TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10780-3:2016 (ISO/TR 6579-3:2014) VỀ VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA – PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP

Hiệu lực: Còn hiệu lực

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 10780-3:2016

ISO/TR 6579-3:2014

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA –

PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP

Microbiology of the food chain – Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella –

Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp

 

Lời nói đầu

TCVN 10780-3:2016 hoàn toàn tương đương với ISO/TR 6579-3:2014;

TCVN 10780-3:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chun quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phâch và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chun Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi này gồm có các phần sau:

TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong thực phm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện Salmonelltrên đĩa thạch và Sửa đổi 1:2008 TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Amd. 1:2007) Vi sinh vật trong thực phm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện Salmonella spp. trên đĩa thạch – Sửa đi 1: Phụ lục D: Phát hiện Salmonella spp. trong phân động vật và trong mẫu môi trường từ giai đoạn sn xuất ban đầu;

TCVN 10780-2:2015 (ISO/TS 6579-2:2012) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện, đnh lượng và xác định kiểu huyết thanh của Salmonella – Phần 2: Định lượng bằng kĩ thuật số đếm có xác sut lớn nhất được thu nhỏ;

TCVN 10780-3:2016 (ISO/TR 6579-3:2014) Vi sinh vật trong chuỗi thực phm – Phương pháp phát hiện, đnh lượng và xác định typ huyết thanh của Salmonella – Phn 3: Hướng dẫn xác định typ huyết thanh của Salmonella spp.

 

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA –

PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP

Microbiology of the food chain – Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella – Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp

 

CẢNH BÁO – Đ bảo vệ sức khỏe ca nhân viên phòng thí nghiệm, chỉ th nghiệm để phát hiện Salmonella trong phòng thử nghiệm được trang bị phù hợp, dưới sự kiểm soát của người phân tích vi sinh vật có kinh nghiệm và rt cẩn thận trong quá trình xử lý tất cả các vật liệu đã ủ.

Người sử dụng tu chuẩn này phải thành thạo các thao tác thông thường trong phòng thử nghiệm. Tiêu chuẩn này không đ cp đến tt cả các vn đề an toàn, liên quan đến việc sử dụng tiêu chuẩn. Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và đảm bảo tuân thủ các quy định hiện hành.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chun này đưa ra hướng dẫn về việc xác định typ huyết thanh các serovar Salmonella và có thể áp dụng để xác định typ huyết thanh của các chng cấy Salmonella spp. thuần khiết, phụ thuộc vào nguồn mà chúng được phân lập.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chun này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kim tra vi sinh vật.

TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thc ăn chăn nuôi và nước – Chun bị, sản xuất, bo quản và kiểm tra hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

ISO 6579-1, Microbiology of the food Chain  Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping oSalmonella -Part 1:Horizorital method for the detection of Salmonella spp.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chun này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Salmonella (Salmonella)

Trực khuẩn gram âm, oxidase âm tính, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, thưng tạo thành các khuẩn lạc đường kính từ 2 mm đến 4 mm trên môi trường đặc chọn lọc và có các đặc tính sinh hóa và huyết thanh điển hình khi phép thử được thực hiện theo tiêu chun này.

3.2

Xác định typ huyết thanh Salmonella (serotyping of Salmonella)

Xác định sự có mặt hay không có mặt các kháng nguyên-O, kháng nguyên-H và kháng nguyên-Vi cụ thể trong chủng vi khuẩn phân lập đã khẳng định là Salmonella (3.1).

3.3

Công thức Kháng nguyên (anligenic formula)

Sự kết hợp của các con số và chữ cái thể hiện các kháng nguyên O-, H- và Vi- của chủng vi khuẩn phân lập được khẳng định là Salmonella (3.1).

4  Nguyên tắc

Để xác định typ huyết thanh của Salmonella spp., các kháng nguyên sau đây được xác định cho các chủng vi khun phân lập đã được khẳng định sinh hóa là Salmonella spp.:

Kháng nguyên-O, kháng nguyên-H và kháng nguyên-Vi.

CHÚ THÍCH: Có th sử dụng các quy trình khác đ khẳng định chủng vi khun phân lp được là Salmonella spp. với điều kiện sự phù hợp của quy trình thay thế đã được xác nhận [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

5  Môi trường nuôi cấy và huyết thanh

5.1  Quy định chung

Đối vi thực hành trong phòng thử nghiệm hiện tại, áp dụng TCVN 6404 (ISO 7218).

