hoặc nhiễm NDELA từ các thành phần hoặc hình thành NDELA do sự hợp thành của các thành phần, thì phương pháp dự định được áp dụng để xác định định lượng NDELA. Do đó, phương pháp này không áp dụng cho thử nghiệm thường lệ các sản phẩm mỹ phẩm. Do tính đa dạng lớn của các sản phẩm mỹ phẩm trong lĩnh vực áp dụng này, phương pháp này có thể cần được chỉnh sửa đối với các nền cụ thể (xem ISO 12787).

Vì vậy, các tiêu chuẩn phương pháp thay thế để thử nghiệm các nitrosamin trong các sản phẩm mỹ phẩm đang được xây dựng. Các phương pháp khác có thể được sử dụng miễn là chứng minh được có thể phát hiện NDELA và được xác nhận các tiêu chí liên quan đến thu hồi và định lượng chất phân tích.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là cần thiết để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và các phương pháp thử

ISO 12787:2011 Cosmetics – Analytical methods – Validation criteria for analytical results using chromatographic techniques (Mỹ phẩm – Phương pháp phân tích – Các tiêu chí xác minh đối với các kết quả phân tích sử dụng các kỹ thuật sắc ký)

3  Nguyên tắc

NDELA trong các mẫu mỹ phẩm được chiết bằng nước với sự có mặt của d8-NDELA deutera là chuẩn nội (IS). Tiến hành làm sạch dịch chiết hoặc sử dụng chiết pha rắn (làm sạch bằng SPE, xem 6.3.1) bằng catridge C18 hoặc chiết lỏng – lỏng sử dụng diclorometan (làm sạch bằng DCM, xem 6.3.2) khi các mẫu không phân tán trong nước. Phân tích các dịch chiết bằng HPLC-MS-MS (sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phát hiện khối phổ kép).

Tiến hành nhận dạng NDELA bằng cách sử dụng một ion mẹ và hai ion con. Thực hiện định lượng NDELA bằng cách so sánh tỷ lệ của các ion mảnh chính của NDELA và d8-NDELA với đường chuẩn.

Theo ISO 12787, NDELA không có trong mẫu có thể được xác nhận bằng phân tích lần thứ hai.

Mẫu thêm chuẩn tại giá trị đích có thể được thực hiện để đánh giá giới hạn phát hiện NDELA trong mẫu.

Nếu quan sát được ảnh hưởng của nền có tác động đáng kể đến hiệu suất của phương pháp (độ nhạy, độ chính xác, v.v….) đối với sản phẩm mỹ phẩm cụ thể, các quy trình hiệu chuẩn bổ sung tiêu chuẩn có thể được sử dụng (xem ISO 12787).

4  Thuốc thử

Trong quá trình phân tích, trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng thuốc thử cấp độ phân tích đã được công nhận và nước cất hoặc nước loại 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môi phải có chất lượng phù hợp đối với HPLC-MS.

4.1  Metanol (MeOH), cấp tinh khiết HPLC-MS

4.2  Etanol (EtOH), cấp tinh khiết HPLC-MS

4.3  Diclorometan (DCM), cấp tinh khiết HPLC-MS

4.4  N-nitrosodietanolamin, có độ tinh khiết đã biết lớn hơn 95 %

4.5  d8-N-nitrosodietanolamin, có độ tinh khiết đã biết lớn hơn 95 %

4.6  Amoni acetat (NH₄Ac) cấp tinh khiết phân tích (phù hợp với HPLC-MS)

4.7  Dung dịch amoni acetat 1 mol/L, để chuẩn bị 1,0 L, hòa tan 77,08 g NH₄AC trong 1,0 L nước.

4.8  Dung dịch rửa giải A: NH₄AC 2 mmol trong nước, để chuẩn bị 1,0 L, lấy 2 ml- NH₄AC 1 mol/L (4.7) và thêm nước đến 1 L, lắc đều.

….

– chiều dài: 10mm

– đường kính trong: 2,1 – 3,0 mm

– cỡ hạt hình cầu: 5 µm

Việc sử dụng cột bảo vệ là tùy chọn. Nếu được sử dụng, đường kính trong của cột bảo vệ tốt nhất là tương tự đường kính trong của cột tách. Nên điều chỉnh điều kiện này dựa trên nhãn hiệu được sử dụng đối với cột phân tích HPLC pha đảo.

