TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-7:2019 VỀ BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 7: BỆNH XUẤT HUYẾT MÙA XUÂN Ở CÁ CHÉP

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-7:2019

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 7: BỆNH XUẤT HUYẾT MÙA XUÂN Ở CÁ CHÉP

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 7: Spring viraemia of carp disease

Lời nói đầu

TCVN 8710-7: 2019 thay thế TCVN 8710-07:2012

TCVN 8710-7: 2019 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

– TCVN 8710-02: 2019, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở tôm (MBV);

– TCVN 8710-02: 2019, phần 2: Bệnh Hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN);

– TCVN 8710-03: 2019, phần 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm (WSSV);

– TCVN 8710-04: 2019, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm (YHV);

– TCVN 8710-05: 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He (TSV);

– TCVN 8710-06: 2019, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép (KHV);

– TCVN 8710-07: 2019, phần 7; Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (SVC);

– TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

– TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

– TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-12: 2019, phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

– TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

– TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

– TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas ở cá;

– TCVN 8710-16:2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

– TCVN 8710-17:2016, phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

– TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

– TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

– TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá.

 

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 7: BỆNH XUẤT HUYẾT MÙA XUÂN Ở CÁ CHÉP

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 7: Spring viraemia of carp disease

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân do vi rút ở cá chép.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1

Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (Spring Viraemia of Carp – SVC) là bệnh truyền nhiễm do Rhabdovirus.

Bệnh gây xuất huyết cấp tính và nhiễm trùng huyết ở hầu hết các loài cá thuộc họ cá chép và một vài loài cá da trơn (OIE, 2017). Bệnh có nhiều tên gọi khác như: bệnh phù của cá chép, bệnh đốm đỏ cá chép, bệnh viêm bóng hơi cá chép (Swim bladder inflammiation SBI), bệnh vi rút mùa xuân (Spring virus disease).

2.2

Vi rút gây bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (Spring Viraemia of Carp Virus – SVCV) thuộc giống Vesiculovirus, họ Rhabdovirus có vật chất di truyền là RNA mạch đơn (RNA), bộ gene có 11019 nucleotide mã hóa năm loại protein: Nucleoprotein (N), Phosphoprotein (P), Matrix protein (M), Glycoprotein (G) và protein mã hóa enzyme RNA polymerase (L).

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung )

3.1.1  Etanol, từ 70 % đến 100 % (C₂H₆O)

3.1.2  Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) (xem A.2)

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT- nested PCR (Reverse Transcription nested Polymerase Chain Reaction) và realtime RT-PCR (realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

3.2.1  Mồi (primers) RT – nested PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.2  Agarose

3.2.3  Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate – EDTA) hoặc TBE (Tris-brorate – EDTA) (xem A.1)

3.2.4  Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe

3.2.5  Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.2.6  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic)

3.2.7  Kít nhân gen RT-PCR

3.2.8  Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.9  Kít tách chiết ARN

3.2.10  Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit)

3.2.11  Kít nhân gen (Realtime RT-PCR)

3.2.12  Cặp mồi (primers) realtime RT-PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược

3.2.13  Đoạn Dò (Probe)

3.2.14 Thang chuẩn ADN (Ladder)

3.3  Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào

3.3.1  Thuốc khử trùng: Virkon 1%

3.3.2  PBS 1X (Phosphate Buffered Saline)

3.3.3  Kháng sinh Penicillin

3.3.4  Kháng sinh streptomycin

3.3.5  Môi trường L-15 (L-15 Leibovitz medium)

3.3.6  FBS (Fetal bovine serum)

3.3.7  Glutamine

3.3.8  Dòng tế bào EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini)

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1  Tủ lạnh

4.1.2  Tủ âm sâu

4.1.3  Cân phân tích có thể cân chính xác 0,1 mg

4.1.4  Pipet đơn kênh các loại

4.1.5  Ống đong, dung tích 100ml; 500ml; 1000ml

4.1.6  Máy ly tâm

4.1.7  Lò vi sóng

4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT- nested PCR và realtime RT- PCR