Đối với phép th hiệu năng của môi trường nuôi cấy, theo TCVN 8128 (ISO 11133).

5.2  Môi trường nuôi cấy và thuc thử

Xem Phụ lục A.

5.3  Kháng huyết thanh

Kháng huyết thanh-O, Kháng huyết thanh-H và kháng huyết thanh-Vi có bán sẵn từ các nhà cung cấp khác nhau. Thông tin về các kháng huyết thanh đa giá và kháng huyết thanh đơn giá được nêu trong Phụ lục B.

6  Thiết bị, dụng cụ

Có thể sử dụng các dụng cụ thủy tinh dùng một lần để thay cho các dụng c dùng nhiu lần, nếu chúng có các quy định kỹ thuật tương tự.

Sử dụng các thiết b, dụng cụ thông thường của phòng th nghiệm vi sinh và cụ thể như sau:

6.1  T m, đ nuôi cấy và phân lập Salmonella, có khả năng duy trì nhiệt độ trong khoảng t 34 °C đến 38 °C.

CHÚ THÍCH: Trong tiêu chun này, nhiệt độ ủ không phải là một thông số tới hạn. Các chủng phân lập được nuôi cy để thu được đy đ sinh khối vi khun thuần khiết, đ thực hiện các phép th. Vì vậy, bước nuôi cấy được thực hiện  nhiệt độ phát triển ti ưu. Đi vSalmonella nhiệt độ thường t 34 °C đến 38 °C.

6.2  Tủ sấy (để khử trùng khô) hoặc nồi hp (để kh trùng ướt). Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.3  Tủ lạnh (đ bảo quản môi trường nuôi cấy đã chuẩn b), có khả năng duy trì nhiệt độ  5 °C ± 3 °C.

6.4  Lam kính.

6.5  Dụng cụ cấy vô trùng, ví dụ kim cấy, que cấy hoặc vòng cấy (ví dụ 1 µl).

6.6  Ống nghiệm và bình cầu vô trùng, có dung tích thích hợp. Có th sử dụng bình hoặc chai và ống nghiệm có nắp bằng kim loại hoặc bằng cht dẻo (nắp vặn) không độc.

6.7  Đĩa Petri vô trùng, có đường kính khoảng 55 mm đến 90 mm.

6.8  Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 47 °C đến 50 °C.

6.9  Nồi cách thy (hoặc tủ ấm), có khả năng duy trì nhiệt độ ở 50 °C ± 2 °C.

7  Lấy mẫu

Điều quan trng là phòng thử nghiệm làm việc với chủng cấy thuần khiết đã được khẳng định sinh hóa là Salmonella spp.

8  Phân loại Salmonella

8.1  Tổng quan

C khoảng 7 năm, Trung tâm nghiên cứu về chuẩn Salmonella của WHO (Viện Pasteur, Paris) s công b bản cập nhật về “Công thức kháng nguyên của các serovar Salmonella, đó là cơ sở để định danh các tên typ huyết thanh serovar và công thức đối với các chủng vi khun phân lập Salmonella spp. Thời điểm công bố phiên bn mi nhất của sơ đồ White-Kauffmann-Le Minor là năm 2007 (Tài liệu tham khảo [9]).

CHÚ THÍCH: Những b sung cho sơ đồ White-Kauffmann-Le- Minor đã được công bố trong cuốn Nghiên cứu Vi sinh, là một n phm của Viện Pasteur (trước đây gọi là Annales de I’Institut Pasteur/Microbiologie). Ví dụ, bổ sung s 47 đã được công bố m 2010 và đưa ra các serovar mới đã phát hiện từ năm 2003 đến năm 2007 (Tài liệu tham khảo [10]).

Tiêu chun này đưa ra hướng dn về xác định typ huyết thanh của các serovar Salmonella.

