TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12194-2-3:2018 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỰC VẬT – PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI TUYẾN TRÙNG DITYLENCHUS ANGUSTUS (BUTLER) FILIPJEV

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12194-2-3:2018

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỰC VẬT – PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI TUYẾN TRÙNG DITYLENCHUS ANGUSTUS (BUTLER) FILIPJEV

Procedure for identification of plant nematode – Part 2-3: Particular requirements for ditylenchus angustus (butler) filipjev

Lời nói đầu

TCVN 12194-2-3:2018 do Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật – Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12194 Quy trình giám định tuyến trùng gây bệnh thực vật gồm các phần sau đây:

– Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với tuyến trùng Nacobbus aberrans (Thorne) Thorne & Allen

– Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với tuyến trùng Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz) Steiner & Buhrer

– Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

 

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG GÂY BỆNH THỰC VẬT – PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI TUYẾN TRÙNG DITYLENCHUS ANGUSTUS (BUTLER) FILIPJEV

Procedure for identification of plant nematode – Part 2-3: Particular requirements for ditylenchus angustus (butler) Filipjev

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình giám định tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các phiên bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8597: 2010. Kiểm dịch thực vật – Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1  Tuyến trùng ký sinh thực vật (plant parasitic nematodes)

Những loài tuyến trùng chủ yếu sống trong đất và có quan hệ chặt chẽ với thực vật đang phát triển và trong các tàn dư, sản phẩm thực vật sau thu hoạch. Chúng cũng sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật bao gồm rễ, củ, thân, lá, hoa, quả và hạt của các thực vật đang phát triển.

3.2  Cardia (Cardia)

Cấu trúc cơ ở gốc của thực quản nối với ruột

3.3  Deirids (Deirids)

Một nhú cổ lớn, một dạng cấu trúc thụ cảm bên nằm gần vòng thần kinh.

3.4  Hemizonid (Hemizonid)

Cấu trúc có hình bán cầu nằm gần lỗ bài tiết phía bụng, nó có dạng một tấm sáng nằm dưới lớp biểu bì, trong cắt lát dọc dạng lồi hai cạnh và khúc xạ ánh sáng rất mạnh được nối giữa các bó thần kinh của hệ thần kinh trung ương.

3.5  Kitin (Kitin)

Chất xương, chỉ mức độ hóa xương.

3.6  Phasmids (Phasmids)

Những nhú đuôi bên được nối với tuyến trước đuôi bên, có chức năng cảm thụ hóa học.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm và các thiết bị sau:

4.1  Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 lần đến 40 lần (10x đến 40x).

4.2  Kính hiển vi có thước đo, có độ phóng đại 40 lần đến 1.000 lần (40x đến 1000x).

4.3  Máy ly tâm có thể vận hành từ 1.200 vòng/phút đến 3.000 vòng/phút.

4.4  Máy khuấy từ gia nhiệt có thể vận hành từ 50 vòng/phút đến 1700 vòng/phút.

4.5  Tủ định ôn có thể duy trì ở nhiệt độ âm 4 °C đến 50 °C.

4.6  Bình hút ẩm

4.7  Tủ ấm có thể duy trì ở nhiệt độ 5 °C đến 70 °C

4.8  Tủ lạnh có thể duy trì ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C

4.9  Bộ rây lọc tuyến trùng có đường kính mắt rây là: 5 µm, 25 µm, 40 µm, 63 µm, 75 µm, 150 µm, 250 µm, 700 µm, 1.000 µm, 1.200 µm, lưới lọc có đường kính mắt lưới 2 mm…

4.10  Dụng cụ thủy tinh: cốc thủy tinh thể tích 1.000 ml, 500 ml, 250 ml, 100 ml; chậu thủy tinh có dung tích 4 lít, chén thủy tinh 4 ml, đũa thủy tinh, đĩa petri, đĩa đồng hồ, pipet,..