4.2.1  Máy nhân gen PCR

4.2.2  Máy nhân gen Realtime PCR

4.2.3  Máy lắc trộn vortex

4.2.4  Máy spindown

4.2.5  Khay đựng đá lạnh

4.2.6  Bộ khuôn và lược đổ thạch

4.2.7  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.2.8  Máy đọc gel

4.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

4.3.1  Đĩa nuôi cấy 24 giếng (hoặc dĩa nuôi cấy 96 giếng)

4.3.2  Chai nuôi cấy

4.3.3  Màng lọc

4.3.4  Tủ ấm lạnh

4.3.5  Kính hiển vi soi ngược

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Dịch tễ học

Hầu hết các loài thuộc họ cá chép đều mẫn cảm với vi rút SVC (SVCV): cá chép (Cyprinus carpio carpio), cá koi (Cyprinus carpio koi), cá diếc (Carassius carassius), cá mè trắng (Hypophthalmichthys molitrix), cá vàng (Carassius auratus), cá mè hoa (Aristichthys nobilis), cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella). Ngoài ra đã phân lập được SVCV từ cá các loài cá khác: cá nheo châu Âu (Silurus glanis), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) và cá rô phi (Oreochromis niloticus).

Vi rút gây bệnh SVC lây truyền theo chiều ngang qua nguồn nước nhiễm vi rút, hoặc từ cá bệnh sang cá khỏe thông qua chất thải, các dịch sinh sản hoặc qua các vật trung gian (các loài ký sinh trùng hút máu như đỉa Piscicola geometra có mang vi rút). Sự lây truyền theo chiều dọc chưa được xác định mặc dù đã có công bố phân lập được SVCV từ dịch từ lỗ huyệt của cá chép.

Cá bị bệnh sống sót có thể mang vi rút lâu dài.

Sự bùng phát bệnh có liên quan lớn đến nhiệt độ nước, độ tuổi, tình trạng của cá, mật độ nuôi đặc biệt là yếu tố stress của cá. Bệnh có thể xuất hiện trong quá trình vận chuyển cá, mặc dù trước đó cá không có dấu hiệu lâm sàng của bệnh.

Hầu hết ở các giai đoạn của cá đều có thể bị nhiễm vi rút. Giai đoạn dễ mẫn cảm nhất với vi rút là cá giống và cá nuôi dưới 1 năm.

Các ổ dịch SVC thường xuất hiện ở nhiệt độ từ 11 °C đến 17 °C, bệnh hiếm khi xuất hiện ở nhiệt độ dưới 10 °C và tỷ lệ chết ở cá trưởng thành giảm khi nhiệt độ vượt quá 22 °C.

Tỷ lệ chết do SVC có thể đến 70 % nhưng thường từ 1 đến 40 %.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Dấu hiệu bệnh lý đầu tiên là cá bơi ở tầng mặt tụ thành đám ở rìa ao, mất thăng bằng, lờ đờ sau đó chết chìm xuống đáy.

Da có màu tối, mang nhợt nhạt, các tơ mang dính kết lại.

Xuất huyết điểm trên da, mang và ở mắt.

Có thể xuất huyết tràn lan trên da, gốc vây và hậu môn.

Máu loãng chảy ra từ hậu môn.

Cá chết đột ngột không thể hiện dấu hiệu bệnh lý, tỉ lệ chết cao.

5.3  Bệnh tích

Bụng chướng to, xoang bụng xuất huyết, tích dịch nhầy.

Cơ quan nội tạng phù, xuất huyết.

Bóng hơi teo dần một ngăn.

Ruột xuất huyết chứa đầy dịch nhầy.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

– Cá ≤ 4 cm: Lấy cả con từ 5 đến 10 con;

– Cá từ 4 đến 6 cm: Lấy não và toàn bộ phủ tạng từ 5 con đến 10 con;

– Cá lớn: Lấy gan, thận, lách và não từ 5 con.

Mẫu bệnh phẩm để phân lập vi rút trên môi trường tế bào phải được lấy vô trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong từng túi hay lọ vô trùng, bảo ở nhiệt độ 2 đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu. Nên sử dụng môi trường vận chuyển mẫu vi rút hay môi trường nuôi cấy tế bào có bổ sung kháng sinh để bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển.