8.2  Danh pháp (cách đặt tên)

Các danh pháp khác nhau đã được sử dụng (hoặc vẫn đang được sử dụng) cho các chủng Salmonella:

– Ban đầu, Kauffmann (Tài liệu tham khảo [12]) đã coi mỗi serovar Salmonella là một loài riêng biệt;

– Các kiểu loài khác nhau đã được sử dụng: S. enterica vs.S. choleraesuis, mỗi loài có một chủng khác;

– Một số chủng Salmonella “quan trọng” (như Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi) được coi là các loài và không phải “chỉ” các serovar của các loài.

Hội đng trọng tài của Tiểu ban kỹ thuật quốc tế về hệ thống tự động nghiên cứu về sinh vt nhân nguyên thủy (Procaryotes) cho thấy rằng có thể sử dụng nhiều từ đồng nghĩa trong việc gọi tên Salmonella (Tài liệu tham Khảo [22]). Trong tiêu chuẩn này, các tên gọi hiện tại đã được chấp nhận sử dụng rộng rãi, đã được Trung tâm nghiên cu về chuSalmonella của WHO [Tài liệu tham khảo 9], Hiệp hội về Vi sinh vật của Mỹ (Tài liệu tham khảo [20]), Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh tật (Tài liệu tham khảo [3]) và Sổ tay Bergey’s (Tài liệu tham kho [17]) chấp nhận. Theo danh pháp hiện hành, các chi Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae và chỉ bao gồm hai loài: S. enterica và S. bongori. S. enterica được chia thành sáu phân loài: S. enterica subsp; entericaS. enterica subsp. salamaeS. enterica subsp. arizonaeS. enterica subsp. diarizonaeS. enterica subsp. houtenae và S. enterica subsp. indica.

Các serovar Salmonella thuộc S. enterica subsp. enterica thường phân lập được nhiều nhất (trên 99,5 % trong số các chủng Salmonella phân lập được) và chúng được đặt tên, thưng liên quan đến vị trí địa lý nơi serovar được phân lập lần đầu. Các serovar thuộc các phân loài khác của S. enterica và của S. bongori được đặt tên theo công thức kháng nguyên của chúng.

Do có sự kết hợp của các phân loài và nhiều serovar, nên tên đy đủ rất dài (ví dụ: Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhimurium). Do đó, cách gọi ngắn hơn thường sử dụng để chỉ tên của các serovar của các phân loài enterica. Hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor đưa ra gợi ý các tên gọi rút gọn sau đây: S. enterica serovar Typhimurium hoặc Salmonella ser. Typhimurium. Theo Tài liệu tham khảo [3], ở trích dẫn đầu tiên của serovar trong tên chi cần theo sau là t “serovar” viết tắt là “ser.” và sau đó tên là tên của serovar. Sau đó, tên có thể được viết bng tên chi theo sau là tên serovar (ví dụ Salmonella Typhimurium). Cách gọi tên serovar Salmonella này cũng được chấp nhận ở hầu hết các tạp chí [ví dụ: Tạp chí của Hiệp hội Vi sinh vật Mỹ (ASM)] và cũng được sử dụng trong tiêu chun này.

Tóm lại, gọi tên Salmonella như sau:

Họ:Enterobacteriaceae (chữ cái đầu tiên viết hoa, chữ in nghiêng)

Chi:Salmonella (chữ cái đầu tiên viết hoa, chữ in nghiêng)

Loài:enterica (không viết hoa, chữ in nghiêng)

Phân loài:enterica (không viết hoa, chữ in nghiêng)

Serovar (typ huyết thanh hoặc ser.): ví dụ: Typhimurium (chữ cái đầu tiên viết hoa, không in nghiêng)

Phân loài: salamae

arizonae

diarizonae

houtenae

indica

Loài: bongori

Trong phn bổ sung cho hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor (Tài liệu tham khảo [10]) có trên 2 600 serovar Salmonella được đề cập đến và số lượng được tăng đều, như thống kê trong Bảng 1.

Bảng 1 – Số lượng 80 serovar Salmonella qua các năm

Loài/phân loài

Bổ sung

1998a

2001b

2007c

S lượng serovar

Salmonella enterica

2 443

2 502

2 587

subsp. enterica

1454

1492

1547

subsp. salamae

489

500

513

subsp. arizonae

94

95

100

subsp. diarizonae

324

331

341

subsp. houtenae

70

71

73

subsp. indica

12

13

13

Salmonella bongori

20

21

23

Tổng số serovar (chi Salmonella)

2 463

2 523

2 610

a Tài liệu tham khảo [18].

b Tài liệu tham khảo [19].

c Tài liệu tham khảo [10], qua các năm 2003 đến 2007.

