TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11939:2017 VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHẢN ỨNG VỚI 2,2-DIPHENYL-1-PICRYLHYDRAZYL (DPPH)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11939:2017

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHẢN ỨNG VỚI 2,2-DIPHENYL-1- PICRYLHYDRAZYL (DPPH)

Foodstuffs – Determination of antioxidant activity by reaction with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

Lời nói đầu

TCVN 11939:2017 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2012.04 Antioxidant activity in food and beverages by reaction with 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH);

TCVN 11939:2017 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F6 Dinh dưỡng và thức ăn kiêng biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHẢN ỨNG VỚI 2,2-DIPHENY-1-PICRYLHYDRAZYL (DPPH)

Foodstuffs – Determination of antioxidant activity by reaction with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoạt độ của các chất chống oxy hóa trong thực phẩm và đồ uống bằng phản ứng với 2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH).

Phương pháp này không áp dụng đối với nền mẫu có lượng dầu và chất béo cao (> 50 % chất béo).

2  Nguyên tắc

Phương pháp này xác định hoạt độ của các chất chống oxy hóa của các loại thực phẩm bằng phản ứng với DPPH gốc bền. Các gốc DPPH tự do có độ hấp thụ cực đại mạnh tại bước sóng 517 nm và có màu đỏ tía. Quá trình chuyển màu đỏ tía sang vàng tương ứng với độ hấp thụ mol phân tử gốc DPPH tại bước sóng 517 nm giảm từ 9660 µM^-1 cm^-1 xuống 1640 µM^-1 cm^-1 khi electron tự do của gốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hóa và một nguyên tử hydro (tương đương hydrua) để tạo thành DPPH-H khử. Kết quả sự khử màu tỷ lệ đối với lượng hydrua tương đương được giữ lại.

Các hợp chất chống oxy hóa có thể tan trong nước, tan trong lipid, không tan hoặc bám vào thành tế bào. Như vậy, hiệu quả chiết là một yếu tố quan trọng trong việc định lượng các hoạt độ chống oxy hóa của thực phẩm. Tối đa hóa hiệu quả chiết bằng cách thêm trực tiếp dung dịch chuẩn DPPH vào mẫu, không cần chiết riêng rẽ. Các hợp chất chống oxy hóa được chiết liên tục từ các mẫu và lập tức phản ứng với DPPH cho đến khi quá trình chiết và phản ứng xảy ra hoàn toàn. Sau đó mẫu được lọc và xác định sự thay đổi độ hấp thụ. Hiệu chuẩn được thực hiện như mô tả dưới đây bằng cách so sánh với các dung dịch có nồng độ trolox đã biết.

Các mẫu và Trolox, một chất tương tự vitamin E được sử dụng làm chất chuẩn đối chứng, phản ứng với dung dịch DPPH trong metanol-nước trong 4 h ở 35 ºC đựng trong bình đặt trên giá của máy lắc vòng (4.3) và đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm. Lượng mẫu cần để phản ứng với một nửa DPPH được thể hiện bằng lượng Trolox tương đối đã phản ứng. Hoạt độ chống oxy hóa của mẫu được biểu thị bằng số micromol đương lượng Trolox (TE) trên 100 g mẫu.

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước đã khử ion hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Trolox, Axit (S)-(-)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametyl- chroman-2-carboxylic.

3.2  DPPH, 2,2′-Diphenyl-1-picrylhydrazyl.

CẢNH BÁO  Vì DPPH là chất mẫn cảm với da và đường hô hấp nên có thể gây dị ứng hoặc triệu chứng hen suyễn. Mang các dụng cụ bảo vệ thích hợp để tránh tiếp xúc với da và ngăn ngừa việc hít phải.

3.3  Metanol, loại dùng cho HPLC.

CẢNH BÁO  Metanol được sử dụng trong phương pháp này là một chất lỏng và chất bay hơi dễ cháy. Cần tránh lửa, tia lửa và tia phóng tĩnh điện, nhiệt và các chất oxy hóa. Metanol có thể gây tử vong hoặc gây mù lòa nếu nuốt phải và rất có hại nếu hít phải hoặc ngấm qua da.

3.4  Tinh bột ngô.

CẢNH BÁO  Khi thực hiện các hoạt động trong phòng thử nghiệm nên đeo kính bảo hộ, áo khoác, găng tay và giày bọc toàn chân. Tất cả các chất thải hóa học cần được xử lý phù hợp theo quy định.

