TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-46:2019 VỀ BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHUẨN ĐOÁN – PHẦN 46: BỆNH DẠI

Hiệu lực: Còn hiệu lực

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-46: 2019

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 46: BỆNH DẠI

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 46: Rabies

Lời nói đầu

TCVN 8400-46: 2019 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

– TCVN 8400-1: 2019, phần 1: Bệnh Lở mồm long móng;

– TCVN 8400-2: 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

– TCVN 8400-3: 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

– TCVN 8400-4: 2010, phần 4: Bệnh Nui cát xơn;

– TCVN 8400-5: 2011, phần 5: Bệnh Tiên mao trùng;

– TCVN 8400-6: 2011, phần 6: Bệnh Xuất huyết thỏ;

– TCVN 8400-7: 2011, phần 7: Bệnh Đậu cừu và đậu dê;

– TCVN 8400-8: 2011, phần 8: Bệnh Nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

– TCVN 8400-9: 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

– TCVN 8400-10: 2011, phần 10: Bệnh Lao bò;

– TCVN 8400-11: 2019 phần 11: Bệnh Dịch tả vịt;

– TCVN 8400-12: 2011, phần 12: Bệnh Bạch lỵ và thương hàn ở gà;

– TCVN 8400-13: 2019, phần 13: Bệnh Sảy thai truyền nhiễm do Brucela;

– TCVN 8400-14: 2011, phần 14: Bệnh Tụ huyết trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-15: 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

– TCVN 8400-16: 2011, phần 16: Bệnh Phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

– TCVN 8400-17: 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

– TCVN 8400-18: 2014, phần 18: Bệnh Phù đầu gà (coryza);

– TCVN 8400-19: 2014, phần 19: Bệnh Phó thương hàn lợn;

– TCVN 8400-20: 2014, phần 20: Bệnh Đóng dấu lợn;

– TCVN 8400-21: 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

– TCVN 8400-22: 2014 phần 22: Bệnh Giả dại ở lợn;

– TCVN 8400-23: 2014, phần 23: Bệnh Ung khí thán;

– TCVN 8400-24: 2014, phần 24: Bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm;

– TCVN 8400-25: 2014, phần 25: Bệnh Cúm lợn;

– TCVN 8400-26: 2014, phần 26: Bệnh Cúm gia cầm H5N1;

– TCVN 8400-27: 2014, phần 27: Bệnh Sán lá gan;

– TCVN 8400-28: 2014, phần 28: Bệnh Viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

– TCVN 8400-29: 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

– TCVN 8400-30: 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

– TCVN 8400-31: 2015, phần 31: Bệnh Tụ huyết trùng gia cầm;

– TCVN 8400-32: 2015, phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm;

– TCVN 8400-33: 2015, phần 33: Bệnh Lê dạng trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-34: 2015, phần 34: Bệnh Biên trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-35: 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

– TCVN 8400-36: 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

– TCVN 8400-37: 2015, phần 37: Bệnh Viêm phổi địa phương ở lợn;

– TCVN 8400-38: 2015, phần 38: Bệnh Tiêu chảy ở lợn do Corona virus;

– TC VN 8400-39: 2016, phần 39: Bệnh Viêm đường hô hấp mãn tính ở gà và gà tây;

– TCVN 8400-40: 2016, phần 40: Bệnh Nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Reimerella anatipestifer gây ra;

– TCVN 8400-41: 2019, phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

– TCVN 8400-42: 2019, phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại;

– TCVN 8400-43: 2019, phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

– TCVN 8400-44: 2019, phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

– TCVN 8400-45: 2019, phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

– TCVN 8400-46: 2019, phần 46: Bệnh Dại;

– TCVN 8400-47: 2019, phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 46: BỆNH DẠI

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 46: Rabies

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này.

– Nhân viên, cán bộ làm việc với vi rút dại, vi rút liên quan đến bệnh Dại và các vi rút lyssavirus khác phải được tham gia các khóa tập huấn làm quen với các phần liên quan của Hướng dẫn An toàn và An ninh Vi sinh vật, cụ thể là “Thực hành Hoạt động Tiêu chuẩn: An toàn sinh học cấp 3”

– Các cán bộ, nhân viên tham gia chẩn đoán vi rút Dại cần được tiêm phòng vắc xin phòng bệnh Dại và kháng thể kháng vi rút Dại phải đạt hiệu giá thấp nhất từ 0,5 IU/ml trở lên và được định kỳ kiểm tra kháng thể kháng vi rút Dại 6 tháng 1 lần.

– Các trang thiết bị bảo hộ cá nhân phải được đảm bảo như quần áo, khẩu trang, găng tay, mũ, ủng, tạp dề.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh trên động vật do vi rút Dại gây ra.

2 Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

2.1 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

– Bệnh Dại là bệnh truyền nhiễm do vi rút dại (rabies virus) gây nên. Đây là bệnh truyền nhiễm virus cấp tính của hệ thần kinh trung ương dẫn đến tử vong, Bệnh Dại có thể gặp ở tất cả động vật máu nóng và lây truyền cho người chủ yếu thông qua các chết bài tiết có nhiễm vi rút Dại từ vết cắn, vết liếm của động vật mắc bệnh Dại. Bệnh Dại thuộc bệnh truyền nhiễm nhóm B trong Luật Phòng chống bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam

– Vi rút Dại: Vi rút Dại thuộc họ Rhabdoviridae, giống Lyssavirus, có vật liệu di truyền là ARN, vỏ ngoài là lipid. Đây là vi rút hướng thần kinh, gây viêm não tủy cấp tính.

2.2 Từ viết tắt

– BHK-21 (Baby hamster kidney): Tế bào thận chuột đất vàng sơ sinh.

– CPE (Cytopathic effect): Biến đổi bệnh lý tế bào.

– CVS11: Chủng vi rút thử thách dùng trong phản ứng trung hòa vi rút – kháng thể gắn huỳnh quang.

– EDTA (Ethylene diamine tetra-acetic acid): Chất tạo phức EDTA.

– ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay): Phương pháp miễn dịch liên kết enzyme.

– DFAT (Direct Flourescent antibody test): Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp.

– DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium): Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM.

– FAVN test (Fluoresbody antibody virus neutralisation test): Phương pháp trung hòa vi rút – kháng thể gắn huỳnh quang.

– FITC (Fluorescence Iso Thio Cyanate): Kháng thể đơn dòng kháng vi rút Dại gắn FITC.

– FCS (Fetal calf serum): Huyết thanh bào thai bê.

– FITC (Fluorescence Iso Thio Cyanate): Kháng thể đơn dòng kháng vi rút Dại gắn FITC.

– PBS (Photphate Buffered Salin): Dung dịch đệm.

– rRT-PCR (Real-time reverse transcription polymerase chain reaction): Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase sao chép ngược thời gian thực.

– TCID₅₀ (Tissue culture infective dose – 50): Liều gây nhiễm 50 % tế bào.

– D₅₀ (Median dose – 50): Liều trung bình gây nhiễm 50 % tế bào.

– ED₅₀ (Infective dose – 50): liều gây nhiễm hiệu quả 50 %.