6  Bảo quản và chuẩn bị mẫu

6.1  Quy định chung

CẢNH BÁO: Hầu hết N-nitrosamin có khả năng gây ung thư mạnh và phải thận trọng để tránh phơi nhiễm cho con người.

Tất cả các hoạt động liên quan đến xử lý N-nitrosamin hoặc dung dịch của chúng cần thực hiện trong tủ thông gió thoáng khí thích hợp hoặc hộp găng.

Găng cao su phẫu thuật mà sử dụng thường xuyên, không mang lại sự bảo vệ hoàn toàn. Chúng cần được tháo ra và loại bỏ ngay lập tức sau khi sử dụng và không đi trong thời gian dài.

Sử dụng việc loại bỏ an toàn để loại bỏ bất kỳ dung dịch của vật liệu có chứa các N-nitrosamin (ví dụ như hộp hoặc xô dành cho chất thải hóa chất nguy hại).

N-nitrosodietanolamin phải được bảo quản ở nơi không có ánh sáng trong nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

UV làm thoái hóa các N-nitrosodietanolamin, do vậy tất cả các dung dịch (chuẩn/chiết) phải được bảo quản theo cách sao cho ngăn ngừa việc hư hỏng và thay đổi thành phần.

Phân tích HPLC-MS-MS cần được thực hiện trong vòng 30 min sau khi chuẩn bị mẫu chiết. Nếu phân tích bị trì hoãn, khi đó cần kiểm tra xác nhận tính ổn định.

6.2  Chuẩn bị dung dịch chuẩn

6.2.1  Chuẩn bị chính xác dung dịch gốc (A) của NDELA có chứa khoảng 1,0 mg/mL trong etanol và bảo quản ở nơi không có ánh sáng tại nhiệt độ nhỏ hơn -18 °C. Ghi lại chính xác nồng độ.

6.2.2  Chuẩn bị chính xác dung dịch gốc (d8A) của d8-NDELA có chứa khoảng 1,0 mg/mL trong etanol và bảo quản ở nơi không có ánh sáng tại nhiệt độ nhỏ hơn -18 °C. Ghi lại chính xác nồng độ.

6.2.3  Chuẩn bị dung dịch làm việc (B, C, D, E và F) bằng các pha loãng liên tiếp của dung dịch gốc (A). Tất cả các dung dịch phải được bảo quản ở nơi không có ánh sáng trong nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

CHÚ THÍCH: Người sử dụng có thể xác định thể tích chính xác được sử dụng để chuẩn bị cho đến khi nồng độ cuối cùng được xác định.

6.2.4  Chuẩn bị dung dịch làm việc d8 (d8B và d8C) bằng pha loãng liên tiếp dung dịch gốc (d8A). Tất cả dung dịch phải được bảo quản ở nơi không có ánh sáng trong nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

CHÚ THÍCH: Người sử dụng có thể xác định thể tích chính xác được sử dụng để chuẩn bị cho đến khi nồng độ cuối cùng được xác định.

6.2.5  Chuẩn bị dung dịch chuẩn bằng pha loãng dung dịch làm việc. Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ từ 1,0 ng/mL đến 80,0 ng/mL, sử dụng ít nhất năm trong số bảy dung dịch tiêu chuẩn được đưa ra trong bảng dưới, cần bao gồm dung dịch tiêu chuẩn tương ứng với giới hạn theo yêu cầu của định lượng (hoặc thấp hơn). Chuẩn nội d8-NDELA tại mức 20 ng/mL trong mỗi dung dịch. Tất cả các dung dịch phải được bảo quản ở nơi không có ánh sáng trong khoảng 2 °C và 8 °C.

CHÚ THÍCH 1: Phụ thuộc vào độ nhạy của thiết bị, đường chuẩn hiệu chuẩn và việc chuẩn bị mẫu có thể thay đổi hoặc điều chỉnh để giảm thiểu tác động có thể của nền (xem 6.3.3).

CHÚ THÍCH 2: Người sử dụng có thể xác định thể tích chính xác được sử dụng để chuẩn bị cho đến khi nồng độ cuối cùng được xác định.