Mẫu bệnh phẩm để làm phản ứng RT- nested PCR và real time RT PCR có thể sử dụng cố định trong cồn 90% theo tỉ lệ mẫu : cồn (1:10) hoặc mẫu tươi, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và chuyển đến phòng thí nghiệm trong 48 h sau khi lấy mẫu. Mẫu tươi chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong cồn etanol từ 96 % đến 100 % theo tỷ lệ mẫu : cồn (1:10) (3.1.1).

6.2  Phương pháp RT- nested PCR

6.2.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu (Theo 6.1)

6.2.2  Chuẩn bị mẫu

Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg.

Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) (3.1.2), để tạo thành huyễn dịch 10 %.

Mẫu được chia thành hai phần: một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ ở tủ âm (-80 °C).

6.2.3  Cách tiến hành

6.2.3.1  Tách chiết RNA

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.9) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ Dụ: Sử dụng kít chiết tách InviMAG®Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96 Cat hoặc Taco RNA/DNAkit hoặc Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA (Phụ lục B).

6.2.3.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT- nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/SVC R2 ở bước 1 và cặp mồi SVC F1/ SVC R4 ở bước 2 để phát hiện vi rút SVC, (xem phụ lục E, Bảng E.1).

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 pmol/µL làm gốc.

Mồi (3.2.1) được sử dụng ở nồng độ 20 µmol/pL: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (20 µl mồi gốc và 80 µl nước).

6.2.3.3  Tiến hành phản ứng RT-nPCR

Bước 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR sử dụng cặp mồi SVC F1 /SVC R2, (xem phụ lục E).

Bước 2: Thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/ SVC R4, (xem phụ lục E).

6.2.2.3  Chạy điện di

6.2.2.3.1  Chuẩn bị bản gel

Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose (3.2.2) bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) trong bình thủy tinh, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khuôn (4.2.6) đã được cài lược, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm. Khi bản thạch đông, gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.7) đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain[1]) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.2.2.3.3  Điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.5) vào 8 µl sản phẩm RT – nested PCR (bước 2) trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) vào một giếng trên bản gel.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.7), ở hiệu điện thể 100 V trong thời gian 20 đến 30 min.

6.2.2.3.4  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.2.8).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

– Đối chứng âm có kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại);

– Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vệt sáng rõ có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp.

Với điều kiện phản ứng trên

Mẫu xét nghiệm âm tính khi:

– Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

– Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

– Tại giếng của mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 714 bp và 606 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 606 bp;

– Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể chỉ phát hiện được sản phẩm của bước hai 606 bp.

6.3  Tiến hành phản ứng realtime RT – PCR

6.3.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu (Theo 6.1)

6.3.2  Chuẩn bị mẫu (Theo 6.2.2)

6.3.3  Cách tiến hành

6.3.3.1 Tách chiết RNA (Theo 6.3.3.1)

6.3.3.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp realtime RT-PCR sử dụng cặp mồi SVC-F / SVC-R (3.2.12), dò SVCV (3.2.13) để phát hiện vi rút SVC. Trình tự cặp mồi và đoạn dò (xem phụ lục F, Bảng F.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

– Mồi (3.2.12) và dò (3.2.13) ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

– Mồi được sử dụng ở nồng độ 10 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước tinh khiết không có nuclease).

– Đoạn dò được sử dụng ở nồng độ 5 µM (5 µl mồi gốc và 95 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.3.3.3  Tiến hành phản ứng Realtime RT PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy rcaltime PCR (4.2.2) theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của SVCV, sử dụng cặp mồi (3.2.12) và đoạn dò (3.1.13) đã được chuẩn bị và kít nhân gen (3.2.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục F).

6.3.3.4  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

– Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct);

– Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ± 2.

Với điều kiện phản ứng như trên:

– Mẫu dương tính khi có giá trị Ct < 35;

– Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct;

– Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ THÍCH:

– Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả;

– Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

– Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.4  Phân lập vi rút SVC trên môi trường tế bào