3 Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

3.1 Nguyên liệu sử dụng chung

3.1.1 Etanol, từ 70 % (thể tích) đến etanol tuyệt đối.

3.1.2 Dung dịch đệm PBS (Photphate Buffered Salin), pH 7,2 – 7,4 (xem A3 phụ lục A).

3.1.3 Dung dịch kháng sinh, bao gồm các loại penicillin, kanamycin, streptomycin (xem A1 phụ lục A).

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp – DFAT (Direct Flourescent antibody test) và phương pháp trung hòa kháng thể – vi rút gắn huỳnh quang – FAVN (Fluoresbody antibody virus neutralisation test)

3.2.1 Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) (xem A4 phụ lục A).

3.2.2 Dung dịch Trypsin 0,05 % EDTA (Ethylene diamine tetra-acetic acid).

3.2.3 Huyết thanh bào thai bê – FCS (Fetal calf serum).

3.2.4 Acetone, 80 % (thể tích).

3.2.5 Dung dịch Evan’s Blue 1 %, ví dụ: Evans Blue 0589-0, Koch -Light Laboratories Ltd. England.

3.2.6 Kháng thể đơn dòng kháng vi rút Dại gắn FITC (Fluorescence Iso Thio Cyanate), ví dụ FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin, Fujirebio Diagnostics, Inc., Malvern, PA 19355. REF 800-092.

3.2.7 Dung dịch NaOH 1M.

3.2.8 Dung dịch HCl 1M.

3.2.9 Mouting medium.

3.2.10 Tế bào BHK – 21 (Baby hamster kidney – 21): Tế bào thận chuột đất vàng sơ sinh.

3.2.11 Chủng vi rút chuẩn CVS11.

3.2.12 Huyết thanh dương chuẩn.

3.2.13 Huyết thanh âm chuẩn.

3.2.14 Dung dịch PBS.

3.3 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime RT-PCR (realtime Reverse transcription polymerase chain reaction)

3.3.1 Kít chiết tách RNA, ví dụ: Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep (xem phụ lục B).

3.3.2 Kít nhân gen, ví dụ: Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020 (xem bảng C2 và C5 phụ lục C).

3.3.3 Mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò (xem phụ lục C).

3.3.4 Nước tinh khiết, không có nuclease.

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ, máy móc và vật tư của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

4.1 Trang thiết bị, dụng cụ máy móc dùng chung

4.1.1 Pipet, có đầu ống các cỡ 30 µl, 200 µl và 1 000 µl.

4.1.2 Đầu tuýp các loại.

4.1.3 Xi lanh, dung tích 1 ml, 5 ml.

4.1.4 Ống ly tâm, dung tích 15 ml, 50 ml.

4.1.5 Dụng cụ bảo hộ: khẩu trang, găng tay, áo bảo hộ, kính, ủng.

4.1.6 Túi đựng rác thải.

4.1.7 Tủ an toàn sinh học cấp 2, 3.

4.1.8 Nồi hấp ướt.

4.1.9 Lò đốt.

4.1.10 Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ – 20 °C đến – 80 °C.

4.1.11 Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.2 Trang thiết bị, dụng cụ máy móc dùng cho phương pháp DFA

4.2.1 Lam kính.

4.2.2 Lamen.

4.2.3 Kính hiển vi huỳnh quang.

4.3 Trang thiết bị, dụng cụ máy móc dùng cho phương pháp FAVN.

4.3.1 Đĩa nuôi tế bào 96 giếng.

4.3.2 Chai nuôi tế bào T75.

4.3.3 Chai nuôi tế bào T25.

4.3.4 Đĩa 96 giếng đáy tròn pha môi trường.

4.3.5 Kính hiển vi lộn ngược.

4.3.6 Kính hiển vi thường.

4.3.7 Buồng đếm tế bào.

4.3.8 Tủ ấm có chứa 5% CO₂, duy trì được ở 37 °C.

4.4 Trang thiết bị, dụng cụ máy móc dùng cho phương pháp reatime RT-PCR.

4.4.1 Ống nghiền mẫu.

4.4.2 Máy ly tâm lạnh, có thể thực hiện ở 1 500 g đến 2 500 g, 10 000 g và 12 000 g.

4.4.3 Máy lắc ống (vortex mixer).

4.4.4 Máy realtime PCR.

4.4.5 Máy ủ nhiệt.

5 Chẩn đoán lâm sàng

5.1 Dịch tễ học

Các loài động vật có vú đều cảm nhiễm với vi rút Dại ở mức độ khác nhau. Tính cảm nhiễm cao nhất ở chó, mèo, cáo, chồn, dơi tiếp đến là trâu, bò, lợn, khỉ, gấu, chuột. Người cũng cảm nhiễm cao với vi rút Dại và sẽ có kháng thể chủ động chống lại vi rút Dại nếu được tiêm vắc-xin phòng bệnh Dại.

Hay còn gọi là thể dại lặng (thể dại câm). Con vật không có các biểu hiện lên cơn cuồng nộ. Trong giai đoạn kích thích con vật không có các biểu hiện rõ ràng mà chủ yếu là các triệu chứng liệt.

5.2.2 Bệnh Dại ở mèo

Mèo bị bệnh ít hơn chó. Khi bị bệnh thường buồn bã, tìm chỗ kín đáo để nằm, hoặc kêu nhiều, bứt rứt, nếu sờ vào lập tức bị cắn, sau đó bệnh nhanh chóng chuyển sang thể bại liệt và chết.

5.2.3 Bệnh Dại ở trâu bò

Trâu bò thường hung dữ đứng không yên, mắt nhìn trừng trừng, húc vào bất cứ vật gì hoặc người lại gần, sau đó chuyển sang thể bại liệt và chết.

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

6.1.1 Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên

Sơ đồ chẩn đoán bệnh Dại (xem Phụ lục D): Tất cả các thao tác liên quan đến việc chẩn đoán bệnh Dại như xử lý mẫu, chiết tách ARN, phân lập vi rút Dại trong tiêu chuẩn này phải được tiến hành trong tủ an toàn sinh học cấp 2 (BSC-2) (4.1.7) trở lên, tại phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3). Chỉ sau khi vi rút được bất hoạt hoặc thao tác với chủng CVS mới thực hiện tiếp các phương pháp tại phòng an toàn sinh học cấp 2 (BSL- 2).

Tại các cơ sở chưa đạt yêu cầu chẩn đoán bệnh Dại, muốn xét nghiệm kháng nguyên bệnh Dại thì lấy mẫu đầu của động vật nghi mắc bệnh Dại gửi đến cơ sở đạt yêu cầu chẩn đoán bệnh Dại để xét nghiệm.

Tại các cơ sở đạt yêu cầu chẩn đoán bệnh Dại, mẫu bệnh phẩm xét nghiệm bệnh Dại là mẫu đầu hoặc 3-5 gram mẫu mô não (sừng ammon, thân não, đồi thị, vỏ não) của con vật nghi mắc bệnh Dại.

Mẫu bệnh phẩm phải bao gói cẩn thận tránh lây lan, bảo quản ở nhiệt độ âm sâu (4.1.10) hoặc ít nhất từ 2°C đến 8 °C (4.1.11) và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 h.

CHÚ Ý:

– Tất cả các mẫu phải được dán nhãn và kèm theo các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích (nếu mổ khám).

– Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm mẫu ngay thì mẫu xét nghiệm kháng nguyên phải được bảo quản trong tủ -80 °C (4.1.10)

– Mẫu ban đầu và rác thải xuất hiện trong quá trình chẩn đoán bệnh Dại phải được phân loại, tiến hành hấp tiệt trùng và cho vào thùng rác y tế.

6.1.2 Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể: sử dụng xi lanh 5 ml (4.1.3) để lấy 1 ml máu, rút cán xi lanh tới mức cao nhất để tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt xi lanh nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 °C đến 30 °C trong thời gian 30 phút để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh. Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm.

Bệnh Dại lưu hành ở trên 150 nước trên thế giới với 3,3 tỷ dân sinh sống tại các vùng dịch lưu hành, chủ yếu ở các nước thuộc khu vực châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hằng năm có khoảng 60 000 người chết vì bệnh Dại (99 % người chết này là do lây truyền vi rút Dại từ chó) và 15 triệu người bị phơi nhiễm vi rút Dại phải đi điều trị dự phòng.

Bệnh Dại có 2 thể lâm sàng:

– Thể dại điên cuồng

– Thể dại bại liệt (hay thể dại câm)

5.2 Triệu chứng lâm sàng

5.2.1 Bệnh Dại ở chó

a) Thể dại điên cuồng

Giai đoạn ủ bệnh: thông thường từ 2 đến 3 tuần (chiếm 98 % các trường hợp), tối đa là 6 tháng, giai đoạn này không có các biểu hiện lâm sàng.

Giai đoạn tiền triệu hoặc khởi phát: rất khó phát hiện, chó có các biểu hiện khác thường, chủ yếu thay đổi về tính nết như trốn vào một góc tối, biểu hiện vui mừng hơn bình thường, thỉnh thoảng cắn, sủa vu vơ lên không khí (đớp mồi), vẻ bồn chồn.

Giai đoạn kích thích:

– Biểu hiện chính của thời kỳ này là các phản xạ thông thường của chó bị kích thích mạnh như: đang ngồi dưới đất bỗng đứng dậy, nhảy lên, thấy người lạ xông ra cắn sủa dữ dội, chó có phản ứng quá mức đối với tiếng động và ánh sáng.

– Chó bỏ ăn, nuốt khó khăn, phải vươn cổ ra để nuốt, cắn các vật lạ, khát nước, uống liên tục nhưng chỉ uống được ít.

– Chó bắt đầu chảy nước dãi, sùi bọt mép.

Sau khi phát bệnh 2 đến 3 ngày:

– Con vật có biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh Dại: mắt đỏ ngầu, hai tai dựng ngược, mồm há hốc ra, hàm dưới trễ hẳn xuống, nước dãi chảy thành dòng, bụng thóp lại.

– Tiếng sủa đặc trưng: dây thần kinh họng bắt đầu bị liệt, chó phát ra tiếng hú nghe như thiếu hơi, xa xôi.

Giai đoạn bại liệt:

– Con vật bị liệt mặt không ăn và nuốt được, nước bọt chảy ra nhiều, hàm dưới trễ hẳn xuống, sau đó liệt các cơ vận động và chết do liệt hô hấp hoặc vì kiệt sức do sự vận động của cơn Dại và không ăn uống gì.

b) Thể dại bại liệt

Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2°C đến 8 °C (4.1.11) và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 h.

CHÚ Ý:

– Tất cả các mẫu phải được dán nhãn và kèm theo các thông tin dịch tễ đầy đủ.

– Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm ngay thì mẫu phải được bảo quản ở tủ – 20 °C (4.1.10).

– Mẫu ban đầu và rác thải xuất hiện trong quá trình chẩn đoán bệnh Dại phải được phân loại (4.1.6), tiến hành hấp tiệt trùng (4.1.8) và cho vào thùng rác y tế.

6.2 Phát hiện kháng nguyên

6.2.1 Xử lý mẫu

Mẫu bệnh phẩm là đầu con vật nghi mắc bệnh dại: dùng dao, kìm, kéo tách hộp sọ để bộc lộ bộ não, sau đó dùng panh và kéo lấy 3 – 5 gram bệnh phẩm mẫu não (sừng ammon, thân não, đồi thị, vỏ não) cho vào ống ly tâm 50 ml (4.1.4) bảo quản ở nhiệt độ âm sâu để tiến hành các xét nghiệm chẩn đoán bệnh Dại.

6.2.2 Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp – DFAT (Direct Fluorescent Antibody Test)

6.2.2.1 Chuẩn bị tiêu bản

Tiêu bản có thể được chuẩn bị từ mẫu não tươi vừa mổ hoặc mẫu não được bảo quản nhiệt độ âm.

Dùng bút chì ký hiệu mẫu lên lam kính (4.2.1) gồm mã phòng thí nghiệm của mẫu, ngày chuẩn bị, loại mô não.

Cắt mô não ở các phần: Đại não, tiểu não, cuống não, sừng amon thành miếng nhỏ, kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm².

Áp lam kính vào mẫu hoặc miết 2 lam kính vào nhau để não dính vào tạo thành 1 lớp mỏng. Mỗi một mẫu chuẩn bị 4 tiêu bản ứng với 4 vị trí đại não, tiểu não, cuống não và sừng ammon.

Để tiêu bản khô tự nhiên rồi chuyển vào ống chứa Acetone lạnh ở – 20 °C (3.2.4) giữ trong 2 h đến 4 h để cố định mẫu.

Đồng thời tiêu bản mẫu đối chứng dương và âm cũng được ngâm trong ống chứa Acetone lạnh ở – 20 °C (3.2.4) trong 2 h đến 4 h để cố định mẫu.

6.2.2.2 Nhuộm huỳnh quang

Lấy 1 tiêu bản đối chứng dương và 1 tiêu bản đối chứng âm (đã chuẩn bị và cố định Acetone). Lấy tiêu bản mẫu cần xét nghiệm ra khỏi ống. Tiêu bản được để khô tự nhiên (khoảng 10 min ở nhiệt độ phòng).

Pha kháng thể huỳnh quang (3.2.6) (theo hướng dẫn về tỷ lệ của từng lô) trong PBS (3.2.14) và Evan’s Blue 1 % (3.2.5).

Nhỏ kháng thể huỳnh quang phủ lên bề mặt diện tích mẫu não đã được cố định trên tiêu bản, mỗi tiêu bản nhỏ 60 – 100 µl.

Ủ tiêu bản trong hộp ẩm ở buồng tối, nhiệt độ 37 °C trong 30 min hoặc nhiệt độ phòng 45 min.

Sau khi ủ, đổ bỏ kháng thể, rửa tiêu bản 2 lần với PBS, mỗi lần trong 5 min.

Để tiêu bản khô tự nhiên (khoảng 10 min ở nhiệt độ phòng), nhỏ dung dịch Mouting medium (3.2.9) và đậy coverslip (la men) (4.2.2) lên tiêu bản.

6.2.2.3 Đọc kết quả

Đọc tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang (4.2.3), bước sóng 450 nm.

Điều kiện phản ứng được công nhận: Đối chứng dương tính có hạt phát huỳnh quang màu xanh lá mạ trong bào tương tế bào. Đối chứng âm tính không thấy hiện tượng phát huỳnh quang.

