TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-12:2019 VỀ BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 12:BỆNH VI BẢO TỬ DO ENTEROCYTOZOON HEPATOPENAEI Ở TÔM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-12: 2019

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 12: BỆNH VI BÀO TỬ DO ENTEROCYTOZOON HEPATOPENAEI Ở TÔM

Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part 12: Microsporidiosis caused by Enterocytozoon hepatopenaei in shrimp

Lời nói đầu

TCVN 8710-12: 2019 thay thế TCVN 8710-12:2015

TCVN 8710-12: 2019 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

– TCVN 8710-02: 2019, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở tôm (MBV);

– TCVN 8710-02: 2019, phần 2: Bệnh Hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN);

– TCVN 8710-03: 2019, phần 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm (WSSV);

– TCVN 8710-04: 2019, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm (YHV);

– TCVN 8710-05: 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He (TSV);

– TCVN 8710-06: 2019, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép (KHV);

– TCVN 8710-07: 2019, phần 7; Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (SVC);

– TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

– TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

– TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-12: 2019, phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

– TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

– TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

– TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas ở cá;

– TCVN 8710-16:2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

– TCVN 8710-17:2016, phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

– TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

– TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

– TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá.

 

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 12: BỆNH VI BÀO TỬ DO ENTEROCYTOZOON HEPATOPENAEI Ở TÔM

Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part 12: Microsporidiosis caused by Enterocytozoon hepatopenaei in shrimp

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

Vi bào tử trùng (Microsporidian) là một nhóm các vi bào tử kí sinh nội bào bao gồm Ameson, Agmasonma (Thelohania), Pleitophora, Enterocytozoon hepatopenaei.

Vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP):

Là loại kí sinh trùng có kích thước nhỏ (khoảng 1.1 x 0.7 µm) và cấu tạo phức tạp, có 5-6 vòng xoắn có cấu trúc sợi ở một đầu. EHP ký sinh trong tế bào gan tụy của tôm sử dụng dinh dưỡng, năng lượng dự trữ trong gan tụy, làm tôm nuôi không đủ dinh dưỡng để tăng trường và lột xác.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1  Etanol, từ 96 % đến 100 % (C₂H₆O)

3.1.2  Dung dịch đệm muối phosphat (PBS)

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và Realtime PCR

3.2.1  Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2  Cặp mồi, Dò (Probe)

3.2.3  Kít tách chiết ADN (Xem B1 và B2).

3.2.4  Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit, Cat. No K0171).

3.2.5  Kít nhân gen realtime PCR (Ví dụ: Kit Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017).

3.2.6  Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate – EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate – EDTA) (xem A.1).

3.2.7  Chất nhuộm màu (Ví dụ: Sybr safe).

3.2.8  Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.2.9  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.10  Thang chuẩn ADN (Ladder)

3.2.11  Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.12  Agarose

3.3  Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

3.3.1  Formalin, dung dịch 10 % (thể tích)

Chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) hoặc nước cất (tỷ lệ thể tích 1:9).

3.3.2  Xylen

3.3.3  Dung dịch Davidson (xem A.2).

3.3.4  Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.3)

3.3.5  Thuốc nhuộm Eosin (xem A.4).

3.3.6  Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

3.3.7 Keo dán lamen

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, Realtime PCR

4.1.1  Máy nhân gen PCR

4.1.2  Máy Realtime PCR

4.1.3  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g

4.1.4  Máy lắc trộn vortex

4.1.5  Máy ly tâm nhanh spindown

4.1.6  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.1.7  Máy đọc gel

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

4.2.1  Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể

4.2.2  Máy xử lý mẫu mô tự động

4.2.3  Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.2.4  Khay sắt (loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể).

4.2.5  Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.2.6  Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 µm đến 5 µm.

4.2.7  Nồi dãn tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.2.8  Lam kính

4.2.9  Lamen

4.2.10  Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20X, 40 X và 100 X.

4.2.11  Máy sấy mẫu

4.2.12  Bom Canada

4.2.13  Bút ghi kính

5.2  Bệnh tích

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Dịch tễ học

Bệnh thường xảy ra trên các loài tôm thuộc họ tôm he (Penaeidae) như tôm sú (Penaeus monodon), tôm he (P. merguensis), tôm thẻ chân trắng (P. vannamei), tôm nâu (P. aztecus), P. setiferus…

Một số loài có thể mang trùng như tôm đất, tôm càng xanh, cua, ghẹ, động vật phù du Artemia, Copepoda.

Tôm thường nhiễm bệnh ở giai đoạn rất sớm, từ 10 ngày đến 15 ngày sau khi thả giống và ở các giai đoạn của tôm nuôi

EHP có thể lây nhiễm theo chiều ngang từ tôm bệnh sang tôm khỏe, gián tiếp từ thức ăn tươi sống cho tôm có mang mầm bệnh.