6.3  Chuẩn bị mẫu

6.3.1  Làm sạch bằng SPE

Cân chính xác khoảng 1,0 g mẫu (ghi lại khối lượng chính xác), cho 400 µL dung dịch làm việc d8B và điều chỉnh đến 20,0 mL bằng nước. Lắc trong 15 min. Nếu cần, có thể sử dụng thêm bồn siêu âm và/hoặc máy ly tâm trong 10 min một cách cẩn thận. Để tránh tạo thêm nitrosamin, cần giảm thiểu siêu âm.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng lượng mẫu nhỏ hơn và/hoặc thể tích nước ban đầu lớn hơn miễn là có độ nhạy cho phép để điều chỉnh các nền cụ thể và để giảm khả năng xảy ra các vấn đề ức chế ion hóa do các thành phần nền đồng rửa giải. Khi thay đổi thể tích nước, tạo nồng độ chuẩn nội IS phù hợp với cả trong dung dịch chuẩn và trong dung dịch mẫu. Trừ khi tính toán chính xác không thể thực hiện.

Ổn định cột C18 chiết pha rắn bằng 3,0 mL methanol tiếp theo là 3,0 mL nước có tốc độ dòng chảy xấp xỉ 3,0 mL/min. Không để cột bị khô kiệt.

Cho khoảng 5 mL dịch chiết mẫu vào cột C18 chiết pha rắn và loại bỏ khoảng 3 mL dung dịch đầu tiên. Thu khoảng 2 mL dịch chiết tiếp theo (có tốc độ dòng chảy xấp xỉ 3,0 mL/min) vào trong lọ. Nếu cần thiết, chuẩn bị mẫu lặp lại ba lần.

6.3.2  Chuẩn bị mẫu thay thế đối với các mẫu không phân tán trong nước (làm sạch bằng DCM)

Cân chính xác khoảng 0,2 g mẫu (ghi lại khối lượng chính xác) trong ống ly tâm, thêm vào 800 µL dung dịch làm việc d8C và lắc trong 1 min. Thêm 4 mL diclorometan và lắc trong 1 min. Thêm 3.2 mL nước và lắc trong 5 min.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng lượng mẫu nhỏ hơn và/hoặc thể tích nước ban đầu lớn hơn miễn là có độ nhạy cho phép đề điều chỉnh các nền cụ thể và để giảm khả năng xảy ra các vấn đề ức chế ion hóa do các thành phần nền đồng rửa giải. Khi thay đổi thể tích nước, tạo nồng độ chuẩn nội IS phù hợp với cả trong dung dịch chuẩn và trong dung dịch mẫu. Trừ khi tính toán chính xác không thể thực hiện

Ly tâm tại tốc độ cao nhất có thể (lý tưởng 20000 G) trong 5 min. Một phần của lớp nước phía trên được sử dụng cho phân tích sắc ký.

Nếu cần thiết, lọc dung dịch thu gom được qua thiết bị lọc phù hợp:

Nếu cần thiết, chuẩn bị mẫu lặp lại ba lần.

6.3.3  Pha loãng mẫu đâ chuẩn bị và dung dịch chuẩn (tùy chọn)

Cần pha loãng thêm các dịch chiết mẫu và dưng dịch chuẩn (tương ứng) để giảm thiểu tác động tiềm ẩn của các thành phần nền đồng rửa giải có thể ức chế ion hóa NDELA, giới hạn độ nhạy của phương pháp. Pha loãng dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn trong nước được đề xuất, theo độ nhạy trên hệ thống HPLC-MS-MS cụ thể được sử dụng.

6.3.4  Bảo quản mẫu

Nếu cần thiết, mẫu có thể được bảo quản ở nhiệt độ dưới 8 °C, không có ánh sáng.

7  Cách tiến hành

7.1  Tổng quan

Với cả hai loại chuẩn bị mẫu, dịch chiết cuối cùng được phân tích đối với NDELA bằng HPLC-MS-MS.

7.2  Các điều kiện sắc ký

Tỷ lệ pha động (Gradient)

Lưu lượng: 0,4 mL/min

Thể tích bơm: 20 µL

Nhiệt độ lò cột: 30 °C

Bảo quản mẫu: ≤ 8 °C không có ánh sáng (được khuyến nghị)

Bơm phân tích: Mỗi lần bơm phân tích bao gồm ít nhất năm điểm hiệu chuẩn, và ít nhất một mẫu kiểm soát (dung dịch chuẩn) trên mỗi 15 dịch chiết mẫu (đối với một phân tích ít hơn 15 dịch chiết mẫu, bao gồm tối thiểu một mẫu kiểm soát). Cỡ phép phân tích cho phép sẽ bao gồm ít nhất đến 20 dịch chiết mẫu. Các cỡ phân tích lớn hơn có thể miễn là tính đủ ổn định trên khay được xác nhận.

