TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5164:2018 (EN 14122:2014) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Hiệu lực: Còn hiệu lực

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 5164:2018

EN 14122:2014

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of vitamin B1 by high performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 5164:2018 thay thế TCVN 5164:2008;

TCVN 5164:2018 hoàn loàn tương đương với EN 14122:2014;

TCVN 5164:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chun quc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu bn soạn, Tng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công b.

 

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of vitamin B1 by high performance liquid chromatography

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải s dụng các vật liệu, thiết b và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác đnh kh năng áp dụng các gii hạn quy đnh trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định vitamin B1 trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) xử lý bằng enzym và dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cột. Phương pháp này được đánh giá xác nhận trong hai nghiên cứu liên phòng. Nghiên cứu thứ nht phân tích mẫu bột mì nguyên cám, sữa bột/sữa bột khô sấy phun, rau hỗn hp đông khô và gan lợn đông lạnh, từ 0,295 mg/100 g đến 0,807 mg/100 g. Nghiên cứu thứ hai phân tích các mẫu thức ăn dùng bng đường xông, thức ăn trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung hoa quả, nấm men, ngũ cốc, bột sô cô la và thực phẩm b sung từ 0,11 mg/100 g đến 486 mg/100 g. Vitamin B1 là tổng các phần khối lượng của thiamin bao gồm các dẫn xuất phosphoryl hóa.

Thông tin thêm về đánh giá xác nhận, xem Điều 8 và Phụ lục B.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối vi các tài liu viện dẫn không ghnăm công bố thì áp dụng phiên bn mới nht, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp th.

3  Nguyên tắc

Thiamin được chiết từ thực phm bằng cách thủy phân axit, sau đó dephosphoryl hóa bằng enzym và định lượng bằng HPLC có dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cột với thiochrom. Sử dụng chất ngoại chuẩn đ đnh lượng. Đ biết thêm thông tin xem [1] đến [7]

4  Thuốc thử

Ch sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước ít nhất đạt loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc nước ct hai lần, trừ khi có quy định khác.

4.1  Metanol, khối lượng w(CH3OH)  99,8 %, loại dùng cho HPLC.

4.2  Dung dch axit axetic, nng độ chc(CH3COOH) = 0,02 mol/l.

4.3  Isobutanol, w(C4H10O)  98 %.

4.4  Natri dihydro phosphat, w(NaH2PO4 99,8 %.

4.5  Dung dch axit clohydric, w(HCl= 36 %.

4.6  Dung dch axit clohydric, c(HCl= 0,1 mol/l.

4.7  Dung dch axit sulfuric, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

4.8  Natrl hydroxit, w(NaOH)  99 %.

4.9  Dung dịch natri hydroxit, nng độ khối lượng ρ(NaOH) = 150 g/l.

4.10  Dung dch natri hydroxit, ρ(NaOH) = 200 g/l.

4.11  Kali hexaxyanoferat III, wíK3[Fe(CN)6]ý  99 %.

4.12  Dung dịch kali hexaxyanoferat III, ρíK3[Fe(CN)6]ý = 10 g/l.

4.13  Dung dch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xut trước cột), ρíK3[Fe(CN)6]ý = 0,4 g/l.

Pha loãng 2,0 ml dung dịch kali hexaxyanoferat III (4.12) bằng dung dch natri hydroxit (4.9) đến 50 ml. Dung dịch nên được chun b trong ngày sử dụng.

4.14  Dung dch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất sau cột), ρíK3[Fe(CN)6]ý = 0,5 g/l.

Pha loãng 2,5 ml dung dch kali hexaxyanoferat III (4.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.10) đến 50 ml.

4.15  Enzym hoặc hỗn hp enzym, có khả năng giải phóng vitamin B1 từ thực phẩm không chứa thiamin tự do.

CHÚ THÍCH 1  D liệu về độ chụm nêu trong Bảng B.1, sử dụng Taka-Diatase từ Pfaltz và Bauer1). Đối với độ chụm nêu trong Bảng B.2 và Bảng B.3, sử dụng kết hợp enzym β-amytase từ lúa mạch và Taka-Diataza1) từ Serva.

CHÚ THÍCH 2  Nếu xảy ra hiện tượng dephosphoryl hóa không đầy đủ, thì có thể tiến hành định lượng riêng TMP (Thiamin Mono Phosphat), xem [7].

4.16  Dung dch natri axetat, c(CH3COONa.3H2O= 2,5 mol/l.

4.17  Dung dch natri axetat, c(CH3COONa.3H2O) = 0,5 mol/l.

4.1 Pha động HPLC

Các ví dụ về các hỗn hợp thích hợp với các phần th tích ví dụ từ 10 % đến 50 % metanol (4.1) trong nước hoặc sử dụng dung dịch đệm phosphat hoặc dung dch đệm axetat được nêu trong Phụ lục A và Phụ lục C. Khả năng sử dụng các tác nhân tạo cặp ion cũng được đưa ra.

4.19  Đm phosphat (pH = 3,5), c(KH2PO4) = 9,0 mmol/l.

4.20  Tetraetylamoniclorua, w(C8H20NCl 98 %.

4.21  Natri heptansulfonat, w(C7H15NaO3S)  98 %.

4.22  Đệm axêtat (pH = 4,0), c(CH3COOH) = 50 mmol/l.

4.23  Chất chuẩn

4.23.1  Thiamin clorua hydroclorua, w(C12H17ClN4OS.HCl 99 %.

Để hiệu chuẩn ngoài, xem 6.3.