4.11  Kim gắp tuyến trùng

4.12  Lam

4.13  Lamen

4.14  Khay men

4.15  Kim dầm mẫu

4.16  Giấy lọc

4.17  Túi ni-lông đựng mẫu

4.18  Máy xay mẫu

5  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

5.1  Kẽm sunphat (ZnSO₄) hoặc Magiê sunphat (MgSO₄) hoặc đường Saccaroza (C₁₂H₂₂O₁₁) (d=1,18 (g/ml))

5.2  Formaldehyde 40 % (CH₂O)

5.3  Glycerol (C₃H₈O₃)

5.4  Triethanolamine (C₆H₁₅NO₃)

5.5  Cồn 96 % (C₂H₅OH)

5.6  Nước cất (H₂O)

5.7  Parafin (C_nH2_n+2) hoặc sáp ong

5.8  Cao lanh (Al₂O₃.2SiO₂.2H₂O)

5.9  Keo dính tiêu bản

5.10  Vôi cục (CaO)

6  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

6.1  Lấy mẫu

6.1.1  Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước

Lấy mẫu theo TCVN 8597:2010.

6.1.2  Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng

6.1.2.1  Lấy mẫu đất

Điều tra ngẫu nhiên hoặc theo 5 điểm chéo góc. Tại mỗi điểm, tiến hành điều tra thu mẫu từ 3 cây đến 5 cây. Lấy mẫu đất tại các điểm điều tra ở độ sâu 15 cm đến 20 cm xung quanh vùng rễ cây bị bệnh. Số mẫu lấy quy định như sau:

< 100 m² lấy từ 4 mẫu đến 5 mẫu

100 m² đến < 500 m² lấy từ 10 mẫu đến 12 mẫu

500 m² đến < 1.000 m² lấy từ 20 mẫu đến 25 mẫu

1000 m² đến < 10.000 m² lấy từ 26 mẫu đến 40 mẫu

Diện tích > 1ha có thể lấy 45 mẫu đến 50 mẫu, sau đó mẫu ở từng khu vực có thể trộn với nhau dồn lại còn 25 mẫu.

6.1.2.2  Lấy mẫu cây

Chọn điểm điều tra tương tự phần thu thập mẫu đất (6.1.2.1).

Bộ phận cây trên mặt đất có thể cắt thành từng đoạn 20 cm đến 25 cm, cho vào túi ni-lông (4.17).

Rễ: cắt thành từng đoạn 20 cm đến 25 cm, cho vào túi ni-lông.

6.2  Bảo quản mẫu

Mẫu giám định được bảo quản như sau:

Các bộ phận tươi có triệu chứng nghi là bị tuyến trùng gây hại (thân, lá, hạt và rễ) được để trong các túi ni-lông (4.17) có lỗ thông khí, có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh (4.8) ở nhiệt độ khoảng 5 °C.

Mẫu đất được bảo quản bằng cách cho vào túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và để ở những nơi thoáng mát ở nhiệt độ phòng hoặc tốt nhất trong tủ mát nhiệt độ 12 °C đến 15 °C.

Dung dịch có tuyến trùng được tách ra từ bộ phận bị hại thường được định hình trong dung dịch bảo quản tuyến trùng (xem 8.1.1) để trong các lọ kín có dán nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 °C đến 10°C.

Tiêu bản lam phải có nhãn ký hiệu mẫu, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

7  Phát hiện và thu tuyến trùng

7.1  Ký chủ và triệu chứng

7.1.1  Ký chủ

Phạm vi ký chủ của loài này là các loài Oryza spp., bao gồm lúa và một số loài lúa dại. Leersia hexandra là ký chủ của loài này tại Madagascar (tham khảo phụ lục A).

7.1.2  Triệu chứng hại

Trong giai đoạn sinh trưởng từ cây con đến trỗ bông, triệu chứng chính là lá héo úa. Khi nhiễm tuyến trùng nhẹ, triệu chứng là những đốm trắng gián đoạn, đường kính nhỏ hơn 1 mm. Khi mật độ tuyến trùng tăng, các đốm này lớn lên và nhiều hơn, hợp nhất lại hướng từ gốc lá áp chót và phần dưới của lá mới xuất hiện. Ditylenchus angustus không ăn bề mặt bên trong của bẹ lá, nhưng hiếm khi có triệu chứng rõ ràng. Cùng lúc, các vùng bị biến màu sẽ biểu hiện một số vết màu nâu và xuất hiện màu nâu nhạt. Khi bị nặng, toàn bộ cây biểu hiện triệu chứng này. Nếu chồi nhiễm tuyến trùng đến giai đoạn ra hoa, bông sẽ còn lại một phần hoặc toàn bộ bông sẽ nằm trong bẹ lá. Bông trỗ ra ngoài có ít hạt, hạt sẽ lép và biến màu.