Bệnh có thể xảy ra quanh năm và phân bố ở phần lớn các vùng nuôi tôm ở các nước Châu Á – Thái Bình Dương.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Tôm bị bệnh kém ăn, hoạt động chậm chạp, chậm lớn, còi cọc, phân đàn, chết rải rác trong quát trình nuôi.

Khi tôm thẻ chân trắng giống bị nhiễm EHP thả nuôi trong tháng đầu tiên, tôm vẫn phát triển tương đối bình thường nhưng sau khi đạt trọng lượng khoảng 3-4 g/con cũng như lượng sinh khối trong ao tăng dần thì tôm bắt đầu chậm lớn dần và dừng hẳn sự tăng trưởng. Tôm nuôi 90- 100 ngày tuổi cũng chỉ đạt trọng lượng 4-5 g/con.

Xuất hiện các sợi phân trắng hoặc vàng nâu tại nhá hoặc nổi trên mặt ao và dồn vào góc ao hoặc cuối hướng gió.

Gan tụy chuyển màu nhạt

5.3  Bệnh tích

Tôm bị bệnh nặng gan tụy bị hoại tử (dịch hóa).

Tôm bị bệnh nhẹ bệnh tích không rõ ràng.

Trên các lát cắt mô học cho thấy sự chiếm chỗ của các vi bào tử trong mô của khối gan tụy.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

6.1.1  Lấy mẫu

Số lượng tôm trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ của tôm:

– Giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng: 100 mg

– Tôm trưởng thành, tôm bố mẹ: lấy từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu.

Chú ý: Lấy tôm còn sống, sắp chết hoặc mới chết có biểu hiện bệnh lý.

6.1.2  Bảo quản mẫu

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong Etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1).

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong Etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1).

6.1.3  Chuẩn bị mẫu

Đối với tôm ấu trùng, hậu ấu trùng: sử dụng nguyên con.

Đối với tôm bố mẹ, tôm thương phẩm: cắt lấy khối gan tụy.

Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg.

Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm phosphat PBS (3.1.2), để tạo thành huyễn dịch 10 %. Mẫu được chia thành hai phần: một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ ở tủ âm (-80 °C).

6.1.4  Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Qiagen, Cat No. 69506)[1]⁾ (xem phụ lục B).

6.1.5  Cách tiến hành

6.1.5.1  Chuẩn bị mồi

Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi EHP-510F/ EHP-510R (3.2.1) để phát hiện vi bào tử trùng do Enterocytozoon hepatopenaei. Trình tự cặp mồi (xem Bảng C.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (20 µl mồi gốc và 80 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.1.5.2  Tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy PCR (4.1.1) theo phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.1) sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C).

6.1.5.3  Điện di

6.1.5.3.1  Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ Agarose (3.2.12) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.6) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 pl chất nhuộm màu (3.2.7) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.6) cùng loại với dung dịch pha thạch Agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch Agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain[2]⁾) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.5.3.2  Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.8) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 25 min.

6.1.5.3.3  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

– Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

– Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 510 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Kết quả mẫu thử dương tính khi:

– Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 510 bp.

– Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi:

– Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.

– Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng

6.2  Phương pháp Realtime PCR

6.2.1  Lấy mẫu (Theo 6.1.1)

6.2.2  Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)

6.2.3  Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)

6.2.4  Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít tách chiết ADN: DNeasy^®Blood & Tissue Kit (250) (Qiagen, Cat No. 69506)[3]⁾ (xem phụ lục B).

6.2.5  Chuẩn bị mồi và mẫu đối chứng

Phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi EHP-F157, EHP-R157, đoạn dò Probe 157 (3.2.2) để phát hiện vi bào tử trùng do Enterocytozoon hepatopenaei. Trình tự cặp mồi và đoạn dò (xem Bảng D.4).

Mồi được chuẩn bị như sau:

Mồi và đoạn dò (Probe) ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi và đoạn dò (Probe) được sử dụng ở nồng độ 10 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.2.6  Tiến hành phản ứng Realtime PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi, đoạn dò (3.2.1 và 3.2.2) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, (xem phụ lục D).

6.2.7  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

– Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct);

– Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ± 2.