4.23.2  Thiamin monophosphat clorua, w(C12H17ClN4O4PS)  98 %.

Để kiểm tra enzym, xem 6.2.2.

4.23.3  Thiamin pyrophosphat clorua (cocarboxylase), w(C12H19ClN4O7P2S) ≥ 98 %.

Đ kitra enzym, xem 6.2.2.

4.24  Dung dch gốc

4.24.1  Dung dch gốc thiamin clorua hydroclorua, ρ(C12H17ClN4OS.HCl) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác chất chun thiamin cloroa hydroclorua (4.23.1) trong một thể tích dung môi thích hợp đã xác định, ví dụ 10 mg chất chun vitamin B1 trong 100 ml dung dch axit clohydric (4.6). Dung dch này có th bảo quản được bốn tuần ở nhiệt độ + 4 °C.

4.24.2  Dung dch gốc thiamin monophosphat, ρ(C12H17ClN4O4PS) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác thiamin monophosphat clorua (4.23.2) trong một thể tích dung môi thích hợp đã xác định, ví dụ 10 mg thiamin monophosphat clorua trong 100 ml dung dch axit clohydric (4.6). Dung dch này có thể bảo quản được bốn tuần ở nhiệt độ – 20 °C.

4.24.3  Dung dch gốc thiamin pyrophosphat, ρ(C12H19ClN4O7P2S) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác thiamin pyrophosphat clorua (4.23.3) trong một th tích dung môi thích hợp đã xác định, ví dụ 10 mg thiamin pyrophosphat clorua trong 100 ml dung dch axit clohydric (4.6).

4.24.4  Kiểm tra nng độ thiamin clorua hydroclorua

Pha loãng 10 ml dung dịch thiamin clorua hydrodorua (4.24.1) bằng dung dịch axit clohydric (4.6) trong bình đnh mức 100 ml đến vạch. Đo độ hp thụ của dung dịch nà bước sóng tối đa 247 nm (A247) trong cuvet 1 cm dựa vào dung dịch axit clohydric (4.6) trong cuvet chun, sử dụng máy đo phổ UV (5.1). Tính nng độ khối lượng, ρ, bằng microgram trên mililit dung dch thiamin clorua hydroclorua (4.24.1), sử dụng Công thức (1):

Trong đó

e là hệ số hấp thụ phân tử của thiamin clorua hydroclorua ở bước sóng tối đa khoảng 247 nm. Giá trị là 14 200 l.mol-1.cm-1. Giá trị tính được từ hệ số tắt, = 421 trong HCl 0,1 mol/l [8], [7] và khối lượng phân tử = 337,21. Giá trị lấy đến bốn chữ số thập phân.
M là khối lượng phân tử, tính bằng gam trên mol (g/mol). Giá trị là 337,21.
A247 là giá trị hấp thụ của dung dịch thiamin clorua hydroclorua.

4.25  Dung dịch chuẩn

4.25.1  Dung dch chuẩn thiamin clorua hydroclorua, ρ(C12H17ClN4OS.HCl) ≈ 1 µg/ml đến 10 µg/ml

Dùng pipet ltừ 1 ml đến 10 ml dung dịch thiamin clorua hydroclorua (4.24.1) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dịch này có thể bảo quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 °C, ở nơi tối.

4.25.2  Dung dịch chun thiamin monophosphat, ρ(C12H19ClN4O4PS) ≈ 1 µg/ml đến 10 µg/ml

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch thiamin monophosphat (4.24.2) cho vào bình định mức 100 mvà pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dch này có thể bảo quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 °Cở nơi tối.

4.25.3  Dung dịch chuẩn thiamin pyrophosphat, ρ(C12H19ClN4O7P2S) ≈ 1 µg/ml đến 10 µg/ml

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch thiamin pyrophosphat (4.24.3) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dch này có thể bo quản được 1 tháng  nhiệt độ 4 °Cở nơi tối.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ th như sau:

5.1  Máy đo phổ UV, có thể đo độ hấp thụ  các bước sóng xác định (247 nm), với cuvet thích hợp, ví dụ chiều dài đường quang 1 cm.

5.2  Thiết bị hấp áp lực hoặc gia nhiệt

Dùng thiết bị hấp áp lực cho mục đích chiết, ví dụ như kiểu nồi hp áp lực, có bộ phận ghi nhiệt độ và áp suất, bộ phận đốt nóng bằng điện hoặc nồi cách thủy.

5.3  Hệ thng HPLC

Hệ thống HPLC gồm có bơm, bộ phận bơm mẫu, detector huỳnh quang có các bước sóng phát xạ 366 nm và kích thích 435 nm đã cài đặt, (xem Ph lục C) và hệ thống đánh giá như bộ tích phân.

5.4  Cột HPLC

5.4.1  Yêu cầu chung

Có thể sử dụng các cột hoặc c hạt có kích cỡ khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số tách phải phù hợp với vật liu sử dụng để đảm bảo các kết quả tương đương. Tiêu chí vận hành đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân giải đường nền của thiamin từ các cht gây nhiễu 2).

5.4.2  Trường hợp ôxy hóa trước cột

Cột phân tích, ví d như Lichropher® 60 RP Select B 2), cỡ hạt 5 µm, đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm.

5.4.3  Trường hợp ôxy hóa sau cột

Cột phân tích, ví dụ như Supelco® LC-18-DB 2), c hạt 5 µm, đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm.