Với điều kiện như trên:

1) Mẫu được coi là dương tính khi hiện tượng phát huỳnh quang như đối chứng dương.

2) Mẫu được coi là âm tính nếu không có hiện tượng phát huỳnh quang như đối chứng âm.

6.2.3 Phương pháp realtime RT-PCR

6.2.3.1 Chuẩn bị mẫu

Nghiền 1 gram bệnh phẩm mẫu não trong ống nghiền mẫu (4.4.1) với dung dịch PBS pH 7,2 (3.2.14) theo tỉ lệ 1:10.

Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc (xem A1 phụ lục A), chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm ở gia tốc 8000 g trong 15 min (4.4.2).

Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào 2 ống 1,5 ml. Một ống dùng cho các xét nghiệm realtime RT-PCR (rRT-PCR), ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ – 80 °C (4.1.10).

6.2.3.2 Cách tiến hành

Chiết tách ARN

Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ARN từ các dịch bệnh phẩm bằng kít thương mại (3.3.1) (xem phụ lục B). ARN thu được sau quá trình chiết tách dùng làm mẫu xét nghiệm.

Tiến hành phản ứng

Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện vi rút Dại trên cơ sở phát hiện gen N được thực hiện như sau:

– Lựa chọn mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR: cần tham khảo các báo cáo giám sát để biết để lựa chọn mồi và mẫu dò phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành. Các bộ mồi và mẫu dò để phát hiện các chủng vi rút Dại lưu hành được nêu trong Bảng C.1 và C.4 phụ lục C.

– Chuẩn bị mồi như trích dẫn trong phụ lục C với nước sạch không chứa DNase/Rnase (3.3.4).

– Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút Dại theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng (xem Phụ lục C).

Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) có giá trị Ct ≤ 25, (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct.

Với điều kiện như trên:

1) Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính.

2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính.

3) Mẫu có giá trị 35< Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp tương đương khác (phân lập vi rút hoặc DFAT) để khẳng định kết quả.

6.3 Phát hiện kháng thể

6.3.1 Phương pháp trung hòa kháng thể – vi rút gắn huỳnh quang – FAVN (Fluoresbody antibody virus neutralisation test)

Ứng dụng chính của huyết thanh học đối với bệnh Dại cổ điển để xác định đáp ứng sau tiêm phòng hoặc đối với động vật trước khi xuất khẩu, chuyển đi nước ngoài.

6.3.1.1 Nguyên lý

Nguyên lý của kỹ thuật là huyết thanh được pha loãng ở các nồng độ khác nhau sau đó trung hòa với 1 lượng vi rút Dại cố định (chủng CVS) (3.2.11). Hỗn dịch huyết thanh – vi rút sau đó được gây nhiễm lên dòng tế bào cảm thụ với vi rút Dại. Xác định nồng độ huyết thanh gây giảm 50 % lô tế bào gây nhiễm ED₅₀ (Infective dose – 50). So sánh với ED₅₀ của huyết thanh chuẩn đã biết trước nồng độ để xác định nồng độ kháng thể có trong huyết thanh thử nghiệm

6.3.1.2 An toàn

Phương pháp trung hòa có sử dụng vi rút sống nên phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3. Trước khi cố định tế bào, tất cả các bước phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học.

Sử dụng đầy đủ các trang thiết bị bảo hộ như quần áo, khẩu trang, găng tay, mũ, ủng, tạp dề (4.1.5).

Khử trùng phòng thí nghiệm và khu vực làm bằng một trong các chất: cồn 50° – 70° (3.1.1), chloramine 5 % trong thời gian 30 min.

Tránh tạo ra các giọt khí dung.

Nhân viên phòng thí nghiệm phải được tiêm phòng vắc xin và kiểm tra nồng độ kháng thể định kỳ 6 tháng một lần, nếu hiệu giá kháng thể ≤ 0,5 IU/ml mới được làm việc với vi rút Dại.

6.3.1.3 Chuẩn bị mẫu

Huyết thanh đối chứng dương tính chuẩn (3.2.12) (Phòng thí nghiệm tham chiếu Dại của OIE, Nancy, Pháp) có nồng độ kháng thể lớn hơn 2 IU/ml.

Huyết thanh đối chứng âm tính chuẩn (3.2.13) có nồng độ kháng thể nhỏ hơn 0,1 IU/ml.

Mẫu huyết thanh cần xét nghiệm.

Trước khi tiến hành thử nghiệm, mẫu huyết thanh dương chuẩn, huyết thanh âm chuẩn và các huyết thanh mẫu cần xét nghiệm được bất hoạt 56 °C trong 30 min (4.4.5). Sau khi bất hoạt, để ngay huyết thanh vào đá xốp. Nếu mẫu đã bất hoạt thì không cần bất hoạt lại.

6.3.1.4 Cách tiến hành

Chuẩn bị vi rút thử thách – CVS11 (chủng tham chiếu ATCC VR 959), sẵn có ở ATCC hoặc Phòng thí nghiệm tham chiếu Dại của OIE, Nancy, Pháp (3.2.11).

Nuôi tế bào BHK-21 (3.2.10) kín 1 lớp trên chai tế bào T75 (4.3.2).

Tách tế bào bằng dung dịch trypsin 0,5 % EDTA (3.2.2) sau đó trung hòa trypsin bằng môi trường DMEM 10 % FCS (xem A4 phụ lục A), chuyển toàn bộ hỗn dịch này vào ống ly tâm 50 ml (4.1.4).

Ly tâm tế bào ở gia tốc 1 500 g trong 10 min bằng máy ly tâm (4.4.2) để loại bỏ môi trường chứa trypsin. Đổ bỏ hỗn dịch phía trên, giữ lại phần cặn là tế bào ở dưới.

Cho tiếp 10 ml DMEM 10 % FCS (xem A4 phụ lục A) vào phần cặn tế bào, dùng pipet 5 ml trộn đều bằng cách hút nhả vài lần.

Đếm tế bào (4.3.7), gây nhiễm vi rút chủng CVS (3.2.11) với nồng độ gây nhiễm 100 TCID₅₀/ml.

Ủ ống hỗn dịch này ở tủ ấm 37 °C, 5 % CO₂ trong 60 min (4.3.8). Lắc nhẹ đều hỗn dịch tế bào – vi rút cứ 10 -15 min/lần.

Sau đó chia hỗn dịch này vào chai tế bào T75 (4.3.2) với lượng 3 x 10⁶ tế bào/chai T75. Thêm môi trường DMEM 10 % FCS vừa đủ 20 ml/chai.

Ủ chai tế bào gây nhiễm vi rút trong tủ ấm 37 °C, 5 % CO₂ (4.3.8) trong 72 h.

Thu hoạch vi rút: thu dịch nuôi tế bào, ly tâm ở gia tốc 4 000 g trong 10 min, loại bỏ xác tế bào, thu hoạch dung dịch trong ở trên.

Chia ra ống nhựa có nắp xoáy, 1 ml/ống.

Bảo quản ở -80 °C (4.1.10).

Chuẩn độ vi rút:

Pha loãng vi rút theo cơ số 10 trên đĩa 96 giếng đáy tròn (4.3.4) từ nồng độ từ 10^-1 đến 10^-6, mỗi nồng độ 6 giếng. Cách làm như sau:

– Cho 270 µl môi trường DMEM 10 % FCS (xem A4 phụ lục A) vào mỗi giếng từ hàng A đến hàng F, cột 1 đến cột 6.

– Cho 30 µl vi rút cần chuẩn độ vào các giếng từ A1 đến F1, sử dụng pipet đa kênh trộn đều bằng cách hút nhả vài lần, chuyển 30 µl dung dịch vi rút từ cột 1 sang cột 2, trộn đều, cứ tiếp tục như vậy đến cột 6 hút bỏ 30 µl đi. Như vậy, vi rút được các nồng độ từ 10^-1 đến 10^-6.

– Chuyển 50 µl hỗn dịch vi rút/giếng ở các nồng độ từ đĩa 96 giếng đáy tròn vào đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (4.3.1). Mỗi nồng độ 6 giếng.

– Cho 50 µl hỗn dịch tế bào tách với lượng 1 x 10⁶ tế bào/ml vào 1 giếng

– Ủ đĩa hỗn dịch vi rút – tế bào ở 37 °C, trong tủ ấm chứa 5 % CO₂ (4.3.8) trong 48 h.

– Sau 48 h, soi kính kiểm tra tế bào trước khi nhuộm.

– Hút bỏ hết dung dịch ở các giếng của đĩa tế bào nuôi cấy vi rút, cố định bề mặt giếng bằng nhỏ 100 µl acetone 80 %/giếng (3.2.4).

– Ủ đĩa trong 30 min ở nhiệt độ phòng, hút bỏ toàn bộ dung dịch acetone trên đĩa, rửa đĩa bằng PBS (3.2.14) 2 lần. Để đĩa khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 10 min đến 15 min.

– Pha kháng thể kháng Dại gắn FITC theo tỷ lệ hướng dẫn của từng lô.

– Nhỏ 50 µl kháng thể kháng virus Dại – FITC/giếng (3.2.6), ủ 30 min ở nhiệt độ 37 °C.

– Rửa đĩa bằng PBS 2 lần.

– Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang vật kính 40X (4.2.3), quan sát toàn bộ vi trường, nếu vi trường có tế bào bắt màu huỳnh quang xanh lá mạ thì đọc (+), không có màu huỳnh quang thì đọc (-).

– Tính kết quả theo phương pháp Spearman – Kärber, xác định TCID₅₀/50 µl.

Các bước tiến hành trung hòa

Pha huyết thanh đối chứng chuẩn và huyết thanh mẫu xét nghiệm

Pha loãng huyết thanh đối chứng dương chuẩn, huyết thanh đối chứng âm chuẩn, đối chứng vi rút, đối chứng tế bào và chuẩn độ lại vi rút vào 1 đĩa theo sơ đồ sau:

Log₁₀ (độ pha loãng HT)					0,48	0,95	1,43	1,91	2,39	2,87
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	Chuẩn độ lại vi rút				HT dương chuẩn 2 IU						Chứng VR	Chứng TB
B
C
D
E					HT dương chuẩn 0,5 IU				HT âm chuẩn
F
G
H

Cho 150 µl môi trường DMEM 10 % FCS vào các giếng AH 1 đến AH 4 và các giếng chứng tế bào AD 12. Các giếng còn lại cho 100 µl môi trường.

Cho 50 µl huyết thanh chuẩn 2 IU vào các giếng AD 5.

Cho 50 µl huyết thanh chuẩn 0,5 IU vào các giếng EH 5.

Cho 50 µl huyết thanh chứng âm vào các giếng EH 9.

Trộn đều bằng cách hút nhả nhiều lần, chuyển 50 µl ở nồng độ pha loãng trước sang các giếng tiếp theo cho đến cột cuối cùng, bỏ 50 µl ở cột cuối cùng đi.

Pha huyết thanh cần xét nghiệm theo sơ đồ sau:

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A
B
C
D
E
F
G
H
Log₁₀ (độ pha loãng HT)	0,48	0,95	1,43	1,91	2,39	4,23	0,48	0,95	1,43	1,91	2,39	4,23

Mỗi đĩa chuẩn độ cho 4 huyết thanh theo sơ đồ, mỗi nồng độ cho 4 giếng.

Cho 100 µl môi trường vào các giếng trừ AH 6 và AH 12 cho 200 µl môi trường.

Cho 50 µl huyết thanh vào các giếng AH 1 và AH 7, mỗi mẫu cho vào 4 giếng liền kề.

Trộn đều sau đó lấy 50 µl huyết thanh ở nồng độ đặc chuyển sang nồng độ kế tiếp, trộn đều tương tự cho tới cột AH 5 và AH 11.

Chuyển 10 µl huyết thanh pha loãng ở cột AH 5 và AH 11 sang AH 6 và AH 12, trộn đều sau đó bỏ 180 µl đi, thêm vào 70 µl môi trường.

CHÚ Ý:

– Loại bỏ 40 µl huyết thanh ở cột AH 5 và AH 11 đi để đảm bảo thể tích trong các giếng là 100 µl.

Cho vi rút

Lấy chủng CVS-11 (3.2.11) từ tủ – 80 °C. Đông tan nhanh dưới vòi nước chảy, đặt vi rút trong đá xốp để giữ lạnh.

Pha loãng vi rút trong môi trường DMEM 10 % FCS (xem A4 phụ lục A) để đạt nồng độ 100TCID₅₀ trong 50 µl. Cho 50 µl vi rút vào mỗi giếng đã có sẵn huyết thanh.

Để chuẩn độ lại vi rút, cho 50 µl vi rút 100TCID₅₀ vào các giếng A1 – A4. Trộn đều và chuyển 50 µl sang hàng tiếp theo và cho tới hàng H1 – H4. Bỏ 50 µl ở hàng cuối cùng

Cho 50 µl vi rút chứng vào các giếng AD 11.

Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C, 5% CO₂ (4.3.8) trong 1 h.

Cho tế bào

Tế bào BHK-21 vừa kín, tách tế bào, tính nồng độ tế bào 4 x 10⁵ TB/ ml DMEM 10% FCS. Cho 50 µl tế bào/giếng.

Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C, 5% CO₂ (4.3.8) trong 48 h.

Cố định và nhuộm

Đổ môi trường trong đĩa. Rửa đĩa phản ứng 1 lần bằng PBS, pH = 7,2 – 7,4 (3.2.14) và một lần bằng acetone 80% (3.2.4). Sau đó, đĩa được cố định trong acetone 80% trong 30 min tại nhiệt độ phòng. Sau đó để khô ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 min.

Nhỏ 50 µl dung dịch cộng hợp (kháng thể gắn FITC) (3.2.6) pha theo hiệu giá.

Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C, ở điều kiện ẩm và tối trong 30 min.

Loại bỏ hết kháng thể, rửa đĩa ba lần bằng dung dịch PBS (3.1.14).

Để khô đĩa ở nhiệt độ phòng.

6.3.1.7 Đọc kết quả

– Đọc kết quả dưới kính huỳnh quang, vật kính 40X (4.2.3).

– Đối chứng vi rút và đối chứng tế bào được quan sát đầu tiên.

– Đối chứng vi rút: có xuất hiện tượng phát huỳnh quang ở tất cả các giếng.

– Chuẩn độ vi rút: vi rút cho vào là 2log₁₀ và nên khi vi rút chuẩn độ ngược nên nằm trong khoảng 1,5-2,5log₁₀.

– Đối chứng tế bào không có có hiện tượng trung hòa vi rút ở bất kỳ giếng nào (tức là không có hiện tượng bắt màu huỳnh quang). Đối chứng âm có hiện tượng bắt màu huỳnh quang.

– Quan sát toàn bộ các vi trường. Kiểm tra các giếng nếu có tế bào bắt màu huỳnh quang giống chứng dương (chứng vi rút) đánh dấu (+), nếu giếng không bắt màu huỳnh quang, nền tế bào giống chứng âm (chứng tế bào) đánh dấu (-).

– Xác định D₅₀ của huyết thanh chứng dương và huyết thanh cần chuẩn độ theo phương pháp Spearman – Kärber.

– Hiệu giá huyết thanh thử nghiệm là độ pha loãng huyết thanh mà 100 % vi rút được trung hòa trong 50 % số giếng được thực hiện. Hiệu giá này được thể hiện bằng IU/ml bằng cách so sánh độ pha loãng huyết thanh của OIE có nguồn gốc từ chó trong cùng điều kiện thí nghiệm.

6.3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể dại có bán sẵn trên thị trường. Thực hiện phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục H).

Kết luận

Động vật được xác định mắc bệnh Dại khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của bệnh Dại và có kết quả xét nghiệm Dại dương tính bằng một trong những phương pháp sau:

– Có kết quả xét nghiệm kháng nguyên vi rút Dại dương tính bằng phương pháp DFAT.

– Có kết quả xét nghiệm kháng nguyên vi rút Dại dương tính bằng phương pháp realtime RT-PCR.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1 Dung dịch kháng sinh đậm đặc

Penicillin 1 000 000 IU

Streptomycin 1 g

Nystatin 500 000 IU

Nước cất 10 ml

Lắc đều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

Sử dụng tốt nhất trong 1 tuần, bảo quản ở 4 °C.

A.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) 10x, pH ~ 7,2, sản phẩm thương mại

Dung dịch muối đệm phosphat 10x 100 ml

Nước cất (vô trùng) 900 ml

A.3 Dung dịch muối đệm photphat (PBS) pH ~ 7,2

Natri clorua (NaCl) 8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na₂HPO₄.2H₂O) 2,9 g

Kali dihydro photphat (KH₂PO₄) 0,2 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Nước cất 1 000 ml

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M (3.2.7) hoặc dung dịch HCl 1 M (3.2.8). Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

Để dùng làm dung dịch bảo quản mẫu: pha 9 phần PBS với 1 phần dung dịch kháng sinh đậm đặc (xem A1 phụ lục A). Trường hợp mẫu cần bảo quản lâu có thể pha thành môi trường đệm glycerin bằng cách trộn đều 1 phần PBS với 1 phần glycerin. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.4 Môi trường nuôi tế bào

Môi trường DMEM 440 ml

Huyết thanh bào thai bê (FCS) 10 % 50 ml

Kháng sinh (Penicillin/streptomycin: 10 000 UI/ml) 5 ml

Chất chống nấm (Fungizone: 250 µg/ml) 5 ml

* Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

A.5 Cấy chuyển và nuôi tế bào

Nguyên liệu: 1 chai nuôi tế bào BHK-21 75 cm² đã phát triển 1 lớp đạt 100 % bề mặt nuôi

1 đĩa tế bào BHK-21 12 giếng

Môi trường nuôi tế bào (xem A4 phụ lục A)

Trypsin có 0,05 % EDTA

PBS (xem A2 phụ lục A)

CHÚ Ý: Tất cả các môi trường phải được cân bằng ở 37 °C trước khi sử dụng và vật tư dùng cho tế bào đều phải được hấp vô trùng trước khi sử dụng.

Tiến hành như sau:

Bước 1: Hút bỏ môi trường đang nuôi trong chai tế bào BHK-21 1 lớp

Bước 2: Rửa bề mặt thảm tế bào bằng PBS 2 lần với 10 ml/chai 75 cm², tráng qua và hút bỏ PBS.

Bước 3: Tách tế bào

– Cho 2 ml trypsin (có 0,05 % EDTA) vào chai tế bào 75 cm², láng đều lên bề mặt tế bào sao cho bề mặt tế bào được phủ một lớp trypsin.

– Ủ trong thời gian từ 3 min đến 10 min trong tủ ấm ở 37 °C.

CHÚ Ý: không để tế bào trong trypsin quá 15 phút.

– Khi tế bào đã tách hết, bổ sung 5 ml môi trường nuôi tế bào (xem A4 phụ lục A) vào chai để vô hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn bộ huyễn dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml.

Bước 4: Loại bỏ Trypsin

– Ly tâm huyễn dịch tế bào ở gia tốc 3 000 g trong 5 phút.

– Loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào.

Bước 5: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào (4.3.7) dưới kính hiển vi thường (4.3.6)

– Làm long cặn tế bào bằng cách búng nhẹ vào thân ống chứa cặn tế bào.

– Bổ sung 10 ml môi trường nuôi tế bào, sau đó dùng pipet (4.1.1) hút lên hút xuống nhẹ nhàng cho đến khi các tế bào phân tán đều trong dịch môi trường.

– Đếm tế bào: Pha loãng tế bào 100 lần (10 µl tế bào trong 990 µl môi trường nuôi tế bào), đếm tế bào bằng buồng đếm (4.3.7) trên kính hiển vi (4.3.6), tính số tế bào trong 1 ml.

Bước 6: Cấy chuyển tế bào:

– Ghi nhãn chai nuôi tế bào mới (tên dòng tế bào, ngày nuôi cấy, lần cấy chuyển)

– Chia huyễn dịch tế bào vào 1 chai 75 cm² và 1 đĩa 12 giếng:

* Chai tế bào 75 cm² khi nuôi cấy cần 6 x 10⁶ tế bào/chai (4.3.2) (hoặc chai tế bào 25 cm² khi nuôi cấy cần 2 x 10⁶ tế bào/chai (4.3.3).

* Đĩa tế bào 96 giếng khi nuôi cấy cần 1×10⁶ tế bào/đĩa (4.3.1)

Bước 7: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển:

– Chai tế bào 75 cm² bổ sung 20 ml môi trường nuôi tế bào và 6 x 10⁶ tế bào BHK-21 sau khi đếm.

– Đĩa tế bào 12 giếng: Ống ly tâm 50 ml có 18 ml môi trường nuôi tế bào và 1 x 10⁶ tế bào BHK-21 sau khi đếm, trộn đều và chia nhỏ ra 12 giếng mỗi giếng 1,5 ml.

Bước 8: Nuôi chai tế bào và đĩa tế bào trong tủ ấm có 5 % CO₂ duy trì ở 37 °C.