7.2  Tách lọc tuyến trùng

7.2.1  Tách lọc tuyến trùng từ các bộ phận của cây

7.2.1.1  Kiểm tra trực tiếp

Các bộ phận của cây (thân, lá, hạt và rễ) được rửa sạch. Chọn các bộ phận của cây có vết biến màu, biến dạng, cắt nhỏ (khoảng 0,5 mm) đặt vào đĩa petri (4.10). Thêm nước vào đĩa để giữ cho mẫu không bị khô. Đặt đĩa petri có mẫu dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần.

Dùng kim (4.15) dầm nhẹ mẫu và quan sát tìm tuyến trùng. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam kính (4.12) có giọt nước nhỏ, đậy nhẹ lamen (4.13) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại từ 40 lần đến 1.000 lần.

7.2.1.2  Phương pháp lọc tĩnh

Mẫu thực vật (thân, lá, hạt, và rễ) được rửa sạch, cắt thành những đoạn thật nhỏ (khoảng 0,5 mm). Đặt mẫu đã cắt lên trên rây (4.9) có đường kính mắt rây 75 µm và thêm nước vừa xâm xấp rây. Sau 24 giờ đến 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thủy tinh (4.10). Dùng pipet (4.10) hút lấy dung dịch thu được ở cốc thủy tinh cho vào đĩa đồng hồ (4.10) và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam kính (4.12) có giọt nước nhỏ, đậy nhẹ lamen (4.13) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại 40 lần đến 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.

7.2.1.3  Phương pháp ly tâm

Mẫu thực vật (thân, lá, hạt, và rễ) được rửa sạch, cắt thành từng đoạn 0,5cm, trộn đều và cân lấy 5 đến 10 gam (tùy theo lượng mẫu có). Thêm 250 ml nước sạch, nghiền nhỏ mẫu bằng máy xay mẫu (4.18). Lọc qua rây (4.9) có đường kính mắt rây 1200 µm, dùng vòi nước nhỏ rửa sạch từ phía trên xuống cho đến khi phần mẫu nghiền phía trên rây sạch. Thu phần nước phía dưới và thêm nước cho đủ 1 lít, khuấy đều.

Lấy 100 ml dung dịch thu được ở trên cho vào ống li tâm. Thêm 01 thìa cà phê bột cao lanh (5.8) vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy ly tâm (4.3) và ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút. Sau đó, bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch kẽm sunphat hoặc magiê sunphat hoặc đường saccaroza (5.1) (cao hơn ít nhất 1cm so với bề mặt của lớp cặn) và khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ phần dung dịch phía trên của ống ly tâm qua rây lọc có đường kính mắt rây 5 µm. Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc thủy tinh (4.10) và tiến hành kiểm tra tuyến trùng.

Dùng pipet (4.10) hút lấy dung dịch thu được ở cốc thủy tinh cho vào đĩa đồng hồ (4.10) và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam kính (4.12) có giọt nước nhỏ, đậy nhẹ lamen (4.13) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại 40 lần đến 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.

7.2.2  Tách lọc tuyến trùng từ đất

7.2.2.1  Phương pháp rây Cobb

Cân 100 gram đất cho vào chậu thủy tinh (4.10), cho thêm 2 lít đến 3 lít nước vào chậu thủy tinh và ngâm trong 1 giờ đến 2 giờ cho đất tan. Khuấy đều đất và nước, để lắng trong 10 giây. Sau đó lọc qua rây (4.9) có đường kính mắt rây 1.000 µm, rửa sạch rây và phần cặn trên rây. Dung dịch được thu vào chậu thủy tinh thứ 2. Bỏ phần cặn còn lại trên rây và trong chậu thủy tinh ban đầu. Quá trình này lặp lại 2 đến 3 lần nhằm loại bỏ cát, sạn, rác và đá.

Khuấy đều dung dịch đã thu được ở trên và tiếp tục lọc bằng rây có đường kính mắt rây 700 µm, dung dịch được thu vào chậu thủy tinh. Phần cặn trên rây được rửa sạch và cho vào cốc thủy tinh (4.10). Tiếp tục lọc dung dịch thu được ở chậu thủy tinh qua các rây có đường kính mắt rây 250 µm, 150 µm và 25 µm. Phần cặn trên rây cũng được rửa sạch và cho vào cốc thủy tinh. Riêng với rây 25 µm có thể lọc lại 3 đến 4 lần.