6.4.1  Chuẩn bị tế bào một lớp

Chuẩn bị tế bào EPC (3.3.8) một lớp trên đĩa 24 giếng hay 96 giếng (4.3.1) hoặc chai nuôi tế bào 25 cm² (4.3.2) ở 22 °C đến 25 °C khoảng 48 h trước khi thực hiện quá trình phân lập vi rút. Mật độ tế bào nuôi cấy với đĩa 24 giếng là khoảng 420.000 tế bào/ giếng (mỗi giếng chứa 1,5 ml môi trường nuôi cấy tế bào); với đĩa 96 giếng là 62.500 tế bào/ giếng (mỗi giếng chứa 150 µl môi trường nuôi cấy tế bào); chai 25 cm² là 3.000.000 tế bào/chai (5ml môi trường nuôi cấy tế bào/chai). Thành phần môi trường tế bào (xem Phụ lục C). Sau 2 ngày, tế bảo phủ đều khoảng 80 đến 90% diện tích đáy chai hay giếng nuôi cấy tế bào, môi trường nuôi cấy tế bào trong, mầu đỏ cam là đạt yêu cầu.

6.4.2  Môi trường phân lập vi rút

Môi trường phân lập vi rút phải được chuẩn bị trước, lượng môi trường chuẩn bị căn cứ vào số mẫu cần phân lập vi rút. Thành phần môi trường phân lập vi rút SVC (xem Phụ lục D).

6.4.3  Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phải được xử lý và tiến hành nuôi cấy trên môi trường tế bào trong vòng 48 h sau khi lấy mẫu

Nghiền mẫu bệnh phẩm trong môi trường phân lập vi rút, tạo thành huyễn dịch có độ pha loãng 1/10 (0,1 g/1 ml)

Pha loãng mẫu bệnh phẩm:

– Ly tâm huyễn dịch mẫu bệnh phẩm (có nồng độ pha loãng 1/10) với tốc độ 2.000 đến 4.000g trong 15 min, ở 4°C;

– Thu dịch trong phía trên và lọc qua màng lọc 0,45 pM (4.3.3). Tiến hành pha loãng với môi trường phân lập vi rút để tạo ra huyễn dịch có nồng độ 1/100.

Bảo quản mẫu và mẫu đã pha loãng ở âm 80 °C để có thể tiếp tục gây nhiễm tế bào ở lần sau.

LƯU Ý: Thực hiện xử lý mẫu trên đá lạnh.

Hệ thống đối chứng: Đối chứng âm (đối chứng tế bào): Chỉ gồm tế bào và môi trường phân lập vi rút.

6.4.4  Gây nhiễm vi rút từ mẫu trên tế bào một lớp EPC

Loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trong đĩa 24 giếng (4.3.1).

Gây nhiễm vi rút với 02 nồng độ (1/10; 1/100) lên tế bào một lớp EPC (3.3.8) đã được nuôi cấy trên đĩa 24 giếng (4.3.1), lượng dung dịch vi rút được gây nhiễm là 150 µl/giếng với từng nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ được lặp lại 02 lần. Tiến hành ủ 1 h ở nhiệt độ 15 °C sau đó bổ sung vào mỗi giếng 1,5 ml môi trường phân lập vi rút (Lưu ý: thực hiện với giếng chứa hệ thống đối chứng âm trước, tiếp theo từ giếng có nồng độ vi rút thấp đến nồng độ cao). Nồng độ pha loãng vi rút cuối cùng là 1/100; 1/1000.

Chuyển đĩa 24 giếng đã nhiễm vi rút vào tủ ấm lạnh (4.3.4) và ủ ở nhiệt độ 22 °C đến 25 °C.

Theo dõi sự xuất hiện bệnh lý tế bào (cytopathic effect -CPE) sau 2 ngày gây nhiễm dưới kính hiển vi soi ngược (4.3.5) với vật kính 4X và 10X.

CPE do SVCV trên môi trường tế bào EPC: lúc đầu tế bào co cụm sau đó phồng to hơn và bong khỏi lớp tế bào.

Tiếp tục theo dõi bệnh lý tế bào đến 10 ngày sau khi gây nhiễm, nếu xuất hiện bệnh lý tế bào (CPE) tiến hành thu dịch tế bào có chứa vi rút đem ly tâm 2.000 đến 4.000 g (4.1.6) trong 15 min, ở 4°C.

Thu dịch trong, tách chiết RNA và thực hiện phản ứng RT-PCR hoặc Realtime RT-PCR để xác nhận sự hiện diện của vi rút.