Theo dõi sự phát triển hàng ngày của tế bào bằng kính hiển vi (4.3.6).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Phương pháp chiết tách ARN

Dùng huyễn dịch đã xử lý (xem 6.2.3.1) để chiết tách ARN. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep (hoặc kít khác tương đương để chiết tách RNA) theo quy trình dưới đây:

Nhỏ 200 µl dịch nghiền mô vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 µl Qiagen® buffer RLT có 1% β- ME, lắc đều trên máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

Thêm 500 µl Etanol 70 % (3.1.1) vào ống, lắc mạnh bằng máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc 10 000 g ở nhiệt độ phòng.

Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc 10 000 g, thay ống thu mới vào cột lọc.

Nhỏ 500 µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc 10 000 g, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở gia tốc 12 000 g trở lên, bỏ ống thu.

Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 µl nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min ở gia tốc 10 000 g, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu để sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở – 20 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Trình tự một số cặp mồi, hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng rRT-PCR để phát hiện vi rút Dại

C.1 Trình tự mồi – mẫu dò, lượng hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime RT-PCR^{[2] [3]}

Bảng C1: Trình tự mồi-mẫu dò phát hiện vi rút Dại trong rRT-PCR ^{[2] [3]}

Tên mồi (Ng.gốc)	Mồi, mẫu dò	Trình tự (5′-3′)
Lyssa N1 (Coertse, 2010)	Mẫu dò	FAM-CATCACACCTTGATGACAACTCACAA-BHQ1
	Mồi xuôi	CACMGSNAAYTAYAARACNAA
	Mồi ngược	GTRCTCCARTTAGCRCACAT
Rabies N2 (RABV-N2) (Hoffman, 2010)	Mẫu dò	FAM-CAGCAATGCAGTTYTTTGAGGGGAC-BHQ1
	Mồi xuôi	GATCCTGATGAYGTATGTTCCTA
	Mồi ngược	RGATTCCGTAGCTRGTCCA

CHÚ THÍCH 1:

– Việc lựa chọn các mồi và mẫu dò cho phản ứng cần tham khảo theo hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật của OIE, CDC, FAO và các bài báo khoa học hàng năm để cập nhật mồi cho phù hợp

– Trình tự các mồi và mẫu dò được trình bày ở bảng C1 được công bố theo tài liệu tham khảo [2] [3].

Bảng C2: Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml với các lượng cụ thể cho mỗi phản ứng

Thành phần (Theo hướng dẫn của Kít Invitrogen Superscript III platinum One-Step qRT-PCR Kit. REF. 11732-020)	Thể tích (µl)
2x Reaction buffer	12,5
Mồi xuôi 20 µM	0,5
Mồi ngược 20 µM	0,5
Mẫu dò 6 µM	0,5
Enzyme	0,5
Nước không có nuclease	5,5
Mẫu ARN	5
Tổng	25

CHÚ THÍCH 2: Có thể sử dụng kít khác tương đương để tạo hỗn hợp phản ứng cho phản ứng realtime RT-PCR). Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng C3: Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút Dại ^[5]

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
48 °C	30 min	1 vòng
95 °C	2 min	1 vòng
95 °C	90 s	5 vòng
45 °C	90 s
50 °C	20 s
72 °C	60 s
95 °C	30 s	40 vòng
45 °C	60 s
50 °C	20 s
72 °C	60 s
95 °C	30 s	1 vòng
45 °C	90 s
50 °C	20 s
68 °C	10 min

CHÚ THÍCH 3:

– Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime – RT PCR được trình bày ở bảng C3 được công bố theo tài liệu tham khảo [5]

C.2 Trình tự mồi – mẫu dò, lượng hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR ^[4]

Bảng C4: Trình tự mồi-mẫu dò phát hiện vi rút Dại trong rRT-PCR ^[4]

Tên mồi	Mồi, mẫu dò	Trình tự (5′-3′)
LN34 Forward Primer 1	Mồi xuôi	ACGCTTAACAACCAGATCAAAGAA
LN34 Forward Primer 2	Mồi xuôi	ACGCTTAACAACAAAATCADAGAAG
LN34 Reverse Primer	Mồi ngược	CMGGGTAYTTRTAYTCATAYTGRTC
LN34 Probe	Mẫu dò	FAM-AACACCYCTACAATGGA-BHQ1
LN34 Lagos Probe	Mẫu dò	FAM-AACACTACTACAATGGA-BHQ1
β – Actin Forward Primer	Mồi ngược	CGATGAAGATCAAGATCATTGC
β – Actin Reverse Primer	Mồi ngược	AAGCATTTGCGGTGGAC
β – Actin Probe	Mẫu dò	HEX-TCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCA-BHQ1

CHÚ THÍCH 4:

– Trình tự các mồi và mẫu dò được trình bày ở bảng C4 được công bố theo tài liệu tham khảo [4]

Bảng C5: Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml với các lượng cụ thể cho mỗi phản ứng ^[4]

Thành phần (Theo hướng dẫn của Kít Invitrogen Superscript III platinum One-Step qRT-PCR Kit. REF. 11732-020)	Thể tích (µl)
2x Reaction buffer	12,5
Mồi xuôi 20 µM	0,5
Mồi ngược 20 µM	0,5
Mẫu dò 10 µM	0,5
Enzyme	0,5
Nước không có nuclease	5,5
Mẫu ARN	5
Tổng	25

Bảng C6: Chu trình nhiệt cho phản ứng rRT-PCR phát hiện vi rút Dại ^[4]

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C	30 min	1 vòng
95 °C	10 min	1 vòng
95 °C	15 s	45 vòng
56 °C	30 s	45 vòng

CHÚ THÍCH 5:

– Hỗn hợp phản ứng cho phương pháp realtime RT-PCR được trình bày ở bảng C5 được công bố theo tài liệu tham khảo [4].

– Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR được trình bày ở bảng C6 được công bố theo tài liệu tham khảo [4].

Phụ lục D

(Qui định)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh Dại

Phụ lục E

(Quy định)

Cách tính D50 cho thử nghiệm FAVN

Ví dụ: đám huỳnh quang ở mỗi nồng độ

TT	0,48	0,95	1,43	1,91	2,39	4,23
1	–	–	–	–	–	+
2	–	–	–	–	–	+
3	–	–	–	–	+	+
4	–	–	–	+	+	+
–	4	4	4	3	2	0
+	0	0	0	1	2	4

Ghi chú: (+) đám huỳnh quang; (-) không đám huỳnh quang

– Tính cộng dồn số đám huỳnh quang và không ở mỗi nồng độ

Nồng độ	Cộng dồn không đám huỳnh quang	Cộng dồn có đám huỳnh quang
0,48	4 + 13 = 17	0
0,95	4 + 9 = 13	0
1,43	4 + 5 = 9	0
1,91	3 + 2 = 5	1
2,39	2 + 0 = 2	2 + 1 = 3
4,23	0	4 + 3 = 7

– Tính số phần trăm không đám huỳnh quang ở mỗi nồng độ theo công thức

	Cộng dồn số không đám huỳnh quang x 100
	Tổng số cộng dồn đám huỳnh quang và không

Ở nồng độ 1,91		Ở nồng độ 2,39

– Lấy 2 giá trị để tính D₅₀: Giá trị nhỏ nhất lớn hơn 50% và giá trị lớn nhất nhỏ hơn 50 %

– Công thức tính D₅₀

Áp dụng công thức trên ta có:

D₅₀ = 1,91 +0,11 = 2,02

Ghi chú: Log pha loãng 1/70 = 1,845

Log 4 = 0,602

Phụ lục G

(Quy định)

Cách quy đổi giá trị Log D50 sang giá trị IU/ml

Hiệu giá huyết thanh (IU/ml) =	10^{(giá trị log D}₅₀^{của huyết thanh)}	x 0,5
	10^{(log D}₅₀^{của huyết thanh dương chuẩn OIE 0,5 IU/ml)}

Ví dụ:

– Log D₅₀ của huyết thanh = 2,27

– Hiệu giá lý thuyết của huyết thanh dương chuẩn OIE 0,5IU/ml = 0,5IU/ml

– Log D₅₀ của huyết thanh OIE = 1,43

Hiệu giá huyết thanh

Hiệu giá huyết thanh (IU/ml) = = 3,46 IU/ml

Phụ lục H

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA

Hiện nay có rất nhiều các loại kít phát hiện kháng thể Dại khác nhau được cung cấp trên thị trường nên khi sử dụng tuân theo qui trình của nhà sản xuất (hoặc kít khác tương ứng để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dại).

Nếu sử dụng bộ kít chẩn đoán Dog Rabies virus Antibody IgG (RABV) ELISA Kid của Abbexa với Cat No.:abx05582 thì các bước tiến hành được thực hiện như sau:

Chuẩn bị mẫu và thuốc thử

– Chuẩn bị bộ số mẫu huyết thanh cần kiểm tra (6.1.2) + đối chứng dương + đối chứng âm. Mẫu huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng 10 lần với dung dịch pha loãng mẫu.

– Nước rửa: pha loãng dung dịch nước rửa đậm đặc 25 lần (1/25) với nước cất. Ví dụ như pha 20 ml dương dịch rửa đậm đặc trong 480 ml nước cất.

– Chuẩn bị HRP conjugate: Ly tâm ống conjugate trước khi mở. Pha loãng HRP conjugate 100 lần với dung dịch pha pha loãng HRP Conjugate. Ví dụ như cho 10 µl HRP conjugate vào trong 990 µl dung dịch pha loãng HRP conjugate.

Các bước tiến hành

Các nguyên vật liệu và mẫu được để ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng

– Bước 1: Chuẩn bị tất cả thuốc thử và mẫu như đã miêu tả trong phần 1.

– Bước 2: Xác định số giếng được sử dụng. Tất cả các dải nào không được sử dụng phải được giữ khô và bảo quản ở 4 °C.

– Bước 3: Thiết kế hai giếng trống (blank) mà không cần bất kỳ dung dịch gì.

– Bước 4: Nhỏ 100 µl đối chứng âm vào mỗi giếng như bố trí (2 giếng đối chứng âm).

– Bước 5: Nhỏ 100 µl đối chứng dương vào mỗi giếng như bố trí (2 giếng đối chứng dương).

– Bước 6: Nhỏ 100 µl mẫu huyết thanh cần kiểm tra đã pha loãng vào mỗi giếng như bố trí.

– Bước 7: Đậy nắp đĩa. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ủ ở 37 °C trong 30 phút.

– Bước 8: Tháo nắp, đổ bỏ môi trường trong đĩa và rửa đĩa 3 lần với nước rữa đã chuẩn bị ở phần 1. Mỗi giếng 200 µl và ngâm trong 2 phút. Sau đó đổ bỏ nước rủa và thấm đĩa trên khăn hoặc giấy.

– Bước 9: Nhỏ 100 µl HRP conjugate đã pha loãng vào từng giếng (trừ giếng blank). Đậy nắp đĩa. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ủ ở 37 °C trong 30 phút.

– Bước 10: Lặp lại quy trình rửa (Bước 8) 5 lần.

– Bước 11: Nhỏ 90 µl cơ chất (Substrate) TMB vào mỗi giếng. Đậy nắp đĩa. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ủ ở 37°C trong 30 phút. Ủ tại 37 °C trong 20 phút trong điều kiện tối.

– Bước 12: Dừng phản ứng bằng cách nhỏ 50 µl dung dịch stop vào mỗi giếng. Vỗ nhẹ đĩa để trộn kỹ. Ở đây sẽ có sự thay đổi màu sang màu vàng

– Bước 13: Để 10 phút và đọc kết quả ở bước sóng 450 nm.

Phân tích kết quả

– Kết quả âm tính: Giá trị OD của mẫu < 2.1 x giá trị OD trung bình của đối chứng âm

– Kết quả dương tính: Giá trị OD của mẫu ≥ 2.1 x giá trị OD trung bình của đối chứng dương.

Sơ đồ đĩa:

ĐC(-)

S11

S19

S27

S35

S43

S51

S59

S67

S75

S83

ĐC(-)

S12

S20

S28

S36

S44

S52

S60

S68

S76

S84

ĐC(+)

S13

S21

S29

S37

S45

S53

S61

S69

S77

S85

ĐC(+)

S14

S22

S30

S38

S46

S54

S62

S70

S78

S86

Blank

S15

S23

S31

S39

S47

S55

S63

S71

S79

S87

Blank

S16

S24

S32

S40

S48

S56

S64

S72

S80

S88

S17

S25

S33

S41

S49

S57

S65

S73

S81

S89

S10

S18

S26

S34

S42

S50

S58

S66

S74

S82

S90

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] O.I.E. (2018). Rabies. In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2018).

[2] Jessica Coertse, Jacqueline Weyer, Louis H. Nel, and Wanda Markotter1* (2010). Improved PCR Methods for Detection of African Rabies and Rabies-Related Lyssaviruses. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, p. 3949-3955.

[3] B. Hoffmann, C. M. Freuling, P. R. Wakeley, T. B. Rasmussen, S. Leech, A. R. Fooks, M. Beer, and T. Mu”ller (2010). Improved Safety for Molecular Diagnosis of Classical Rabies Viruses by Use of a TaqMan Real-Time Reverse Transcription-PCR “Double Check” Strategy. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, p. 3970-3978.

[4] CDC. (2018). CDC training for molecular rabies diagnois and typing of rabies virus.

[5] CSIRO. (2017). Procedues for rabies and lyssavirus diagnosis including rabies fluorescent antibody test (FAT) and virus isolation.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-46:2019 VỀ BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHUẨN ĐOÁN – PHẦN 46: BỆNH DẠI
Số, ký hiệu văn bản	TCVN8400-46:2019	Ngày hiệu lực
Loại văn bản	Tiêu chuẩn Việt Nam	Ngày đăng công báo
Lĩnh vực	Nông nghiệp - Nông thôn	Ngày ban hành	01/01/2019
Cơ quan ban hành		Tình trạng	Còn hiệu lực

Các văn bản liên kết

Văn bản được hướng dẫn		Văn bản hướng dẫn
Văn bản được hợp nhất		Văn bản hợp nhất
Văn bản bị sửa đổi, bổ sung		Văn bản sửa đổi, bổ sung
Văn bản bị đính chính		Văn bản đính chính
Văn bản bị thay thế		Văn bản thay thế
Văn bản được dẫn chiếu		Văn bản căn cứ

Tải văn bản

Tải văn bản về Bản PDF/Bản gốc