5.5  Bộ lọc

Lọc pha động cũng như lọc dung dịch mẫu th qua màng lọc, ví dụ cỡ lỗ 0,45 µm trước khi sử dụng hoặc bơm sẽ kéo dài tui thọ của cột.

5.6  Bơm phản ứng sau cột và ống dẫn xuất, hệ thống phân phi thuốc th thích hợp là ống nối kiu chữ T và ống dẫn xut (ví dụ 10 m x 0,33 mm).

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn b mẫu th

Đng hóa mẫu thử. Nghiền nguyên liệu thô trong máy nghiền thích hợp và trộn lại. Cần thực hiện các biện pháp như làm nguội sơ bộ để tránh tiếp xúc với nhit độ cao trong thời gian dài.

6.2  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

6.2.1  Tách chiết

Cân một lượng mẫu thử thích hợp ví dụ từ 2 g đến 10 g, chính xác đến mg, cho vào bình nón. Thêm một th tích xác đnh từ 60 ml đến 200 ml dung dịch axit clohydric (4.6) hoặc dung dịch axit sulfuric (4.7). pH của dung dịch này không được lớn hơn pH = 2,0. Đậy nắp bình bằng mặt kính đồng hồ và hấp áp lực phần mẫu thử  121 °C trong 30 min hoặc làm nóng ở 100°C trong 60 min.

Dữ liu từ nghiên cứu BCR cho thy rằng có th áp dụng một dải rộng các điều kin đối với việc thủy phân bằng axit (nhiệt độ từ 95 °đến 130 °C, thời gian từ 15 min đến 60 min). Nhiệt độ cao hơn thì thời gian chiết ngắn hơn.

6.2.2  Xử lý bằng enzym

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, chnh pH của dịch chiết tối ưu cho hoạt động của enzym bằng dung dịch natri axetat (4.16) hoặc (4.17) và thêm một lượng thích hợp enzym hoặc hỗn hợp enzym (4.15) vào mẫu. Ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian và nhiệt độ tối ưu đối với enzym sử dụng. Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, dùng nước cất hoặc dung môi thích hợp khác để chuyển dung dch vào bình định mức và pha loãng đến thể tích xác định (Vts).

Đối với mỗi enzym sử dụng, cần kiểm tra pH tối ưu, nhiệt độ ủ và thời gian ủ.

Để đảm bảo khử phosphoryl hóa tối ưu, bước xử lý bằng enzym cần được kiểm tra bằng cách phân tích các mẫu đã thêm thiamin monophosphat clorua (4.23.2) hoặc thiamin pyrophosphat clorua (4.23.3) và vật liệu tương tự với mẫu thử. Vật liệu này phải là mẫu chun đã được chứng nhận.

Lượng thiamin có khả năng thêm vào từ enzym (4.15) cần được tính đến trong phần tính kết quả.

CHÚ THÍCH  Đ xác đnh dữ liệu về độ chụm trong Bảng B.1, Bng B.2 và Bng B.3, Taka-Diastase và Taka-Diastase kết hợp1) với β-amylase từ lúa mạch đã được sử dụng đã khử phosphoryl dưới các điều kiện sau đây. Dịch chiết đã được điều chỉnh đến pH = 4,0 và pH = 4,5 tương ứng, với dung dịch natri axetat (4.16) hoặc (4.17) và đã bổ sung 100 mg Taka-Diastase và 10 mg β-amylase trên gam mẫu. Hỗn hợp này được ủ  37 °C đến 45 °C trong 4 h đến 24 h, xem [5], [10] và [16].

6.2.3  Dung dịch mu thử

Lọc dung dịch mẫu (6.2.2) qua giấy lọc hoặc bộ lọc màng c lỗ 0,45 µm, nếu cần. Cũng có th sử dụng ly tâm. Đây là dung dch mẫu thử dùng cho quá trình oxy hóa (6.3.2 hoặc 6.3.3).

6.3  Oxy hóa thiamin thành thiocrom

6.3.1  Yêu cầu chung

Oxy hóa có thể được thực hitrước cột (6.3.2) hoặc sau cột (6.3.3).

6.3.2  Oxy hóa trước cột

6.3.2.1  Quy trình oxi hóa

Dùng pipet ly 1 ml mẫu thử đã xử  bằng enzym (6.2.3), dung dịch chuẩn (4.25.1) hoặc dung dch trắng ví dụ dung dch axit clohydric (4.6) hoặc dung dịch axit sulfuric (4.7) tùy thuộc vào việc sử dụng trong 6.2.1 cho vào bình cầu hoặc lọ thích hợp, thêm 1 mdung dch hexaxyanoferat kiềm (4.13). Lắc dung dch mẫu thử trong thời gian quy định (ví dụ: 10 s), để yên trong khoảng thời gian quy định (ví dụ: 1 min).

Đ loại bỏ các hợp chất gây nhiễu và bo v cột HPLC thì nên trung hòa dung dịch mẫu thử (ví dụ bằng H3PO4) hoặc tiến hành làm sạch bằng chiết pha rắn (xem thêm thông tin trong [5]).

Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch mẫu thử được bơm vào hệ thống HPLC pha đảo (6.3.2.2).

Cách khác, dung dịch đã oxy hóa có thể được chiết vào 1,5 ml isobutanol (4.2.3) và có thể bơm dịch chiết.

CHÚ THÍCH  Việc chuyển hóa thiamin thành thiocrom có th bị ức chế trong một số loại thực phẩm. Hiện tưng này thường gặp trong các thực phẩm chứa cacao, cũng có th thấy trong một s thực phẩm khác. Nếu nghi ngờ có hiện tượng này thì nên kim tra độ thu hồi của phương pháp bằng cách xử lý dịch chiết mẫu bng một thể tích thích hợp dung dch chuẩn thiamitrước phản ứng oxy hóa.

6.3.2.2  Nhận dạng bằng HPLC sau khi oxy hóa trước cột

Bơm các thể tích thích hợp giống nhau các dung dịch chuẩn (6.3.2.1), mẫu và mẫu trắng vào hệ thống HPLC. Nhận dạng thiocrom bằng so sánh thời gian lưu của các pic riêng lẻ trong sắc ký đ thu được từ dung dịch mẫu thử và dung dịch thử chuẩn. Vic thêm các cht chuẩn vào dung dịch mẫu thử cũng có thể nhận dạng được pic.

Việc tách và định lượng cho thy thỏa đáng nếu thực hiện theo các điều kiện thực nghiệm sau đây (xem thêm Hình A.1 và Phụ lục C v các điều kiện HPLC thay thế và ví dụ về sắc kí đồ).

Pha tĩnh: Lichrospher® RP Select B, 5 µm, 250 mm x 4,0 mm
Pha động: 40 phần thể tích metanol (4.1) và 60 phần thể tích đệm axetat (4.22)
Tốc độ dòng: 0,7ml/min
Thể tích bơm: 20 µl
Dertector: Huỳnh quang; bước sóng kích thích là 366 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm.

6.3.3  Trường hp ôxy hóa sau cột

6.3.3.1  Quy trình oxi hóa

Oxy hóa thiamin thành thiocrom sử dụng phản ứng sau cột với dung dch kali hexaxyanoferat kiIII (4.14). Thêm liên tục (ví dụ: 0,3 ml/min) thuốc thử dẫn xuất qua ống nối kiểu chữ T cho vào dịch rửa giải HPLC đ to thành thiocrom.

CHÚ THÍCH  Việc oxy hóa sau cột bị ảnh hưởng ví dụ bởi nng độ natri hydroxit. Các nng độ cao hơn trong dung dch dẫn xut có th được bù bởi tc độ bơm thp hơn và ngược lại.

6.3.3.2  Nhận dạng bằng HPLC sau oxy hóa sau cột

Bơm các th tích thích hợp ging nhau của các chuẩn thiamin chlorua hydrochlorua (4.23.1) cũng như các dung dịch mẫu (6.2.3) vào hệ thống HPLC. Xác định thiamin bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic riêng trong sắc ký đ thu được với dung dịch mẫu thử và với chuẩn (4.23.1). Thêm thiamin chlorua hydrochlorua vào dung dch mẫu thử cũng có thể nhận diện pic.

Việc tách và định lượng được cho thấy là thỏa đáng nếu tuân theo các điều kiện thí nghiệm sau (xem Phụ lục C và Hình A.2 đối với các hệ thống HPLC thay thế và các ví dụ về sắc ký đồ).

Pha tĩnh: Supelco® LC-18-DB, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm
Pha động: Metanol (4.2.1): đệm phosphat (4.2.19), chứa 1 g/l tetraetylamoni-clorua (4.2.20) và 5 mmol/l natri heptanesulfonat (4.2.21), (35:65)
Tốc độ dòng: 1,0 ml/min
Thể tích bơm: 20 µl
Thuốc thử sau cột: dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (4.2.14)
Tốc độ dòng thuốc thử: 0,ml/min
Detector: huỳnh quang; bước sóng kích thích là 368 nm; bước sóng phát xạ là 440 nm.

CHÚ THÍCH  Vic phân tích một số mẫu, ví dụ như thịt lợn nguyên liệu có thể có thêm pic của 2(1-hydroxyetyl) thiamin trong sắc ký đ xem Phụ lục D.

6.4  Phép xác định

Tiến hành xác định bằng ngoại chun sử dụng tích phân diện tích pic (nếu có th) hoặc xác định chiều cao pic (tùy chọn) của mẫu và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đi với thiocrom bằng cách sử dụng đường chuẩn. Kiểm tra độ tuyến nh của vic hiệu chuẩn.

7  Tính kết quả

Sử dụng đường chun hoặc sử dụng chương trình thích hợp của bộ tích phân hoặc sử dụng quy trình đã đơn giản hóa dưới đây. Tính khối lượng vitamin B1w, biểu th theo thiamin clorua hydroclorua, bằng mg/100 g mẫu, sử dụng Công thức (2):

Trong đó

Ats là diện tích pic hoặc chiều cao pic của thiocrom thu được với dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích;
Ast là diện tích pic hoặc chiều cao pic của thiocrom thu được với dung dịch thử chuẩn, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích;
Vts là thể tích dung dịch mẫu thử (6.2.2), tính bằng mililit (ml);
ρ là nồng độ khối lượng của thiamin clorua hydroclorua trong dung dịch chuẩn (4.25.1), tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);
ms là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g) (6.2.1);
100 là hộ số để tính hàm lượng trên 100 g;
1000 là hệ số chuyển đổi µg/100 g thành mg/100 g.

Báo cáo kết quả vitamin B1 bằng mg/100 g được biu thị theo thiamin clorua hydroclorua (M = 337,28). Nếu cần phải biểu th kết quả theo thiamin (C12H17N4OS, M = 265,37) thì nhân kết quả với h s 0,787, theo thiamin clorua (C12H17ClN4OS, M = 300,82) thì nhân kết quả với hệ s 0,892.

8  Độ chụm

8.1  Yêu cầu chung

Dữ liệu về độ chụm của phương pháp này dựa trên các phương pháp HPLC khác nhau áp dụng để xác định thiamin trong nghiên cứu so sánh quốc tế được tổ chức bi Chương trình của Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm và Đo chun thực hiện trên mẫu bột mì (CRM 121)/ sữa bột/sữa bột sy phun (CRM 421), rau hỗn hợp đông khô (CRM 485) và gan lợn đông lạnh (CRM 487). Nghn cứu cung cấp thông tin thống kê nêu trong Phụ lục B, Bảng B.1. Hơn nữa, dữ liệu về độ chụm bao gồm các kết quả nghiên cứu cộng tác của Pháp đối với mẫu thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn b sung hoa quả, men, ngũ cốc, bột sô cô la và thực phm bổ sung. Kết quả của nghiên cứu này được nêu trong Ph lục B, Bảng B.2 và Bảng B.3.

8.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giũa hai kết quả thử riêng r, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thi gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với thiamiclorua hydroclorua là:

Bột mì nguyên cám = 0,452 mg/100 g r = 0,043 mg/100 g
Sữa bột/sữa bột sấy phun = 0,645 mg/100 g r = 0,071 mg/100 g
Rau hỗn hợp đông khô = 0,295 mg/100 g r = 0,039 mg/100 g
Gan lợn đông lạnh = 0,807 mg/100 g r = 0,088 mg/100 g
Thức ăn dùng bng đường xông = 0,11 mg/100 g r = 0,02 mg/100 g
Thức ăn cho trẻ có bổ sung rau = 0,20 mg/100 g r = 0,05 mg/100 g
Sữa bột = 0,56 mg/100 g r = 0,1 mg/100 g
Thức ăn có bổ sung hoa quả = 1,04 mg/100 g r = 0,2 mg/100 g
Nm = 1,31 mg/100 g r = 0,34 mg/100 g
Ngũ cc = 1,42 mg/100 g r = 0,16 mg/100 g
Ngũ cốc = 2,95 mg/100 g r = 0,49 mg/100 g
Bột socola = 1,55 mg/100 g r = 0,36 mg/100 g
Thực phm bổ sung = 486 mg/100 g r = 111 mg/100 g

8.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử rng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liu thử giống ht nhau được phân tích bi hai phòng thử nghiệm, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá tr đối với thiamin clorua hydroclorua là:

Bột mì nguyên cám = 0,452 mg/100 g R = 0,190 mg/100 g
Sữa bộsữa bột sấy phun = 0,645 mg/100 g R = 0,243 mg/100 g
Rau hỗn hợp đông khô = 0,295 mg/100 g R = 0,178 mg/100 g
Gan lợn đông lạnh = 0,807 mg/100 g R = 0,623 mg/100 g
Thức ăn dùng bằng đường xông = 0,11 mg/100 g R = 0,1 mg/100 g
Thức ăn cho trẻ có bổ sung rau = 0,20 mg/100 g R = 0,12 mg/100 g
Sữa bột = 0,56 mg/100 g R = 0,25 mg/100 g
Thức ăn có bổ sung hoa quả = 1,04 mg/100 g R = 0,55mg/100 g
Nấm = 1,31 mg/100 g = 0,48 mg/100 g
Ngũ cốc = 1,42 mg/100 g = 0,75 mg/100 g
Ngũ cốc = 2,95 mg/100 g R = 1,16 mg/100 g
Bột socola = 1,55 mg/100 g R = 0,8 mg/100 g
Bột socola = 1,55 mg/100 g = 0,8 mg/100 g
Thực phm bổ sung = 486 mg/100 g = 212 mg/100 g

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm nên phù hợp với TCVN/ISO/IEC 17025 và ít nhất bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết đ nhận biết đầy đủ về mẫu;

b) phương pháp th đã sử dụng hoặc vin dẫn tiêu chun này;

c) ngày và thi gian lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả và các đơn vị kết quả biểu thị;

g) bt kỳ điểm đặc biệt nào quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các có thể ảnh hưởng tới kết quả.

 

Phụ lục A

(tham khảo)

Các ví dụ về sắc đồ HPLC

CHÚ DẪN

Y Huỳnh quang
X Thi gian (min)
1 thiamin trong chun, 0,02 µg/ml  6,620 min
2 thiamin trong gan lợn  6,616 min
3 thiamin trong thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh  6,619 min
4 thiamin trong cá tuyết  6,614 min
Pha nh: Gemini C18, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm (110 A)
Pha động: Metanol (4.1): nước pH 9 (40:60)
Tốc độ dòng: 0,8 ml/min
Thể tích bơm: 20 µl
Detector: Huỳnh quang: bước sáng kích thích là 366 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm.

Hình A1 – Ví dụ về tách thiamin bằng HPLC theo chuẩn thiocrom sử dụng dẫn xuất trước cột

CHÚ DẪN

Y Huỳnh quang
X thời gian (min)
Pha tĩnh: Purospher® RP C18, được đậy nắp ở cuối, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm
Pha động: Metanol (4.1): đệm phosphat, pH 3,5, c(NH4H2PO4) = 10 mmol/l, chứa 1 g/l tetraetylamoniclorua (420) và 5 mmol/l natri heptanesulfonat (4.21), (35:70)
Tốc độ ng: 1,5 ml/min
Thể tích bơm: 3 µl
Thuốc thử sau cột: dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (4.14)
Tốc độ dòng thuốc thử: 0,3 ml/min
Detector: Huỳnh quang: bước sóng kích thích là 365 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm.

CHÚ THÍCH  Sắc ký đồ bổ sung đối với thịt/gan nêu trong Phụ lục D

Hình A.2 – Ví dụ về tách chun thiamin bng HPLC sử dụng dẫn xuất sau cột trong rau diếp (a), cơm (b) và tht lợn luộc (c)

 

Phụ lục B

(tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Theo những chỉ dẫn nghiên cứu chứng nhận EU SMT, các dữ liệu đưa ra trong Bảng B.1 đã được xác định trong một phép th liên phòng thử nghiệm [10]. Viện nghiên cứu thực phm, Norwich, UK thay mặt cho Ủy ban EU tham gia nghiên cu này. Các dữ liệu đưa ra trong Bng B.2 và Bảng B.3 đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm của Pháp [5].

Bng B.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với bột mì thô, sữa bột/sữa bột sấy phun, rau hỗn hp đông khô và gan lợn đông khô

Mu

CRM 121

Bột mì thô

CRM 421

Sữa bột/sữa bột sấy phun

CRM 485

Rau hỗn hp đông khôa

CRM 487

Gan ln đông khô

Năm thử nghiệm liên phòng

1996

1996

1996

1996

Số phòng thử nghiệm

13

14

12

15

S lượng mẫu

2

2

2

2

Số lượng phòng thử nghim còn lại sau khi trừ ngoại l

13

14

12

15

Số ngoại l

0

0

0

0

Số kết quả được chấp nhận

65

70

58

72

Giá tr trung bình , mg/100 g

0,452

0,645

0,295

0,807

Độ lệch chuẩn lặp li, sr, mg/100 g

0,015

0,025

0,012

0,031

H số biến thiên lp lại, %

3,2

3,8

4,2

3,9

Giá trị lặp lr [r = 2,83 x sr], mg/100 g

0,043

0,071

0,039

0,088

Độ lệch chun tái lập, sR, mg/100 g

0,053

0,085

0,063

0,182

Hệ số biến thiên tái lập, %

11,8

13,2

13,3

22,6

Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR], mg/100g

0,190

0,243

0,178

0,623

Giá tr HorRat, theo [13]

0,9

1,1

1,0

1,9

a Hỗn hợp của ngô ngọt, cà rốt và cà chua khô (10:1:1)

CHÚ THÍCH  Dữ liệu thu được trong nghn cứu so sánh quốc tế này đã được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp đã được xác định giống với các quy trình kiđịnh định kỳ tại nhà của các phòng thí nghiệm tham gia với các hệ thống HPLC được mô tả trong Phụ lục C.

Bảng B.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn cho tr em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung hoa quả và nấm

Mu

Dung dch thức ăn trong chai

Thức ăn cho trẻ em

Sữa bột

Bột trộn trái cây

Nấm

Năm nghiên cứu

1995

1995

1995

1995

1995

Số phòng thử nghiệm

10

10

10

10

10

S lượng mẫu

1

1

1

1

1

Số lượng phòng thử nghim còn lại sau khi trừ ngoại l

8

10

10

10

10

Số ngoại l

2

0

0

0

0

Số kết quả được chấp nhận

16

20

20

20

20

Giá tr trung bình , mg/100 g

0,11

0,20

0,56

1,04

1,31

Độ lệch chuẩn lặp li, sr,

0,01

0,02

0,04

0,07

0,12

H số biến thiên lp lại, %

7 %

8 %

7 %

7 %

9 %

Giá trị lặp lr [r = 2,83 x sr], mg/100 g

0,02

0,05

0,1

0,2

0,34

Độ lệch chun tái lập, sR, mg/100 g

0,04

0,04

0,08

0,19

0,17

Hệ số biến thiên tái lập

32 %

21 %

16 %

19 %

13 %

Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR], mg/100 g

0,1

0,12

0,25

0,55

0,48

Giá tr HorRat, theo [13]

1,0

1,5

1,3

1,7

1,2

Bảng B.3 – Dữ liệu về độ chụm đối với ngũ cốc, bột sôcôla và thăn bổ sung

Mu

Ngũ cốc

Ngũ cốc

Bột sôcôla

Thức ăn bổ sung

Năm nghiên cu

1995

1995

1995

1995

Số phòng thử nghiệm

10

10

10

10

S lượng mẫu

1

1

1

1

Số lượng phòng thử nghim còn lại sau khi trừ ngoại l

9

9

9

9

Số ngoại l

1

1

1

1

Số kết quả được chấp nhận

18

18

18

18

Giá tr trung bình , mg/100 g

1,42

2,95

1,55

486

Độ lệch chuẩn lặp li, sr

0,06

0,18

0,13

39

H số biến thiên lp lại

4 %

6 %

8 %

8 %

Giá trị lặp lr [r = 2,83 x sr], mg/100 g

0,16

0,49

0,36

111

Độ lệch chun tái lập, sR, mg/100 g

0,27

0,41

0,28

75

Hệ số biến thiên tái lập

19 %

14 %

19 %

15 %

Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR], mg/100g

0,75

1,16

0,8

212

Giá tr HorRat, theo [13]

1,8

1,5

1,8

3,4 a

a Năm 1980, Horwitz et al, xubản đánh giá của 1000 so sánh liên phòng. T những nghiên cứu này, kết lun rng giá trị HorRat là 1, với giới hạn chấp nhận được trong khoảng 0,5 đến 2,0, cho thấy độ chính xác liên phòng là phù hợp. Sự tương ứng trong độ lệch chuẩn tương đối của phòng thí nghiệm cho thấy khoảng một nửa đến hai phần ba so với độ lệch chuẩn tương đối giữa các phòng thí nghiệm. Độ lệch liên tục từ tỷ lệ ở mặt dưới (giá trị < 0,3 hoặc 0,5) có thể cho thấy mức trung bình không được báo cáo hoặc được đào tạo tốt và có kinh nghiệm.

 

Phụ lục C

(tham khảo)

Hệ thống HPLC thay thế

Việc tách và định lượng được chứng minh là thích hợp nếu áp dụng các điều kiện về sắc ký như sau [10]:

Bảng C.1 – Điều kiện HPLC thay thế

Pha tĩnh

Kích tớc cột

mm x mm

Pha động

(V:V)

Sự tách sóng (Ex/Em)

nm

Lưu lượng

ml/min

Kiểu oxi hóa

Radial silica ®

10 µm

250 x 4,6

Etanol: dung dịch đệm phosphat pH = 7,4

c(K2HPO4) = 0,1 mol/l (50:50)

F: 365/435

3,0

PCa

Supelco ® LC-18-DB 5 µm

250 x 4,6

Metanol: dung dịch đệm phosphat pH = 3,c(K2HPO4= 9 mmol/l chứa tetraetylamoniumcloruaρ(C8H20NCl) = 1 g/l và natri heptansulfonat, c(C7H15NaO3S) = 5 mmol/l (35:65)

F: 368/420

1,0

PC

Lichrospher ® RP 18

5 µm

250 x 4,6

Metanol:natri haxansulfonat, c(C6H13NaO3S.H2O) = 1 mmol/l, pH = 3,0 (70:30)

F: 375/435

1,5

PC

Eurospher ® 100 -C18

5 µm

250 x 4,6

Natri dihydrophosphat, c(NaH2PO410 mmol/l): natri perclorat, c(NaClO4= 0,15 mol/l (50:50)

F: 375/435

1,0

PC

Lichrospher ® RP Select B 5 µm

250 x 4,6

Metanol:dung dịch đệm axetat pH = 4,0, c(CH3COONa) = 50 mmol/l (40:60)

F: 366/435

0,7

PRCb

µ-Bondapak ® radial C18 5 µm

250 x 4,6

Metanol:dung dịch đệm axetat pH= 4,5, c(CH3COONa) = 0,5 mml/l (40:60)

F: 366/435

0,8

PRC

Spherisorb ® ODS2

5 µm

250 x 4,6

Metanol:dung dịch đệm phosphat pH = 4,0, c(KH2PO4) = 0,1 mol/l (70:30)

F: 375/435

1,0

PRC

Lichrospher ® RP 18

10 µm

250 x 4,6

Kali dihydrophosphat, c(KH2PO4) = 10 mmol/l/dimetyl formamit (80:20)

F: 368:440

1,5

PRC

Hamilton ® PRP-1

5 µm

150 x 4,6

Metanol:nước (40:60); pH được điều chỉnh tới 4,5 bằng axit axetic

F: 366/435

1,0

PRC

Hamiton ® PRP-1

5 µm

150 x 4,1

Metanol:nước (35:65); pH = 9,0 được điều chỉnh bằng amoniac, w(NH3) = 25%

F: 366/435

1,0

PRC

Hypersil ® NH2APS 2

5 µm

250 x 4,6

Diclometan/metanol (95:5)

F: 365/440

1,0

PRC

a PC = Dẫn xut sau cột.

b PRC = Dn xuất trước cột.

 

Phụ lục D

(tham khảo)

Hợp chất vitamin B1: 2-(1-hydroxyetyl)thiamin (HET) thực hiện dẫn xuất sau cột

Thông thường, hàm lượng vitamin B1 được coi là thiamin và các dẫn xuất phosphat ca nó. Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp dẫn xuất sau cột có thể cho thấy hai pic cho thiamin và xác nhận chất chuyển hóa phụ 2- (1-hydroxyetyl) thiamin (HET) đã được hiển thị, xem [11] và [12] và xem hình D.1. Nếu sử dụng kỹ thuật dẫn xuất trước cột, thì hai hợp chất thiamin và HET đng rửa giải

Hàm lượng tương đối của HET được so sánh với thiamin phụ thuộc vào loại mẫu. Hàm lượng HET trong thịt và gan là 7% đến 23% hàm lượng thiamin. Trong nấm men, hàm lượng 3,8 %, trong khi  bp cải trắng, bông cải xanh, bột yến mạch, thức ăn công thức nh cho trẻ sơ sinh, sữa bột, bột sữa và bột mì, hàm lượng không dưới 2 %, xem [7].

Phép xác định định lượng vitamin B1 trong thực phẩm bằng dẫn xuất sau cột được khuyến nghị bao gồm việc xác định đnh lượng riêng thiamin và HET khi phân tích các mẫu thịt và đ kiểm tra các mẫu khác cho sự xuất hiện của HET trên sắc ký đồ.

CHÚ DN

 huỳnh quang

 thời gian (min)

 thiamin mono phosphat(TMP) trong gan ln  4,034 min

 thiamin trong gan lợn  10,138 min

  2-(1-Hydroxy Etyl) Thiamin (HET) trong gan lợn  11,741 min

4  TMP trong chun 4,034 min

 thiamin trong chun ở 10,044 min

 HET trong chu 11,613 min

CHÚ THÍCH  Thông tin v HPLC nêu trong [7].

Hình D.1 – Sắc ký đồ của chất chiết CRM 487 gan lợn (a) và chuẩn 0,1 µg/ml TMP (thiamin mono phosphat), 0,1 µg/ml thiamin và 0,01 µg/ml HET (2-(1-hydroxyetyl)thiamin) (b)

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] BOGNAR A. Bestimmung von Riboflavin und Thiamine in Lebensmitteln mit Hilfe der Hochleistungsflussigkeitschromatographie (HPLC). Dtsch. Lebensmitt. Rundsch. 1981, 77 pp. 431-436

[2] HASSELMANN C., FRANCK D., GRIMM P., DIOP P.A., SOULES C. High-performance liquid chromatographic analysis of thiamine and riboflavin in dietetic foods. J. Micronutr. Anal. 1989, 5 pp. 269-279

[3] BOGNAR A. Determination of vitamin B1 in food by High-Performance-Liquid-Chromatography and postcolumn derivatization. FreseniusJ. Anal. Chem. 1992, 343 pp. 155-156

[4] HAGG M., KUMPULAINEN J. Thiamine and riboflavin contents in domestic and imported cereal products in Finland. J. Food Compos. Anal. 1993, 6 pp. 299-306

[5] ARELLA F., LAH£LY S., BOURGUIGNON J.B., HASSELMANN C. Liquid chromatographic determination of vitamin B1 and B2 in foods. A collaborative study. Food Chem. 1996, 56 pp. 81-86

[6] EITENMILLER R.R., LANDEN W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C., 1999, pp. 271-97.

[7] JAKOBSEN J. Optimisation of the determination of thiamin, 2-(1-hydroxyethyl)thiamine, riboflavin in food samples by use of HPLC. Food Chem. 2008, 106 pp. 1209-1217

[8] DAWSON R.M.C., ELLIOTT D.C., ELLIOT W.H., JONES K. Data for Biochemical Research. Oxford Science Publication 3rd. ISBN 0 19 855299 8,1989

[9HAGG M. Effect of various commercially available enzymes in the liquid chromatographic determination with external standardization of thiamine and riboflavin in foods. J. AOAC Int. 1994, 77 pp. 681-686

[10] FINGLAS P.M., SCOTT K.J., WTTTHOFT C.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. The certification of the mass fractions of vitamins in four reference materials: Wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophilised mixed vegetables (CRM 485) and lyophilised pig’s liver (CRM 487). EUR-report 18320. Office for Official Publications of the European Communities, Luxembourg, 1999

[11TAKASHI U., YUKIKO T., KOHEI M., MARI T., KANAME K. Simultaneous determination of 2(1-hydroxyethyl)thiamine and thiamine in foods by high performance liquid chromatography with post-column derivatisation. Vitamins (Japan). 1990, 64 pp. 379-385

[12] TAKASHI U., YUKIKO T., KOHEI M., MASAKO M., KANAME K. Distribution and stability of 2(1-hydroxyethyl)thiamine and thiamine in foods. Vitamins (Japan). 1991,65 pp. 249-256

[13] HORWITZ W., ALBERT R. The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. J. AOAC Int. 2006, 89 pp. 1095-1109

[14] THOMPSON M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst (Lond.). 2000,125 pp. 385-386

[15] HORWITZ W., KAMPS L.R., BOYER K.W. Quality assurance in the analysis of foods and trace constituents. J. AOAC Int. 1980, 63 pp. 1344-1354

[16] OLLILAINEN V., FINGLAS P.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. Certification of B-Group Vitamins (B1, B2, B6, and B12) in Four Food Reference Materials. J. Agric. Food Chem. 2001,49 pp. 315-321

[17] TCVN ISO/IEC 17025:2007 (ISO/IEC 17025:2005), Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn



1) Taka-Diastase Nr. T00040 là n thương mại của sản phm được cung cp bởi Pfaltz & Bauer, Waterbury, CT 06708, Mỹ. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tu chun này và CEN không n định phải sử dụng chúng. Có th sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

 

2) Cột nhồi silica ph vật liệu thích hợp có bán sẵn là Lichrosorb® Si 60, Spherisorb® SI, Hypersil® SI và Lichrospher® 100 DIOL. Các cột RP bao gói vật liệu thích hp như Spherisorb® ODS, m-Bondapak® radial C18, Supelco® LC-18-DB và Hypersil® ODS. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chun này và CEN không n đnh phải sử dụng chúng.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5164:2018 (EN 14122:2014) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Số, ký hiệu văn bản TCVN5164:2018 Ngày hiệu lực
Loại văn bản Tiêu chuẩn Việt Nam Ngày đăng công báo
Lĩnh vực An toàn thực phẩm
Ngày ban hành
Cơ quan ban hành Tình trạng Còn hiệu lực

Các văn bản liên kết

Văn bản được hướng dẫn Văn bản hướng dẫn
Văn bản được hợp nhất Văn bản hợp nhất
Văn bản bị sửa đổi, bổ sung Văn bản sửa đổi, bổ sung
Văn bản bị đính chính Văn bản đính chính
Văn bản bị thay thế Văn bản thay thế
Văn bản được dẫn chiếu Văn bản căn cứ

Tải văn bản