8.3  Các đặc tính sinh hóa

Các loài và phân loài Salmonella được xác định dựa trên các phép thử sinh hóa khác nhau. Trong Bng 2 đưa ra các đặc tính khác nhau. Xem Tài liệu tham khảo [9] và Phụ lục C đ biết thêm chi tiết.

Bng 2 – Các đặc tính sinh hóa của các loài và phân loài Salmonella (Tài liệu tham khảo [9])

Loài

S. enterica

S. bongori

Phân loài

enterica

salamae

arizonae

diarizonae

houtenae

indica

Dulcitol

+

+

d

+

ONPGa (2 h)

+

+

d

+

Malonate

+

+

+

Gelatinase

+

+

+

+

+

Sorbitol

+

+

+

+

+

+

Phát triển với KCNb

+

+

L(+)-tartratec

+

Galacturonate

+

+

+

+

+

g-Glutamyltransferase

+e

+

+

+

+

+

β-Glucuronidase

d

d

+

d

Mucate

+

+

+

 (70 %)

+

+

Salicin

+

Lactose

– (75 %)

+ (75 %)+

d

Dung giải bởi pha O1

+

+

+

+

d

+ ≥ 90 % phản ng dương tính;

– ≥ 90 % phản ứng âm tính;

d các phản ứng khác nhau của các serovar khác nhau;

a o-Nitrophenyl-β-D-galaclopyranoside (phép thử [β-galactosidase].

b Kali xyanua;

c = D-Tartrat, Paratyphi B:-, Paratyphi B biovar Java:+

e = Typhimurium:d. Dublin:-.

8.4  Đặc tính kháng nguyên

8.4.1  Yêu cầu chung

Các đc tính kháng nguyên quan trọng của Salmonella đối với các phép thử huyết thanh được chia thành ba loại chính như sau:

– Kháng nguyên-O, còn gọi là kháng nguyên thân;

– Kháng nguyên-H, còn gọi là kháng nguyên lông;

– Kháng nguyên-Vi, còn gọi là kháng nguyên v.

Các công thức kháng nguyên của Salmonella spp. gm có ba typ kháng nguyên sau đây: kháng nguyên-O, kháng nguyên-Vi (nếu có]: kháng nguyên-H của pha thứ nht: kháng nguyên-H của pha th hai. Ví dụ: công thức kháng nguyên của Salmonella Paratyphi C là: 6,7[Vi]:c:1,5, với kháng nguyên-O:6 và O:7; với kháng nguyên-Vi, có thể có mặt hoặc không có mặt (ký hiệu bi các dấu ngoặc vuông), với kháng nguyên-H H:c của pha thứ nht, với các kháng nguyên-H H:1 và H:5 của pha thứ hai.

8.4.2  Kháng nguyên-O (kháng nguyên thân)

Kháng nguyên này bao gồm thành phần vách tế bào và các chất chính là polysaccharid, protein và phospholipid. Kháng nguyên-O rất bền và có thể chịu được nhiệt độ đến 100 oC trong 150 min, xử lý bằng etanol 95 % thể tích hoặc axit loãng (Tài liệu tham khảo [16]).

Phản ứng của kháng nguyên-O với kháng huyết thanh làm ngưng kết hạt. Trước đây, trong i liệu của Kauffmann-White (Tài liệu tham khảo [9]) các kháng nguyên-O được phân loại thành các nhóm kháng nguyên-O. Các nhóm này được đặt tên với chữ cái La Mã bất đầu với nhóm A, trong đó gồm có kháng nguyên O:2 đến nhóm Z có chứa kháng nguyên O:50. Vì có nhiều các kháng nguyên-O, nên các kháng nguyên còn lại không được đưa váo nhóm, nhưng đã được đặt tên thành các kháng nguyên-O từ O:51 đến O:67. Ngày nay, mỗi nhóm O sử dụng O-yếu t điển hình được dùng nhiều hơn. Các chữ cái này đã được giữ lại và được đưa vào trong dấu ngoặc đơn, ví dụ: O:4 [B] (Tài liệu tham khảo [9]). Trong Bng 3 đưa ra các tên gọi cũ và mới.