3.5  Dung dịch thuốc thử

3.5.1  Dung dịch thuốc thử DPPH, 40 mg/l

Dùng cân (4.8) có đĩa cân bằng nhựa cân 80,0 mg DPPH. Chuyển định lượng DPPH vào bình định mức dung tích 2 lít (4.5) với 1 lít metanol (3.3). Bọc bình bằng giấy nhôm (4.15) để tránh ánh sáng. Dùng que khuấy từ (4.12) và khuấy ít nhất 20 min cho đến khi tất cả DPPH tan hoàn toàn. Sau đó, thêm 1 lít nước đã khử ion, trộn từ 10 min đến 20 min, thêm metanol đến vạch và khuấy tối thiểu 10 min. Chuyển vào chai thủy tinh (4.16) (dung tích 2 lít hoặc lớn hơn) đã được lắp cố định bộ phân phối (4.7) dung tích 50 ml. Bọc chai bằng giấy nhôm để tránh ánh sáng hoặc sử dụng thủy tinh quang hóa thấp. Dùng que khuấy từ và khuấy cho đến khi chuyển hết vào bình đựng mẫu.

CHÚ THÍCH  Sau khi thêm 1 lít nước đã khử ion, thể tích còn dư được thêm vào bằng metanol để đảm bảo rằng các DPPH vẫn được duy trì trong dung dịch. Nếu thể tích được thêm vào là nước đã khử ion, các DPPH có thể tách ra khỏi dung dịch. Bảo vệ các thuốc thử DPPH tránh ánh sáng ở tất cả các bước để giảm sự phân hủy. Dung dịch thuốc thử DPPH bổ sung phân tích hàng ngày cho mỗi bộ mẫu.

3.5.2  Dung dịch chuẩn Trolox, 0,5 mg/ml

Dùng cân (4.8) có đĩa cân bằng nhựa cân 50,00 mg ± 0,1 mg trolox (3.1) và ghi khối lượng đến 0,01 mg. Chuyển định lượng vào bình định mức quang hóa thấp dung tích 100 ml (4.5) với 50 ml metanol (3.3). Bọc bình bằng giấy nhôm (4.15) để tránh ánh sáng. Đảo ngược bình hoặc dùng máy khuấy từ (4.11) cho đến khi tan hết. Sau khi hòa tan hết, thêm 50 ml nước đã khử ion. Đảo chiều 13 lần và thêm metanol đến vạch.

Bảo vệ dung dịch chuẩn trolox tránh ánh sáng ở tất cả các bước để tránh làm suy giảm chất lượng. Dung dịch chuẩn trolox đã chuẩn bị có thể bảo quản được đến 2 tuần ở nhiệt độ 4 ºC.

4  Thiết bị, dụng cụ

Tất cả dụng cụ thủy tinh phải được rửa bằng acetone loại dùng cho HPLC và để khô sau khi làm sạch thông thường và trước khi được sử dụng. Điều này là để loại bỏ các hợp chất có thể ảnh hưởng đến phép thử. Tất cả dụng cụ thủy tinh cần được kiểm tra để đáp ứng giá trị danh nghĩa đến ± 1 % trước khi sử dụng.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Máy đo quang phổ, bước sóng 517 nm.

4.2  Máy trộn, có capsun trộn.

4.3  Máy lắc vòng, có thể kiểm soát được nhiệt độ và giữ được 32 bình nón dung tích 125 ml.

4.4  Bình nón, dung tích 125 ml, có nắp đậy.

4.5  Bình định mức, dung tích 100 ml, 1 lít, 2 lít.

4.6  Pipet có thể điều chỉnh, dung tích 100 µl đến 1000 µl, có thể phân phối được 0,2 ml, 0,4 ml, 0,6 ml, 0,8 ml.

4.7  Bộ phân phối dung môi, dung tích 50 ml.

4.8  Cân, có đĩa cân bằng nhựa, có thể đọc được 0,01 mg, có độ chính xác (độ lệch chuẩn) ± 0,015 mg và có thể cân được 205 g.

4.9  Giấy lọc, Whatman No. 4.

4.10  Phễu lọc, dùng một lần, đường kính 65 mm.

4.11  Máy khuấy từ.

4.12  Que khuấy từ, dài 1,27 cm.

4.13  Xyranh lọc, đường kính 25 mm, với đầu lọc nylon cỡ lỗ 0,45 µm.

4.14  Xyranh, dung tích 10 ml có đầu Luer-lock.

4.15  Giấy nhôm.

4.16  Chai thủy tinh, dung tích 2 lít hoặc lớn hơn.

4.17  Sàng, cỡ lỗ 0,5 mm.

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể nào liên quan đến sản phẩm cần phân tích thì các bên tự thảo thuận về vấn đề này.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu khô phải được nghiền và lọt qua sàng (4.17) có cỡ lỗ 0,5 mm. Mẫu lỏng phải được đồng nhất trước khi lấy mẫu con.