Nếu lượng nước thu được trong cốc thủy tinh quá đầy, để lắng trong 2 giờ và đổ bớt nước phía trên. Tiếp đó, chuyển dung dịch trên sang rây lọc tĩnh. Sau 24 giờ đến 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thủy tinh. Dùng pipet (4.10) hút lấy dung dịch thu được ở cốc thủy tinh cho vào đĩa đồng hồ (4.10) và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam (4.12) và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần đến 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.

7.2.2.2  Phương pháp phễu lọc Baermann cải tiến

Chuẩn bị khay (4.14) và lưới lọc (4.9) có đường kính mắt lưới 2 mm. Đặt lớp giấy lọc lên trên mặt lưới. Cân lượng đất cần kiểm tra (tối thiểu là 100 gam) và rải đều trên mặt giấy. Thao tác đặt giấy và rải đất phải thật nhẹ để tránh rách, thủng giấy lọc. Đổ nước theo mép khay sao cho nước vừa ướt đất. Sau 24 giờ đến 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thủy tinh (4.10) và kiểm tra dần bằng đĩa đồng hồ (4.10) dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam (4.12) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại 40 lần đến 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.

CHÚ THÍCH: Lưới lọc phải có chân hoặc quai (gác lên thành khay) để khi đặt trong khay, đáy của lưới lọc không chạm sát đáy khay.

7.2.2.3  Phương pháp ly tâm

Cân 100 gam đất vào cốc thủy tinh (4.10), thêm 250 ml nước, khuấy đều. Lọc qua rây (4.9) có đường kính mắt rây 1.200 µm, dùng vòi nước rửa kỹ phần trên rây, loại bỏ phần cặn còn lại trên rây. Thu phần nước dưới rây, thêm nước cho đủ 1 lít và khuấy đều.

Lấy 100 ml dung dịch thu được ở trên vào ống li tâm. Thêm 01 thìa cà phê bột cao lanh (5.8) vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy và ly tâm (4.3) với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch kẽm sunphat hoặc magiê sunphat hoặc đường saccaroza (5.1) (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn). Khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ dung dịch phía trên qua rây lọc có đường kính 5 µm. Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc thủy tinh (4.10).

Dùng pipet (4.10) hút lấy dung dịch thu được ở cốc thủy tinh cho vào đĩa đồng hồ (4.10) và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi (4.1) có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim (4.11) gắp tuyến trùng lên lam kính (4.12) và quan sát dưới kính hiển vi (4.2) có độ phóng đại 40 lần đến 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thủy tinh.

8  Giám định tuyến trùng

Giám định tuyến trùng bằng phương pháp quan sát các đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi (4.2) (độ phóng đại 40 lần đến 1.000 lần) đối với tiêu bản các cá thể tuyến trùng cái và đực trưởng thành.

8.1  Làm tiêu bản tuyến trùng giám định

8.1.1  Dung dịch bảo quản tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu ở 7.2 được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng trước khi tiến hành xử lý, làm tiêu bản tuyến trùng.

Bảo quản các dung dịch này trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín, ở nhiệt độ phòng và sử dụng không quá 10 ngày.

Để tiêu bản tuyến trùng giữ được hình dáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến trùng bằng nước nóng ở nhiệt độ 70 °C đến 80 °C trong 5 phút.

8.1.1.1  Dung dịch 1: Formalin 4 %

– Thành phần:

	Formaldehyde 40 %	10 ml
	Nước cất	90 ml
– Chuẩn bị: Hòa tan Formaldehyde trong nước.
8.1.1.2  Dung dịch 2: Formalin – glycerol (FG) – Thành phần:
	Formaldehyde 40 %	10 ml
	Glycerol	01 ml
	Nước cất	89 ml
– Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước.
8.1.1.3  Dung dịch 3: TAF – Thành phần:
	Triethanolamine	02 ml
	Formaldehyde 40 %	07 ml
	Nước cất	91 ml
– Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước.
8.1.2  Xử lý tuyến trùng
8.1.2.1  Dung dịch xử lý
– Dung dịch 1: + Thành phần:
	Cồn 96 %	20 ml
	Glycerol	01 ml
	Nước cất	79 ml

+ Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước.

– Dung dịch 2:

+ Thành phần

	Cồn 96 %	95 ml
	Glycerol	05 ml

+ Chuẩn bị: Hòa tan glycerol trong cồn.