Bảng 3 – Các nhóm huyết thanh Salmonella (tên gọi cũ) và các kháng nguyên-O có liên quan (tên gọi mới)

Nhóm

Kháng nguyên-O

Nhóm

Kháng nguyên-O

Nhóm

Kháng nguyên-O

A

2

G1G2

13

Q

39

B

4

H

6,14

R

40

C1(C4)a

6,7

I

16

S

41

C2, C3

8

J

17

T

42

D1

9

K

18

U

43

D2

9,46

L

21

V

44

D3

9,46,27

M

28

W

45

E1(E2, E3)b

3,10

N

30

X

47

E4

1,3,19

O

35

Y

48

F

11

P

38

Z

50

a C4 đa được gộp vào C1.

b E2 và E3 đã được gộp vào E1.

8.4.3  Kháng nguyên-H (kháng nguyên lông)

Kháng nguyên này nằm trên sợi lông và các thành phn chính là protein. Kháng nguyên này không bền bằng kháng nguyên-O, dễ b phân hy trong ancol, axit và nhiệt độ trên 60 oC, nhưng có khả năng chịu được dung dịch formalin 0,5 % thể tích (Tài liệu tham khảo [16]).

Phng của kháng nguyên-H với kháng huyết thanh m ngưng kết bông. Nhiều Salmonella spp. có hai pha kháng nguyên-H, nhưng các biến thể một pha và ba pha chưa được biết. Pha đầu tiên được gọi là pha đặc hiệu và pha thứ hai được gọi là pha không đặc hiệu. Pha đầu được ký hiệu bằng chữ thường từ a đến z. Tuy nhiên, từ khi nhận biết kháng nguyên-z, thì nhiều kháng nguyên-H mới đã được phát hiện và được đặt tên z1, z2z3z91.

Các ví d về các serovar một pha là:

– Salmonella Paratyphi A: 1,2,12:a:[1,5] với H:a đối với pha đầu tiên, trong dấu ngoặc vuông là pha thứ hai (H:1,5) có thể có mặt hoặc không có mặt;

– Salmonella Typhi: 9,12,[Vi]:d:-; với H:d đối với pha đầu;

– Salmonella Derby: 1,4,[5], 12:f,g[1,2]với H:f,g đối với pha đầu tiên, khi đó pha thứ hai (H:1,2) có thể có hoặc không có mặt;

– Salmonella Enteritidis: 1,9,12:g,m:-; với H:g,m đối với pha đầu. Ngoài các H:g,m, một số chủng có thể có H:p, hoặc H:f, hoặc H:t. Các chủng đặc biệt có thể có kháng nguyên H:1,7 là pha th hai;

– Salmonella Dublin: 1,9,12,[Vi]:g,p:-; vi H:g,p đối với pha đầu.

CHÚ THÍCH 1: Các yếu tố-O gạch chân được xác đnh bng biến trạng thực khun. Chúng ch có mặt nếu chng cy được dung giải bng th thực khuẩn biến trạng tương ứng (Tài liệu tham khảo [2]).

CHÚ THÍCH 2: Các yếu tố-O hoặc -H trong ngoặc vuông có thể có mặt hoặc không có mặtmà không liên quan đến thực khun thể tiến trạng (Tài liệu tham khảo [2]).

CHÚ THÍCH 3: Các chủng Salmonella Derby và Salmonella Enteritidis rt hiếm gặp. Có th cần chuyển đổi pha đề phát hiện các chủng hiếm gặp này. Tuy nhiên, điều này ch cần thiết vi những trường hợp nht đnh [ví dụ trong trường hợp sai lệch nguồn và/hoặc trưng hợp có di chuyển (đặc biệt)].

8.4.4  Kháng nguyên-Vi (kháng nguyên v)

Kháng nguyên này là kháng nguyên v và có th che khuất các kháng nguyên-O làm cho các vi khuẩn không ngưng kết với kháng huyết thanh-O. Thành phần chính của kháng nguyên-Vi là polysaccharid. Các chủng Salmonella có kháng nguyên-Vi độc hơn so với các chủng không có kháng nguyên-Vi. Kháng nguyên-Vi có th chỉ có mặt trong ba Salmonella serovar:

– Salmonella Typhi: 9,12, [Vi]:d:-;

– Salmonella Paratyphi C: 6,7,[Vi]:c:1,5;

– Salmonella Dublin: 1,9,12, [Vi]:g,p:-.