Với điều kiện phản ứng như trên:

– Mẫu dương tính khi có giá trị Ct < 35

– Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

– Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ

CHÚ Ý:

– Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

– Phản ứng realtime – PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

– Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.3  Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

6.3.1  Lấy mẫu

Tôm ấu trùng, hậu ấu trùng sử dụng nguyên con. Tôm bố mẹ, tôm thương phẩm lấy nguyên con hoặc bộ phận đầu ngực có chứa khối gan tụy (< 1 cm³). Cố định mẫu trong dung dịch Davidson (3.3.3) ngay sau khi lấy mẫu với tỷ lệ mẫu và dung dịch Davidson là 1: 10.

6.3.2  Bảo quản mẫu

Mẫu cố định trong Davidson (3.3.3) chuyển đến phòng thí nghiệm trong khoảng từ 24 h đến 72 h sau khi lấy mẫu

6.3.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu cố định trong Davidson (3.3.3) khoảng từ 24 đến 72 h.

Mẫu được chuyển sang cồn 70°C

Lấy bệnh phẩm đã cố định trong cồn hoặc Davidson cắt miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa (4.2.1).

6.3.4  Cách tiến hành

Tiến hành xử lý mẫu, cắt tiêu bản và nhuộm tiêu bản tiêu bản Haematoxylin và Eosin theo hướng dẫn (xem phụ lục E).

6.3.5  Đọc kết quả

Mẫu dương tính khi thấy trong nguyên sinh chất của tế bào biểu mô ống gan thận có các thể vùi bắt mầu kiềm (basophilic) chứa các đám bào tử hình trứng hay ellip kích thước 1,1 ± 0,2 x 0,6 ± 0,1 µm.

Các bào tử EHP có thể phát hiện trong ống gan tụy ở trạng thái tự do.

7  Kết luận

Mẫu tôm được xác định nhiễm bệnh vi bào tử do EHP khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh vi bào tử và:

– Có kết quả dương tính với Enterocytozoon hepatopenaei bằng phương pháp PCR hoặc;

– Có kết quả dương tính với Enterocytozoon hepatopenaei bằng phương pháp realtime PCR hoặc;

– Phát hiện được các bào tử Enterocytozoon hepatopanaei khi kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch Davidson

A.2.1  Thành phần

Etanol (95%); 330 ml

Formalin: 220 ml

(dung dịch nước bão hòa khí formaldehyde là dung dịch từ 36 % đến 38 %)

Axit acetic: 115 ml

Nước cất: 355 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan axit acetic, formalin và etanol trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.3  Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin – Mayer)

A.3.1 Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể: 4g

Natri iodat: 0,8 g

Amoni alum sulphate [NH₄Al(SO₄)₂]: 100 g

(hoặc Postasium alum sulphate [KAl(SO₄)₂])

Axit citric: 4g

Cloral hydrat: 200 g

Nước: 2000 ml

A.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni nhôm Sulfat hoặc kali nhôm Sulfat, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4  Thuốc nhuộm Eosin

A.4.1  Thành phần

Eosin Y: 10 g

Etanol 70 %: 1 lít

Axit axetic: 5 ml

A.4.2  Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hoà tan eosin trong etanol, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu.

A.5  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.5.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)                                                 8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na₂HPO₄.2H₂O)        2,9 g

Kali dihydro photphat (KH₂PO₄)                              0,2 g

Kali clorua (KCl)                                                    0,2 g

Nước cất                                                              1000 ml

A.5.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B1. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250)

Nhỏ 20 µl proteinase K vào ống ly tâm 1,5 ml.

– Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống ly tâm đã có proteinase K.

– Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer).

– Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).

– Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).

– Thêm 200 µl etanol (từ 96 % đến 100 %) (3.1.1) vào ống ly tâm.

– Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5).

– Hút 420 µl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới.

– Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.

– Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới.

– Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.

– Thay ống thu ở dưới cột ly tâm.

– Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới.

– Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng.

– Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml.

– Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min.

– Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min.

– Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện ký sinh trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây bệnh trên tôm.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp PCR phát hiện EHP

C.1  Trình tự cặp mồi

Bảng C.1 – Trình tự cặp mồi ^[6]

Tên mồi	Trình tự cặp mồi	Kích thước sản phẩm, bp
EHP-510F	5’GCCTGAGAGATGGCTCCCACG-3’	510
EHP-510R	5-GCGTACTATCCCCAGAGCCCG-3’

C.2  Thực hiện phản ứng PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi (3.2.1) đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)[4]⁾

Bảng C.2 – Thành phần cho 1 phản ứng

Thành phần	Nồng độ gốc	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/ADN		6,5
PCR Master Mix (2X)		12,5
Mồi EHP 510 F	20 µM	0,5
Mồi EHP 510 R	20 µM	0,5
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng		20

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với EHP.

Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) theo chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Bảng C.3 – Chu kỳ luân nhiệt đối với máy PCR

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
95	3 min	01
95	30 s	35
60	30 s
72	30 s
72	5 min
Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

CHÚ THÍCH:

– Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

– Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng.

 

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp Realtime PCR phát hiện EHP

D.1  Trình tự cặp mồi

Bảng D.1 – Trình tự cặp mồi và đoạn dò^[4]

Tên mồi	Trình tự	Kích thước sản phẩm, bp
EHP-F157	5′-AGT AAA CTA TGC CGA CAA-3′	157
EHP-R157	5-AAT TAA GCA GCA CAA TCC-3′
Probe 157	5′-FAM-TCC TGG TAG TGT CCT TCC GT-TAMRA-3′

D.2  Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu EHP-F157, EHP-R157, Probe 157 đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Platinum^® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017[5]⁾

Bảng D.2 – Thành phần của phản ứng realtime PCR

Thành phần	Nồng độ gốc	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có RNA/ADN		6
Dung dịch 2X reaction mix		12,5
Mồi EHP 157 F	10 µM	1
Mồi EHP 157 R	10 µM	1
Probe 157	10 µM	0,5
Tổng thể tích		21

Chuyển 21 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 4 µl mẫu ADN được tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với EHP

Mẫu đối chứng âm: Cho 4 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 4 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.2) theo chu trình nhiệt trong Bảng 6.

Bảng 6 – Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
50	02 min	01
95	02 min	01
95	15 s	40
60 (*)	30 s

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy realtime PCR ABI 7500

 

Phụ lục E

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

E.1  Xử lý mẫu

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 95 % (3.1.1) trong thời gian 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 60 min.

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ nhất trong thời gian từ 60 đến 90 min.

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ 60 đến 90 min.

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ nhất trong thời gian 90 min.

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ hai, thời gian từ 120 min.

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2).

Đúc khuôn

Đưa mẫu vào khung đúc parafin: Rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4) chuyên dụng.

Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên.

Để nguội, tách lấy khối parafin.

E.2  Cắt tiêu bản

Cắt gọt khối parafin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5).

Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức.

Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C.

Dùng lam kính (4.2.8) vớt những lát cắt bằng phẳng, chuyển sang máy sấy ở 40°c trong 2 đến 3 h.

E.3  Nhuộm tiêu bản

Tẩy parafin trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 100 % (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 95 % (3.1.1) để từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong etanol 70 % (3.1.1) để từ 3 đến 5 min.

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin (3.3.4) từ 3 đến 5 min.

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm từ Eosin (3.3.5) từ 3 đến 5 min.

Nhúng qua etanol 70 % (3.1.1) để từ 2 đến 3 min; sau đó nhúng qua etanol 100 % (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 đến 3 min; lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.2.9) bằng keo dán.

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.10).

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004, Bệnh học thủy sản, NXB Nông nghiệp.

[2] Diseases of Crustaceans – Hepatopancreatic microsporidiosis caused by Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), Disease Card EHP – OIE 2015.

[3] Luis FernandoArangurenJee EunHanKathy F.J.Tang. Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and septic hepatopancreatic necrosis (SHPN) in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei Aquaculture Volume 471, 20 March 2017, Pages 37-42

[4] Liu YM¹, Qiu L¹, Sheng AZ², Wan XY², Cheng DY¹, Huang J³. Quantitative detection method of Enterocytozoon hepatopenaei using TaqMan probe real-time PCR. J Invertebr Pathol. 2018 Jan;151:191-196.

[5] Somjintana Tourtip, Somjai Wongtripop, Grant D. Stentiford, Kelly S. Bateman, Siriporn Sriurairatana, Jittipan Chavadej, Kallaya Sritunyalucksana, Boonsirm WithyachumnADNkul. September 2009. Enterocytozoon hepatopenaei sp. nov. (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon (Decapoda: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic relationships. J Invertebr Pathol. 2009 Sep;102(1):21-9

[6] Tang KF¹, Pantoja CR², Redman RM², Han JE², Tran LH³, Lightner DV Development of in situ hybridization and PCR assays for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), a microsporidian parasite infecting penaeid shrimp.J Invertebr Pathol. 2015 Sep; 130:37-41.

[7] Tangprasittipap A¹, Srisala J, Chouwdee s, Somboon M, Chuchird N, Limsuwan C, Srisuvan T, Flegel TW, Sritunyalucksana K. The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. BMC Vet Res. 2013 Jul 15;9:139. doi: 10.1186/1746-6148-9-139.

[8] Tiêu chuẩn cơ sở TCCS 03: 2016/TY-TS Quy trình phát hiện vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây bệnh ở tôm.

[9] TCVN 8710 -12: 2015 Quy trình chẩn đoán bệnh Vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm.

[10] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn – Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

---