Bảo quản các dung dịch này trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín, ở nhiệt độ phòng và sử dụng không quá 10 ngày.

8.1.2.2  Cách tiến hành

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thủy tinh (4.10) có chứa 0,5 ml dung dịch xử lý (dung dịch 1). Đặt chén này trong bình hút ẩm (4.6) đậy kín (bình hút ẩm có chứa 1/10 thể tích là cồn 96 % (5.5)). Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm (4.7) ở điều kiện nhiệt độ cố định 40 °C với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thủy tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch xử lý (dung dịch 2). Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thủy tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40 °C. Sau 2 giờ đến 3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thủy tinh cho gần đầy, lặp lại bước này 2 lần đến 3 lần. Tới khi chén thủy tinh chỉ còn lại glycerol có chứa tuyến trùng và có thể sử dụng làm tiêu bản cố định được.

Hoặc đặt chén thủy tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trong bình hút ẩm có chứa vôi cục (5.10). Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

8.1.3  Làm tiêu bản

Lấy lam kính (4,12) sạch và làm vòng paraphin hoặc sáp ong (5.7) (đường kính khoảng 1 cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng paraphin hoặc sáp ong. Dùng kim (4.11) gắp, gắp 5 cá thể tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch bảo quản) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen (4.13) và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho paraphin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo (5.9) bảo vệ.

8.2  Các đặc điểm hình thái giám định

8.2.1  Đặc điểm nhận dạng giống Ditylenchus

1. Có kim hút ………………………………………………………………………………………… 2

Không có kim hút ………………………………………………………….. không phải Ditylenchus

2. Phần trước của thực quản thường có dạng hình trụ. Thực quản (diều) gồm 3 phần: diều trước, diều giữa và diều sau (diều tuyến) …………………………………………………………. 3

Thực quản hình trụ hoặc 2 phần: diều trước hẹp, phần sau phình to ………………. không phải Ditylenchus

3. Con cái hình giun dài ………………………………………………………………………………4

Con cái phình to dạng túi hoặc bầu dục ………………………………… không phải Ditylenchus

4. Diều tuyến dạng củ hành hoặc dạng thùy, không kéo dài hoặc hơi phủ. Khung đầu yếu, kim hút mảnh, gốc kim hút nhỏ, đuôi hình nón, thon, nhọn ……………………………………….5

Diều tuyến dạng thùy, kéo dài chờm lên ruột, khung đầu rõ, kitin hóa mạnh, kim hút to, rõ, đuôi có các hình dạng khác ……………………………………….. nhau không phải Ditylenchus

5. Có một buồng trứng, nằm về phía trước. Lỗ sinh dục ở nửa sau cơ thể……………………..6

Buồng trứng đôi. Lỗ sinh dục khoảng giữa cơ thể hoặc hơi lùi về phía sau……….. không phải Ditylenchus

6. Con cái không sưng phồng. Collumella gồm có 4 hàng, mỗi hàng có 4 tế bào. Vây đuôi của con đực kéo dài không đến tận cùng đuôi ………………………………………………………….7

Con cái sưng phồng, Collumella có hơn 20 tế bào…………………….. không phải Ditylenchus

7. Kim hút mảnh, gốc kim hút nhỏ, dài khoảng 7 đến 11 µm và luôn nhỏ hơn 20 µm ………….. Ditylenchus

Không bao gồm các đặc điểm trên ………………………………………. không phải Ditylenchus

8.2.2  Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev là đối tượng kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam.

Đặc điểm hình thái chính để định loại đến loài:

Đặc điểm hình thái chung:

Tuyến trùng hình giun dài, mảnh, Vùng môi thấp. Khung đầu kitin hóa yếu. Kim hút mảnh, gốc kim hút nhỏ. Diều giữa phát triển yểu, cơ hóa và sau đó là sự dầy lên của vách ống thực quản. Đuôi hình nón, thon, nhọn. Con cái không phình to, có một buồng trứng. Lỗ sinh dục nằm ở nửa sau cơ thể. Collumella xếp thành 4 hàng, mỗi hàng có 4 tế bào. Có túi sau dạ con.

Đặc điểm hình thái tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev (Chi tiết như hình 1)

– Kích thước của tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

+ Con cái: L = 0,8 -1,20 mm; a = 50 – 62; b = 6 – 9; c = 18 – 24; V = 78 – 80 %; kim hút = 10 -11 µm.

+ Con đực: L = 0,7 – 1,18 mm; a = 40 – 55; b = 6 – 8; c = 19 – 26; T = 60 – 73 %; gai giao cấu = 16-21 µm; gai đệm = 6-9 µm; kim hút = 10 µm.

+ Tuyến trùng non: L = 0,5 – 0,7 mm; a = 41 – 60; b = 6 – 9; c= 14 -18; kim hút = 8 -10 µm.

Trong đó:

n: Tổng số cá thể quan sát, đo đếm.

L: Tổng chiều dài cơ thể

a: Chiều dài cơ thể/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí lỗ sinh dục)

b: Chiều dài cơ thể/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản

c: Chiều dài cơ thể/chiều dài đuôi

V: Chiều dài cơ thể từ đỉnh đến lỗ sinh dục x 100/chiều dài cơ thể

T: Chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh hoàn x 100/chiều dài cơ thể

O: khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ mở tuyến thực quản lưng

Con cái: Cơ thể dài, mảnh, gần như thẳng hoặc hơi cong về phía bụng khi xử lý bằng nhiệt. Lớp biểu bì có vòng ngang mịn, rộng khoảng 1 µm ở khoảng giữa cơ thể. Môi thấp, bằng. Khung đầu kitin hóa yếu, chia 6 thùy. Khi nhìn thẳng có 6 môi gần bằng nhau. Có 4 đường bên, chiếm 1/4 độ rộng cơ thể hoặc nhỏ hơn. Các đường bên phía ngoài rõ hơn đường bên ở trong và kéo dài đến gần tận cùng đuôi. Deirids nằm ngay sau lỗ bài tiết. Phasmids nằm sát sau khoảng giữa đuôi, dạng chấm, rất khó quan sát. Kim hút nhỏ, phần nón yếu, dài khoảng 45 % chiều dài kim hút. Gốc chân kim hút nhỏ, rõ, mặt trước vát về phía sau, hiếm khi hợp nhất với nhau, rộng khoảng 2 µm. Diều trước hình trụ, hẹp và nối liền diều giữa, dài khoảng 3 đến 3,6 lần chiều rộng cơ thể. Diều giữa hình ovan, van diều giữa rõ, nằm khoảng phía trước đến chính giữa. Eo thắt hẹp, hình trụ, dài 1,5 lần đến 1,9 lần chiều dài diều trước. Diều sau hình ca-la-vát; dài 27 µm đến 34 µm, chờm nhẹ lên ruột, chủ yếu về bên bụng, có 3 hạt nhân riêng biệt. Không có cardia. Vòng thần kinh rõ rệt, nằm khoảng 21 µm đến 35 µm sau diều giữa. Lỗ bài tiết nằm khoảng 90 µm đến 110 µm từ đầu, hơi về phía trước phần bắt đầu diều sau. Hemizonid 3 µm đến 6 µm trước lỗ bài tiết. Lỗ sinh dục dạng khe ngang, ống âm đạo xiên, chiếm hơn 1/2 chiều ngang cơ thể. Túi chứa tinh, chứa tinh trùng to, tròn. Buồng trứng kéo dài phía trước. Trứng xếp thành 1 hàng đơn, hiếm khi thành hàng đôi. Túi sau dạ con dài khoảng 2 lần đến 2,5 lần chiều rộng cơ thể tại lỗ sinh dục, không có tinh trùng, kéo dài khoảng 1/2 đến 2/3 khoảng cách từ lỗ sinh dục đến lỗ hậu môn. Đuôi hình nón, dài 5,2 lần đến 5,4 lần chiều rộng cơ thể. Thon nhọn dần đến tận cùng đuôi giống như một mấu (gai).

Con đực: Hình thái tương tự như con cái. Có vây đuôi, hẹp ở một số mẫu, bắt đầu từ vị trí đối diện gần cuối gai giao cấu kéo dài đến gần tận cùng đuôi. Gai giao cấu đơn giản, cong về phía bụng. Gai đệm ngắn, đơn giản.

Tuyến trùng non: Đặc điểm chung về hình thái tương tự như con trưởng thành, nhưng khác về kích thước tuyến thực quản: dài hơn con trưởng thành.