Trong các dấu ngoặc vuông cho thấy có thể có hoặc không có mặt kháng nguyên-Vi.

CHÚ THÍCH: Sự có mặt các kháng nguyên-Vi trong các chủng phân lập của Salmonella từ mẫu thực phẩm hoặc mẫu thú y là rt hiếm gặp. Nếu có mặt kháng nguyên-Vi, nó sẽ che khut các kháng nguyên-O. Đ phát hiện các kháng nguyên-O, có th cần làm nóng huyn phù mẫu phân lập (ví dụ: trong dung dịch nước muối sinh lý) ở 100 oC trong 60 min, hoặc ở 120 oC trong 15 min.

9  Quy trình xác định typ huyết thanh Salmonella

9.1  Yêu cầu chung

Trước khi bắt đầu xác định typ huyết thanh, cn khẳng định sinh hóa rằng chủng phân lập được thuộc chi Salmonella (như quy định trong ISO 6579-1). Mặc dù các kháng nguyên-H là đặc hiệu cho Salmonella, thì một số kháng nguyên-O thường gặp ở các chi khác nhau của Enterobacteriaceae (ví dụ: SalmonellaCitrobacter, Hafnia).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các quy trình khác để khng đnh rằng chủng phân lập được thuộc chSalmonella, với điều kiện là quy trình thay thế này đã được xác nhận (xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Mỗi nhà cung cấp các kháng huyết thanh sản xuất ra các bộ kháng huyết thanh riêng, kèm theo hướng dẫn sử dụng. Do đó, không thể đưa ra một bộ hưng dẫn cho việc xác định typ huyết thanh, vì cần phải thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà cung cấp để có được kết qu tối ưu. Một số nhà sản xuất cung cấp các kháng huyết thanh (hỗn hợp của nhiều kháng huyết thanh-O hoặc kháng huyết thanh-H) rất hữu ích cho việc xác định typ huyết thanh chưa biết. Khi chủng ngưng kết với kháng huyết thanh hỗn hợp, thì có thể tiếp tục thử nghiệm với nhóm kháng huyết thanh và/hoặc chỉ với loại kháng huyết thanh hỗn hợp dương tính. Khi cần nhấn mạnh các serovar nht định và khả năng để ch ra các serovar khác theo Salmonella spp. thì có thể tiến hành ngưng kết ngay chỉ với kháng huyết thanh đơn giá cụ thể của serovar có liên quan.

Trong Phụ lục B đưa ra quy trình chung về việc xác định typ huyết thanh chưa biết của chủng phân lập Salmonella.

9.2  Ví dụ về quy trình xác định typ huyết thanh cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

9.2.1  Yêu cầu chung

Trong ví dụ dưới đây mô tả quy trình xác định typ huyết thanh cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (xem Phụ lục D). Trong Bảng 4 đưa ra các chủng này với công thức kháng nguyên của chúng.

Trong các phần sau, mô tả việc ngưng kết các chủng phân lập Salmonella, quy trình này thưng được thực hiện nhiều nhất. Tuy nhiên, vẫn có các quy trình khác, ví d: phương pháp đĩa vi giếng (xem Phụ lục E).

Bảng 4 – Công thức kháng nguyên của năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khe cộng đồng

Tên

Kháng nguyên-Ob

Kháng nguyên-H

Pha 1

Pha 2

Salmonella Typhimurium

1,4,[5]12

i

1,2

Salmonella Enteritidisa

1,9,12

g,m

Salmonella Infantis

6,7,14

r

1,5

Salmonella Virchow

6,7,14

r

1,2

Salmonella Hadar

6,8

Z10

e,n,x

a Ngoài các yếu tố H:g,m, một số chủng có thể có yếu t H:p hoặc H:f hoặc H:t. Trừ các chủng có thể có kháng nguyên H:1,7 là pha thứ 2 (Tài liệu tham kho [9]).

b Các yếu tố O gạch chân được xác định bằng biến trạng thực khun. Chúng ch có mặt nếu chủng cy được dung giải bng th thực khun biến trạng tương ứng (Tài liệu tham khảo [9]).