Nếu không xuất hiện CPE, thu hồi huyễn dịch tế bào bằng cách hút dịch tế bào và tế bào đơn lớp bám ở đáy giếng ở các nồng độ (1/10; 1/100) của cùng 1 mẫu vào ống ly tâm 15 ml ly tâm 2.000 đến 4.000g (4.1.6) trong 15 min. Hút dịch trong sau ly tâm (nồng độ gốc) tiến hành pha loãng tạo nồng độ (1/10) rồi tiếp tục nhiễm lên tế bào một lớp EPC (3.3.8) mới trên đĩa 24 giếng (4.3.1). Có thể nhiễm 1 đến 2 lần cấy truyền từ huyễn dịch tế bào của lần cấy truyền thứ nhất. Nếu không có CPE sau 3 lần cấy truyền mẫu được xem là âm tính.

CHÚ THÍCH: Với điều kiện nhiệt độ tại nước ta nên thay môi trường phân lập tế bào định kỳ, điều này sẽ tránh sự phát triển quá mức của tế bào trong quá trình phân lập.

6.4.5  Đánh giá kết quả

Kiểm tra hệ thống đối chứng âm (đối chứng tế bào): Tể bào phát triển tốt, không có CPE.

Mẫu âm tính là mẫu sau 3 lần cấy truyền không có CPE.

Mẫu dương tính là mẫu có CPE và có kết quả dương tính vi rút SVC bằng kỹ thuật RT-PCR hoặc realtime RT-PCR.

7. Kết luận

7.1  Ở những vùng lần đầu tiên phát hiện được bệnh SVC

Cá được xác định là mắc bệnh SVC lần đầu tiên tại một vùng khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của bệnh, phân lập vi rút SVC từ bệnh phẩm trên môi trường tế bào đồng thời kết quả giám định vi rút bằng phương pháp RT – nested PCR/ realtime RT- PCR là dương tính.

7.2  Ở những vùng đã có sự lưu hành của vi rút SVCV

Cá được xác định là mắc bệnh SVC khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và có kết quả phát hiện vi rút bằng phương pháp RT- nested PCR/ Realtime RT-PCR dương tính.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.2.1  Thành phần

– Natri clorua (NaCI)                                               8 g

– Natri hydro photphat dihydrat (Na₂HPO₄.2H₂O)      2,9 g

– Kali dihydro photphat (KH₂PO₄)                            0,2 g

– Kali clorua (KCI)                                                  0,2 g

– Nước cất                                                            1000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B.1  Chuẩn bị hóa chất

VÍ DỤ: Bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit, Cat. No: 12280-050.

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

– Proteinase K;

– Dung dịch đệm Lysis Buffer;

– Dung dịch Carrier ARN;

– Dung dịch Wash buffer (W5);

– Nước RNAse-free (E3);

Cách pha hỗn hợp dung dịch Carrier và Lysis Buffer

N x 0.21 mL = A mL

A mL x 28 µL/mL = B µL

Trong đó:

– N là số mẫu cần tách chiết;

– A là tổng số mL Lysis Buffer cần cho N mẫu;

– B là tổng số µL Carrier ARN cần cho N mẫu.

B.2  Tiến hành

1. Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml.
2. Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K.

(Nếu thể tích mẫu <200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch đệm phosphat PBS hoặc 0.9% NaCl).

3. Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier ARN vào ống chứa mẫu, đóng nắp ống và vortex 15 s.
4. Ủ mẫu ở 56°C trong 15 min.
5. Cho thêm 250 µL cồn 96 – 100 % vào ống mẫu, đóng nắp và vortex 15s.
6. Để ở nhiệt độ phòng 5 min.

(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).

7. Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc.
8. Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.
9. Cho 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc, ly tâm 12.000 vòng trong 2 đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.
10. Lặp lại bước 9 với 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa.
11. Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới.
12. Ly tâm khô 12000v trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5.
13. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL.
14. Cho 10 đến 50 µL nước ARNse-free (E3) (có sẵn) vào cột lọc.
15. Để ở nhiệt độ phòng 1 min, ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong 1 đến 2 min.
16. Lấy sản phẩm dưới cột lọc, Bảo quản ARN ở nhiệt độ âm 80 °C.

CHÚ THÍCH: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh SCV.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy tế bào EPC

C.1  Môi trường có thành phần cơ bản là môi trường L-15 Leibovitz:

– L-15 Leibovitz medium;

– 2mM Glutamine;

– 10% (v/v) foetal bovine serum, (FBS);

– 100IU penicillin/100µg streptomycin per ml hay 50µg/mL Gentamycin.

C.2  Môi trường có thành phần cơ bản là Minimum Essential Medium (MEM)

– MEM (Earles);

– 2mM Glutamine;

– 1% Non Essential Amino Acids (NEAA);

– 120 mg/L Sodium Pyruvate;

– 10% (v/v) foetal bovine serum (FBS);

– 100IU penicillin/100µg streptomycin per mL hay 50µg/mL Gentamycin.

 

Phụ lục D

(Quy định)

MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP SVCV TRÊN TẾ BÀO EPC

D.1  Môi trường có thành phần cơ bản là môi trường L-15 Leibovitz:

– L-15 Leibovitz medium;

– 2mM Glutamine;

– 2% (v/v) foetal bovine serum, (FBS);

– 100IU penicillln/100µg streptomycin per mL hay 50µg/mL Gentamycin.

D.2  Môi trường thành phần cơ bản là môi trường Minimum Essential Medium (MEM):

– MEM (Earles);

– 2mM Glutamine;

– 1% Non Essential Amino Acids (NEAA);

– 120 mg/L Sodium Pyruvate;

– 2% (v/v) foetal bovine serum (FBS);

– 100IU penicillin/100µg streptomycin per mL hay 50µg/mL Gentamycin.

 

Phụ lục E

(Quy định)

Phát hiện vi rút gây bệnh xuất huyết mùa xuân bằng phương pháp RT- nested PCR

E.1  Mồi của phương pháp RT- nested PCR

Bảng E. 1 – Trình tự các cặp mồi^[6]

Mồi	Trình tự nucleotit	Kích thước sản phẩm, bp
SVC F1	5’-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR*-R*TC-3’	714
SVC R2	5’-AGA-TGG-TAT-GGA-CCC-CAA-TAC-ATH*-ACN*-CAY*-3’
SVC F1	5’-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR*-R*TC-3’	606
SVC R4	5’-CTG-GGG-TTT-CCN*-CCT-CAA-AGY*-TGY*-3’

CHÚ THÍCH: (*) sử dụng theo bảng mã IUB;

R là G hoặc A;

H là A hoặc T hoặc C;

N là G hoặc A hoặc T hoặc C;

Y là T hoặc C.

E.2  Thực hiện phản ứng RT- nested PCR

Bước 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR sử dụng cặp mồi SVC F1 /SVC R2

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng E.2) và chu trình nhiệt (xem Bảng E.3)

VÍ DỤ: RT-PCR dùng kít nhân gen Superscript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^® Taq DNA Polymerase .Cat: 12574-026[2]⁾

Bảng E. 2 – Thành phần của phản ứng RT- PCR và chu trình nhiệt

Thành phần	Nồng độ	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/ ADN		7,5
2X Reaction Mix		12,5
Mồi SVC F1	20 µM	0,5
Mồi SVC R2	20 µM	0,5
Enzyme Taq Mix		1,0
Tổng thể tích		22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

– Mẫu kiểm chứng dương: Cho 3 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng SVC chuẩn;

– Mẫu kiểm chứng âm: Cho 3 µl nước tinh khiết không có nuclease;

– Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng;

– Tiến hành phản ứng RT PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng E.3).

Bảng E. 3 – Chu trình nhiệt của phản ứng RT PCR

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Chu kỳ
50	30 min	1
94	2 min
94	15 s	40
55	30 s
68	1 min
68	5 min	1

Bước 2: Thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi SVC F1/ SVC R4:

– Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất;

– Lấy sản phẩm bước 1 để chuẩn bị cho phản ứng bước 2 – Nested PCR;

– Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng E.4) và chu trình nhiệt (xem Bảng E.5).

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)[3]⁾.

Bảng E. 4 – Thành phần của phản ứng nested PCR

Thành phần	Nồng độ gốc	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/ADN		9
PCR Master Mix (2X)		12,5
SVC F1	20 µM	0,5
SVC R4	20 µM	0,5
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng		22,5

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng sau đó cho thêm:

– Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu RNA từ mẫu đối chứng dương của bước 1;

– Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease;

– Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu sản phẩm từ bước 1.