CHÚ THÍCH  Có thể giảm độ không đảm bảo của phương pháp và tính biến thiên trong phòng thử nghiệm liên phòng bằng cách giảm kích thước hạt của mẫu để thúc đẩy sự khuếch tán của các chất chống oxy hóa vào hệ thống dung môi của phép thử. Việc tuân thủ các thông số kỹ thuật kích thước hạt của phương pháp là rất quan trọng để duy trì độ tái lập liên phòng cao.

6.2  Cân mẫu

Dùng cân (4.8) cân tối thiểu ba mẫu con cho từng mẫu. Đối với mỗi mẫu, dùng bốn lần cân để dọc độ hấp thụ tương đồng với độ hấp thụ đích, đọc hai số ở trên và hai số ở dưới. Ba giá trị được chấp nhận, với điều kiện là các giá trị tương đồng với độ hấp thụ đích (một ở trên và hai ở dưới hoặc ngược lại). Điều này cho kết quả chính xác nhất. Khối lượng của từng mẫu phải được xác định qua thử nghiệm đối với từng nền mẫu. Tiêu chí đối với khối lượng hiệu chính cho từng mẫu để phân tích như sau:

Khi phân tích hồi quy được thực hiện trên độ hấp thụ của mẫu đã hiệu chỉnh mẫu trắng, ít nhất ba giá trị độ hấp thụ phải tuyến tính (R² > 0,990) và phải tương đương độ hấp thụ của dung dịch chuẩn DPPH 50 % được xác định bằng đường chuẩn Trolox (thường từ 0,45 đến 0,49 đơn vị hấp thụ). Giá trị này được xác định như độ hấp thụ đích trong Điều 7.

Nếu mẫu được phân tích mà không có giá trị độ hấp thụ nằm trong cùng khoảng với độ hấp thụ đích, thì đường tuyến tính của mẫu có thể được sử dụng để ước lượng dải khối lượng mẫu được sử dụng trong phép thử lặp lại, để giá trị độ hấp thụ nằm trong cùng khoảng với độ hấp thụ đích. Nếu mẫu là chất chống oxi hóa cao, có thể cần pha loãng mẫu để đảm bảo khối lượng mẫu đã pha loãng nằm trong cùng khoảng với độ hấp thụ đích.

Mẫu lỏng có thể được pha loãng bằng nước đã khử ion trong bình định mức thủy tinh loại A^[1].

Mẫu rắn được pha loãng, tốt nhất bằng cách cân 0,1 g mẫu cho vào capsun trộn trong máy trộn (4.2) và ghi lại khối lượng chính xác đến 0,0001 g đã trừ bì và thêm 0,9 g tinh bột ngô (3.4) vào capsun và ghi lại lượng cân chính xác đến 0,0001 g. Capsun sau đó được trộn trong máy trộn với ổ bi nhỏ trong capsun để tạo sự rung động. Giá trị pha loãng được xác định là khối lượng của mẫu chia tổng khối lượng của mẫu cộng với khối lượng tinh bột. Khối lượng mẫu nhỏ hơn có thể được sử dụng để có độ pha loãng cao hơn.

CHÚ THÍCH  Số mẫu tối đa mỗi lần chạy được xác định bằng dung tích của máy lắc vòng (4.3) và từng mẫu được phân tích ở mức thấp nhất của ba khối lượng mẫu khác nhau. Ví dụ, với máy lắc vòng có tổng 32 vị trí, 22 vị trí là thích hợp đối với các mẫu (vị trí sau khi đặt 2 bình mẫu trắng, 4 bình mẫu hiệu chuẩn Trolox và 4 bình chất chuẩn đối chứng). Bằng cách tăng số lần phân tích trên mỗi mẫu, khả năng thu được 3 đến 4 giá trị độ hấp thụ chấp nhận được sẽ tăng nhưng sẽ giảm số mẫu được phân tích trong lần chạy. Đối với máy lắc vòng có tối đa 7 mẫu có thể được phân tích trên một lần chạy đơn lẻ.

6.3  Chất chuẩn đối chứng

Chất chuẩn đối chứng được chuẩn bị từ chất nền đồng nhất mà phòng thử nghiệm có được và đã xác định trước hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số bằng phương pháp này, nên được chạy với từng mẫu để thiết lập biểu đồ kiểm soát hỗ trợ xử lý lỗi tiềm ẩn các vấn đề phát sinh.

Chuẩn bị các bình nón có nắp đậy (4.4) tương ứng với 3 mẫu phân tích, hai mẫu trắng, bốn mẫu chuẩn hiệu chuẩn Trolox và 4 mẫu chất chuẩn đối chứng.

Ghi lại tất cả khối lượng tính bằng miligam, ghi đến 2 chữ số thập phân.