Các điều kiện sắc ký có thể cần được điều chỉnh đối với các nền cụ thể miễn là xác nhận phù hợp (xem ISO 12787).

7.3  Các điều kiện HPLC-MS-MS

Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (electrospray), chế độ ion (+).

Ví dụ về các thông số phù hợp đối với quang phổ kế khối ba cực [như AB Sciex 5500^®3]. Cài đặt nguồn

Cài đặt máy phân tích

Các ion đặc tính 135 (M + H), 104 và 74 (các ion mảnh) nhận dạng sự có mặt của NDELA trong mẫu.

Định lượng NDELA được thực hiện bằng cách sử dụng tỷ lệ của cường độ của hai ion mảnh là 104 (từ NDELA) và 111 [khởi nguồn từ ion 143 (M+H) của d8-NDELA].

8  Tính toán kết quả

8.1  Xác định giá trị R

Đối với mỗi lần bơm (các điểm của đường chuẩn, mẫu thử và mẫu kiểm soát) giá trị R được xác định là tỷ lệ cường độ tín hiệu thu được giữa ion 104 từ NDELA (M+H) và ion 111 từ d8-NDELA (M+H) (xem, ví dụ, Hình A.2).

Những giá trị R này được sử dụng để xác định đường chuẩn và nồng độ, c, như được nêu tại 8.4.

8.2  Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách vẽ biểu đồ nồng độ NDELA trong dung dịch chuẩn (xem 6.2.5) so với giá trị R của chúng.

Đối với định lượng đường chuẩn phải có hệ số tương quan tốt hơn hoặc bằng với 0,990 (xem, ví dụ, Hình A.1).

8.3  Quy trình kiểm tra xác nhận và các tiêu chí

Cường độ liên quan của hai ion được phát hiện (104 và 74) từ dịch chiết mẫu, được biểu thị là tỷ lệ phần trăm của cường độ của ion mạnh nhất, phải tương ứng với các tỷ lệ này của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, tại nồng độ có thể so sánh được, được đo trong cùng các điều kiện, phải đạt trong phạm vi dung sai được liệt kê ở Bảng 1.

Kiểm tra xác nhận đối với mỗi phép đo dịch chiết mẫu mà mang lại nồng độ NDELA trên giới hạn phát hiện (xem tài liệu viện dẫn [1]).

…

f) Ngày thử nghiệm;

g) Các kết quả và đơn vị mà kết quả được biểu thị;

h) Phương pháp làm sạch được sử dụng;

i) Bất kỳ điểm đặc biệt nào quan sát được trong khi thử nghiệm;

j) Bất kỳ thao tác nào không được quy định trong phương pháp hoặc được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả;

k) Nhận dạng và chữ ký của người chịu trách nhiệm đối với báo cáo thử nghiệm.

Phụ lục A

(tham khảo)

Ví dụ về đường chuẩn và sắc ký đồ

CHÚ DẪN:

X nồng độ của NDELA trong dung dịch chuẩn (ng/mL)

Y giá trị R

Hình A.1 – Ví dụ về đường chuẩn đối với NDELA

Hình A.2 – Ví dụ về sắc ký đồ HPLC-MS-MS

Từ phân tích 1,0 ng/mL dung dịch tiêu chuẩn hiệu chuẩn, tương ứng 20 ng/g NDELA tương đương trong nền. Dữ liệu nhận được sử dụng bộ ba AB Sciex 5500, với độ pha loãng gấp 4 lần dịch chiết mẫu trong nước, trước khi phân tích. Trên cùng bên trái: NDELA (lượng hóa SRM); trên cùng bên phải: NDELA (SRM thứ hai); đáy: d8-NDELA (SRM chuẩn nội).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] 2002/657/EC: Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results [notified under document number C (2002) 3044] [Quyết định của Ủy ban ngày 12/8/2002 thực hiện Chỉ thị Hội đồng 96/23/EC liên quan đến thực hiện các phương pháp phân tích và diễn giải các kết quả [được thông báo theo số tài liệu C (2002) 3044]