Hình 1 – Tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

A: Con cái, B: Phần đầu con đực, C: Đầu nhìn từ đỉnh, D: Khung đầu, E: Phần cắt ngang cơ thể con cái, F: Đuôi con cái, G: Đường bên, H: Đuôi tuyến trùng non, I.J: Đuôi con đực, K: Lỗ sinh dục con cái.
(NGUỒN: D.R. Seshadri, D.R. Dasgupta, 1975)

9  Báo cáo kết quả

Mẫu giám định được kết luận là loài tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev khi các đặc điểm hình thái của mẫu giám định phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở mục 8.2.

Sau khi khẳng định kết quả giám định, người giám định hoặc cơ quan giám định trả lời kết quả bằng phiếu. Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin sau:

– Thông tin về mẫu giám định.

– Tên loài

– Phương pháp giám định

Phiếu kết quả giám định chi tiết có thể tham khảo phụ B.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

– Tên khoa học: Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

– Tên tiếng Việt: Tuyến trùng tiêm đọt sần lúa

– Vị trí phân loại:

Ngành: giun tròn (Nematoda)

Bộ Rhabditida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ Anguinidae

Giống Ditylenchus

Loài D. angustus

A.2  Phân bố

Trong nước: chưa có ở Việt Nam

Châu Á: Băng-la-đét, Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a, Pa-ki-xtan, Phi-líp-pin, Thái Lan;

Châu Phi: Ai Cập, Ma-đa-ga-xca, Xu-đăng

A.3  Ký chủ

Phạm vi ký chủ của loài này là các loài Oryza spp., lúa và một số loài lúa dại. Bao gồm cây trồng thuộc họ Poaceae: Echinochloa colona (cỏ lồng vực cạn), Leersia hexandra (cỏ lúa), Oryza (chi lúa), Oryza sativa (lúa), Sacciolepsis interrupta (cỏ bấc).

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan Bảo vệ và kiểm dịch thực vật	CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ***
………………………………….	…………., ngày……tháng…..năm 20….

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                                        Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN12194-2-3:2018, Quy trình giám định tuyến trùng gây bệnh thực vật. Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với với tuyến Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

13. Kết quả giám định:

Tên khoa học: với tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

Bộ: Rhabditida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Anguinidae

Giống: Ditylenchus

Loài: Ditylenchus angustus

Là đối tượng kiểm dịch thực vật thuộc danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

 

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bridge J, Luc M, Plowright RA, (1990). Nematode parasites of rice. In: Luc M, Sikora RA, Bridge J, eds. Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture. Wallingford, UK: CAB International, 69-108.

[2] CABI, (2017). Crop Protection Compedium

[3] Cuc NTT, (1982). Field soil as a source of rice stem nematodes. International Rice Research Newsletter, 7:15.

[4] Cuc NTT, Giang LT, (1982). Relative humidity and nematode number and survival in rice seeds. International Rice Research Newsletter, 7:14.

[5] Cuc NTT, Kinh DN, (1981). Rice stem nematode diseases in Vietnam. International Rice Research Newsletter, 6:14-15.

[6] Cuc NTT, Prot JC, (1992). Root-parasitic nematodes of deep-water rice in the Mekong Delta of Vietnam. Fundamental and Applied Nematology, 15(6):575-577; 14 ref.

[7] Dang-ngoc Kinh, (1981). Survival of Ditylenchus angustus in diseased stubble. International Rice Research Newsletter, 6(6):13.

[8] Dang-ngoc Kinh, Chau-Dieu Phuong, (1981). Reaction of some deepwater rice varieties to Ditylenchus angustus. International Rice Research Newsletter, 6(6):6-7.

[9] Dang-ngoc Kinh, Nguyen-thi Nghiem, (1982). Reaction of rice varieties to stem nematodes in Vietnam. International Rice Research Newsletter, 7(3):6-7.

[10] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests

[11] Sturhan D. and Brzeski M.W. (1991). Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. In: Manual of agricultural nematology (Ed. William R. Nickle). Marcel Dekker, INC. New York, USA, 423 – 464.

[12] Seshadri A.R. & Dasgupta D.R. (1975). Ditylenchus angustus. C. I. H. Description of plant parasitic nematodes, Set 5, No 64. CAB International, Wallingford, UK.

[13] Trịnh Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Yến, Dương Minh Tú, 2014. Xác định phân bố của hai loài tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev và Aphelenchoides nechaleos n.sp. trên lúa tại Việt Nam, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 4, trang 3-6.