Tiến hành phản ứng nested PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng E.5)

Bảng E.5 – Chu trình nhiệt của phản ứng nested PCR

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
95	2 min	01
95	30 s	30
55	30 s
72	60 s
72	10 m	01
Giữ ở 4 °C đến khi tắt máy

 

Phụ lục F

(Quy định)

Phát hiện vi rút gây bệnh xuất huyết mùa xuân bằng phương realtime RT-PCR

F.1  Trình tự đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) cho phản ứng realtime RT-PCR

Bảng F.1 – Trình tự đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) cho phản ứng realtime RT-PCR^[10]

Cặp mồi/ Đoạn dò	Tên mồi	Trình tự mồi từ đầu 5′ tới 3′	Kích thước sản phẩm, bp
Xuôi	SVC-F	TGC TGT GTT GCT TGC ACT TAT YT	81
Ngược	SVC-R	TCA AAC KAA RGA CCG CAT TTC G
Dò	SVCV	FAM-ATG AAG ARG AGT AAA CKG CCT GCA ACA GA-TAMRA

Thực hiện phản ứng realtime RT-PCR

Phương pháp realtime RT-PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của SVCV, sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.12) và kít nhân gen (3.2.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng F.2) và chu trình nhiệt (xem Bảng F.3)

VÍ DỤ: Superscript III Platinum^® one step qRT-PCR System, Cat.No: 11732-020[4]⁾

Bảng F.2 – Thành phần phản ứng realtime RT PCR

Thành phần	Nồng độ gốc	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có RNA/DNA		5,5
Dung dịch 2X Reaction Mix		12,5
Mồi SVCV-F	10 µM	0,5
Mồi SVCV-R	10 µM	0,5
Đoạn dò SVCV-p	5 µM	0,5
Enzyme		0,5
Mẫu RNA		5
Tổng thể tích		25

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

– Mẫu kiểm chứng dương: Cho 5 µl mẫu RNA đã được giám định hoặc sử dụng các chủng SVC chuẩn.

– Mẫu kiểm chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

– Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu RNA kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng real-time RT-PCR bằng máy nhân gen (4.2.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng F.3)

Bảng F.3 – Chu kỳ luân nhiệt đối real-time RT-PCR

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
50	15 min	01
95	2 min	01
95	15 s	40
60 (*)	30 s (Ghi nhận tín hiệu quang ở bước này)

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Alikin Y.S., Shchelkunov I.S., Shchelkunova T.I., Kupinskaya O.A., Masycheva V.I., Klimenko V.P. & Fadina VA. 1996. Prophylactic treatment of viral diseases in fish using native RNA linked to soluble and corpuscular carriers. J. Fish Biol., 49, 195-205.

[2] Aquatic Animal Diseases significant to Australia: Identification Field Guide 4th Edition

[3] BÉKÉSI L. & CSONTOS L. (1985). Isolation of spring viraemia of carp virus from asymptomatic broodstock carp, Cyprinus carpio L. J. Fish Dis., 8, 471-472

[4] Bùi Quang Tề và cộng sự. 2008., Bệnh học thủy sản.

[5] Magdy K.Soliman, Mohammed M. Aboelsa, Safinaz G. Mohamed, Walid D. Saleh. 2008. First record of Isolation and identification of Spring of carp virus from Oreochromis niloticus In Egypt, 1294-1300.

[6] OIE – Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2017, chương 2.3.9 – Spring viraemia of carp (SVC).

[7] Stone D.M., AhneW., Denham K.D., Dixon P.F., LIU C.T.Y., Sheppard A.M., Taylor G.R. & Way K. 2003. Nucleotide sequence analysis of the glycoprotein gene of putative spring viraemia of carp virus and pike fry rhabdovirus isolates reveals four genogroups. Dis. Aquat. Org., 53, 203-210.

[8] TCVN 8710 -7: 2012 Quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép.

[9] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn – Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[10] ZhlqinYue và cs, 2008. Development of a sensitive and quantitative assay for spring viremia of carp virus based on real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods.

[1]⁾ Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[2]⁾ Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[3]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

[4]⁾ Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.