Cân các mẫu như nêu trong 6.2 và cho vào bình tương ứng với từng mẫu.

Dùng pipet (4.6) lấy 0,2 ml, 0,4 ml, 0,6 ml và 0,8 ml chuẩn Trolox (3.5.2) cho vào bình nón có nắp vặn dung tích 125 ml tương ứng. Thêm 50 ml dung dịch DPPH (3.5.1) (vừa khuấy vừa thêm dung dịch DPPH) vào từng bình nón. Khuấy để phân tán mẫu trong dung dịch DPPH. Đậy nắp và ủ trong máy lắc vòng (4.3) ở nhiệt độ 35 ºC ± 2 ºC trong 4 h với tốc độ 250 rpm.

Lấy bình ra khỏi máy lắc. Lọc mẫu đục hoặc có chứa hạt qua giấy lọc (4.9). Một số mẫu (như súp kem) có thể lọc qua ống lọc xyranh (4.13) cỡ lỗ 0,45 µm. Các mẫu phải trong để tiếp tục phân tích. Loại bỏ các mẫu không trong khi lọc bằng xyranh.

6.4  Đo độ hấp thụ

Đo độ hấp thụ trên máy quang phổ (4.1) ở bước sóng 517 nm so với mẫu trắng là nước cất trong vòng 30 min kể từ khi lấy mẫu ra khỏi máy lắc vòng có ủ ấm.

6.5  Dựng đường chuẩn

Dựng đường chuẩn Trolox từ độ hấp thụ của dung dịch Trolox ở bước sóng 517 nm (trục y) theo khối lượng của Trolox trong từng dung dịch (trục x).

Thực hiện phân tích hồi quy tuyến tính trên các dữ liệu chuẩn. R² phải ≥ 0,995.

Độ dốc của đường chuẩn độ nêu trên (độ dốc Trolox) phải có giá trị âm và giao điểm với trục y phải trong khoảng từ 0,9 đến 1,0 đơn vị độ hấp thụ. Giao điểm của đường chuẩn với trục Y là giá trị trắng theo lý thuyết (A).

A ÷ 2 = độ hấp thụ đích của các mẫu.

CHÚ THÍCH  Khối lượng mẫu cần được chọn sao cho dải giá trị bao trùm độ hấp thụ đích. Tốt nhất là có ít nhất hai giá trị ở trên và hai giá trị dưới độ hấp thụ đích.

7  Tính kết quả

a) Lập bảng dữ liệu cho từng mẫu như trong ví dụ dưới đây (có rất nhiều bình đối với mỗi mẫu).

Tính khối lượng hiệu chính, X, theo Công thức (1):

Trong đó:

m  là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

D  là hệ số pha loãng.

Tính độ hấp thụ thuần theo Công thức (2):

Trong đó:

A  là giá trị trắng theo lý thuyết;

A₁  là độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm.

Trên đường chuẩn riêng của từng mẫu, dựng độ hấp thụ thuần (trục y) theo khối lượng đã hiệu chính (trục x). Thực hiện hồi quy dữ liệu. Độ dốc phải dương, R² phải ≥ 0,990. Để dễ tính toán, dữ liệu tuyến tính là thích hợp.

Khối lượng mẫu = (độ hấp thụ mẫu – giao điểm với trục y)/độ dốc

Trong đó: giao điểm với trục y và độ dốc thu được từ đường hồi quy dữ liệu.

b) Tính hệ số Trolox, TF, theo Công thức (3):

(3)

Trong đó:

d_t  là độ tinh khiết của Trolox, độ tinh khiết trong phép thử này là 98 %, độ tinh khiết của Trolox được sử dụng trong công thức tính hệ số Trolox đối với từng phép thử (nên dựa vào Giấy chứng nhận phân tích hoặc phép xác định độ tinh khiết riêng của từng phòng thử nghiệm);

mw  là khối lượng phân tử của của Trolox và bằng 250,29 g/mol;

c) Tính hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số của mẫu thử, E, biểu thị bằng milimol đương lượng Trolox trên 100 g (µmol TE/100 g) theo công thức (4):

(4)

Trong đó:

A₀  là độ hấp thụ của mẫu thử;

m₀  là khối lượng của mẫu thử;

t  là độ dốc Trolox.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:

– mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu;

– phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

– phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

– kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Kết quả cộng tác đối với phép xác định hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số trong thực phẩm và đồ uống

Bảng A.1 – Kết quả thử nghiệm liên phòng đối với phép xác định hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số trong thực phẩm và đồ uống bằng phản ứng với 2,2′-diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH)

Bảng A.2 – Dữ liệu thống kê từ nghiên cứu cộng tác để xác định hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số trong thực phẩm và đồ uống bằng phản ứng với 2,2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức.