TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12626:2019 VỀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CÓ CHỨA HYDRASTIS CANADENSIS – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDRASTIN VÀ BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR UV

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12626:2019

THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CÓ CHỨA HYDRASTIS CANADENSIS –  XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDRASTIN VÀ BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR UV

Dietary supplements containing Hydrastis canadensis – Determination of hydrastine and berberine content by high performance liquid chromatographic method with UV detection

Lời nói đầu

TCVN 12626:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2008.04 Hydrastine and berberine in goldenseal raw materials, extracts, and dietary supplements. High-performance liquid chromatography with UV;

TCVN 12626:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CÓ CHỨA HYDRASTIS CANADENSIS –  XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDRASTIN VÀ BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR UV

Dietary supplements containing Hydrastis canadensis – Determination of hydrastine and berberine content by high performance liquid chromatographic method with UV detection

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định hàm lượng hydrastin và berberin trong nguyên liệu, thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Hydrastis canadensis (goldenseal).

2  Nguyên tắc

Các chất phân tích được chiết khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp của nước : axetonitril: axit phosphoric (tỷ lệ 70 : 30 : 0,1 theo thể tích). Sau đó dịch chiết được xác định trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector UV.

3  Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

CẢNH BÁO: Axetonitril và triethylamin (TEA) rất dễ cháy, cần bảo quản tránh xa các nguồn nhiệt và lửa.

3.1  Axetonitril (C₂H₃N).

3.2  Axit o-phosphoric (H₃PO₄) 85 %.

3.3  Triethylamin (TEA) (C₆H₁₅N), độ tinh khiết ≥ 99 %.

3.4  Axit formic (CH₂O₂), độ tinh khiết ≥ 98 %.

3.5  Amoni format (NH₄HCO₂), độ tinh khiết ≥ 96 %.

3.7  Pha động

3.7.1  Pha động A

Hòa tan 1,61 g amoni format (3.5) trong nước để được 1 000 ml pha động A, chỉnh pH về 3,8 bằng axit formic (3.4).

3.7.2  Pha động B

Cho 1 ml TEA (3.3) vào bình định mức 1 L chứa sẵn khoảng 900 ml axetonitril (3.1), thêm axetonitril (3.1) vừa đủ 1 000 ml và trộn đều.

3.8  Dung môi chiết

Pha trộn 700 ml nước với 300 ml axetonitril (3.1) và 1 ml dung dịch axit phosphoric (3.2), trộn đều.

3.9  Dung môi pha loãng

Pha trộn 10 ml axetonitril (3.1) và 90 ml nước.

3.10  Dung dịch chuẩn

3.10.1  Dung dịch chuẩn gốc berberin, 1 000 µg/ml

Cân một lượng chất chuẩn berberin clorua dihydrat (ví dụ: Chromadex hoặc tương đương) chứa 10 mg berberin, chính xác đến 0,01 mg, cho vào bình định mức 10 ml (4.8), hòa tan và định mức bằng dung môi pha loãng (3.9), trộn đều bằng máy vortex hoặc rung siêu âm cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4 °C.

3.10.2  Dung dịch chuẩn gốc hydrastin, 1 000 µg/ml

Cân một lượng chất chuẩn (1R,9S)-(-)-(β-hydrastin (ví dụ: Chromadex hoặc tương đương) chứa 10 mg hydrastin, chính xác đến 0,01 mg, cho vào bình định mức 10 ml (4.8), hòa tan và định mức bằng dung môi pha loãng (3.9), trộn đều bằng máy vortex hoặc rung siêu âm cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4 °C.

3.10.3  Dung dịch chuẩn gốc canadin, 1 000 µg/ml

Cân một lượng chất chuẩn DL-canadin (tetrahydroberberin) (ví dụ: Chromadex hoặc tương đương) chứa 10 mg canadin, chính xác đến 0,01 mg, cho vào bình định mức 10 ml (4.8), hòa tan và định mức bằng dung môi pha loãng (3.9), trộn đều bằng máy vortex hoặc rung siêu âm cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4 °C.

3.10.4  Dung dịch chuẩn gốc palmatin, 1 000 µg/ml

Cân một lượng chất chuẩn palmatin clorua (tetramethoxyprotoberberin clorua) (ví dụ: Chromadex hoặc tương đương) chứa 10 mg palmatin, chính xác đến 0,01 mg, cho vào bình định mức 10 ml (4.8), hòa tan và định mức bằng dung môi pha loãng (3.9), trộn đều bằng máy vortex hoặc rung siêu âm cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4 °C.

3.10.5  Dung dịch chuẩn hỗn hợp

Sử dụng các dung dịch chuẩn gốc berberin (3.10.1), hydrastin (3.10.2), canadin (3.10.3) và palmatin (3.10.4) để chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp. Dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ berberin và hydrastin là 250 µg/ml, nồng độ canadin và palmatin là 125 µg/ml. Bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4 °C

3.10.6  Dung dịch chuẩn làm việc

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc theo Bảng 1.

Bảng 1 – Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm bộ phận bơm dung môi, bộ bơm mẫu tự động, detector UV-Vis.

4.2  Cột phân tích, C18 (4,6 mm x 150 mm, cỡ hạt 3,5 µm, cỡ lỗ 80 Ǻ) và tiền cột tương ứng hoặc loại tương đương.

4.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.4  Bể rung siêu âm

4.5  Máy trộn Vortex.

4.6  Máy đo pH, được hiệu chuẩn ở khoảng 4,1 và 7,0.

4.7  Máy ly tâm, có thể đạt tốc độ 5 000 r/min và ống ly tâm 50 ml, bằng nhựa có nắp kín.

4.8  Bình định mức, bằng thủy tinh trung tính, dung tích 10, 50, 100 và 200 ml.

4.9  Màng lọc xyranh, bằng PTFE, kích thước 13 mm, cỡ lỗ 0,2 µm.

4.10  Lọ đựng mẫu cho HPLC, dung tích 2 ml, có nắp vặn được phủ teflon.

4.11  Xyranh, dung tích 3 ml.

4.12  Máy nghiền

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1  Đối với các mẫu nguyên liệu, viên nang cứng và viên nén

Đối với các mẫu rễ cây: nghiền nhỏ thành bột có thể qua sàng cỡ lỗ 80 mesh.

Đối với các mẫu viên nang cứng gộp riêng phần bột bên trong 20 viên, trộn đều.

Đối với các mẫu viên nén: lấy 20 viên, nghiền nhỏ thành bột mịn và trộn đều.

Cân khoảng 250 mg (± 20 mg) mẫu đã đồng nhất như trên, cho vào ống ly tâm 50 ml (4.7), thêm chính xác 20 ml dung môi chiết (3.8), đậy kín nắp và trộn Vortex trong 10 s rồi đem rung siêu âm trong 10 min, trộn Vortex thêm 10 s. Sau đó, cho ly tâm ở tốc độ 5 000 r/min trong 5 min. Pha loãng 200 µl dịch lỏng phía trên với 800 µl dung môi pha loãng (3.9) trong lọ đựng mẫu HPLC (4.10).

6.1.2  Đối với các mẫu dạng lỏng

Lấy chính xác 1,00 ml mẫu dạng lỏng đã lắc đều, cho vào bình định mức 10 ml (4.8), thêm dung môi pha loãng (3.9) đến vạch và lắc đều. Dịch thu được đem lọc qua màng lọc 0,2 µm (4.9) cho vào lọ đựng mẫu HPLC (4.10).

6.2  Điều kiện vận hành HPLC

– Pha động: Phối hợp kênh A và B

– Detector: PDA hoặc UV-Vis, bước sóng 230 nm;

– Thể tích mẫu bơm: 10 µl;

– Tốc độ dòng: 0,75 ml/min;

– Nhiệt độ buồng cột: 40 °C.

CHÚ THÍCH: Các thông số về tỷ lệ pha động, thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ buồng cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.

6.3  Kiểm tra sự ổn định của hệ thống

Cân bằng hệ thống bằng dung môi pha động (3.7) ít nhất 10 min đến khi đường nền ổn định, sau đó bơm lặp lại năm lần, mỗi lần 10 µl dung dịch chuẩn làm việc số 5 (3.10.6). Hệ thống được cho là thích hợp nếu:

– Hệ số dung lượng (k’) đối với hydrastin là không nhỏ hơn 1,0:

– Độ phân giải giữa palmatin và berberin là ≥ 1,0;

– Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic cho hydrastin và berberin ≤ 2,0 %;

– Hệ số kéo đuôi T của canadin ≤ 2,0;

– Số đĩa lý thuyết của canadin ít nhất là 5 000.

6.4  Dựng đường chuẩn

Sau khi thiết bị đã ổn định, tiến hành bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc (3.10.6) vào hệ thống HPLC (trừ dung dịch chuẩn làm việc số 6).

Xác định diện tích pic, dựng đường chuẩn dựa vào diện tích pic và nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc tương ứng, với hệ số R² ≥ 0,995.

6.5  Xác định

Bơm mẫu thử đã chuẩn bị (xem 6.1) vào hệ thống HPLC với cùng điều kiện như bơm dung dịch chuẩn, xác định diện tích các pic.

7  Tính kết quả

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử, X, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (1):

                   (1)

Trong đó:

C  là nồng độ chất phân tích tính từ đường chuẩn (mg/ml);

D  là hệ số pha loãng;

V  là thể tích dung môi chiết, tính bằng mililit (ml);

W  là khối lượng mẫu phân tích đã cân, tính bằng miligam (mg).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 – Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm xác định hydrastin và berberin trong các mẫu nguyên liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa Hydrastis canadensis