9.2.2  Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella

Cấy một khun lạc từ chủng cấy thuần khiết nghi ngờ là Salmonella theo đặc tính sinh hóa. Sử dụng môi trường nuôi cấy và các phương pháp do nhà sản xut quy định đối với kháng huyết thanh được sử dụng. Nếu không có sẵn thông tin, thì có thể sử dụng môi trường thạch không chọn lọc như thạch dinh dưỡng (ví d: xem A.2). Ủ các đĩa thạch dinh dưỡng đã cấy từ 34 °C đến 38 °C (6.1) “qua đêm” (khoảng 18 h).

9.2.3  Kiểm tra phản ng tự ngưng kết

Ví dụ về phép thử kiểm tra phản ứng tự ngưng kết được mô tả sau đây. Có th sử dụng các phương pháp khác. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xut.

– Cho một giọt nước muối (có thể thay đổi lừ NaCI 8,5 g/l đến NaCI 35 g/l, nồng độ cao hơn có thể nhạy hơn) trên lam kính (6.4).

– Chuyển một lượng nhỏ chủng cy vi khun (ví d: có thể lấy một lượng 1 µl bằng que cy dùng một lần) sang lam kính và trộn với giọt nước muối.

– Nghiêng nhẹ lam kính qua lại. Tùy thuộc vào nhà sản xuất và/hoặc nồng độ muối, thường khoảng 5 s đến 60 s.

– Đánh giá huyền phù. Khi có mặt các hạt trong huyền phù chứng tỏ có sự tự ngưng kết. Các chủng có phn ứng dương tính trong phép th tự ngưng kết rất khó kiểm tra thêm để xác định typ huyết thanh. Đối với các chủng tự ngưng kết, không thể thực hiện được phép th kháng nguyên-O. Tuy nhiên, đôi khi vẫn có thể điều tra về các kháng nguyên-H.

Nếu một chủng cho thấy tự ngưng kết, có thể thử trên một hoặc hai cách dưới đây trên cùng một khuẩn lạc và/hoặc trên các khuẩn lc khác.

– Hòa khuẩn lạc trong nước vô trùng thay vì trong dung dịch nước mui và tiến hành quy trình tự ngưng kết như trên.

– Cấy các chủng trên môi trường thạch bán đặc như mối trường thạch Rappaport Vassiliadis cải biến (MSRV) (theo quy định trong ISO 6579-1) và s dụng khun lạc từ thạch bán đặc đ thực hiện quy trình tự ngưng kết như trên.

CHÚ THÍCH: Các chủng tự ngưng kết còn được gọi là các chủng “ráp”.

9.2.4  Ngưng kết với kháng huyết thanh-O

Các hướng dẫn sử dụng của các kháng huyết thanh có thể khác nhau giữa các nhà sản xuất. Do đó, điều quan trọng là luôn tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hầu hết các nhà sản xut sử dụng phương pháp ngưng kết lam kính để phát hiện các kháng nguyên-O. Trong phương pháp này, trộn một giọt huyết thanh với huyền phù vi khuẩn (trực tiếp từ đĩa, ống hoặc canh thang) trên lam kính. Nghiêng nhẹ lam kính qua lại. Sau đó, quan sát sự ngưng kết trên lam kính. Sự có mặt các hạt chứng tỏ phản ứng dương tính.

Đối với các nhà sản xuất khác nhau, có thể có những thay đổi trong cách tiến hành như sau:

– Kích thước của giọt trên lam kính (ví dụ: 25 µl hoặc một “giọt];

– Cách trộn kháng huyết thanh với vi khuẩn trên lam kính (vi khuẩn được ly trực tiếp từ môi trường thạch hoặc huyền phù, kháng huyết thanh được cho trực tiếp trên lam kính hay được cho vào huyn phù vi khun);

– Thời gian nghiêng trượt lam kính (có thể dao động từ 5 s đến 60 s];

– Cách quan sát sự ngưng kết (phóng đại hay không, nền tối hoặc ánh sáng bình thường];

– Giải thích các kết quả (đọc các chú thích liên quan đến nhng hạn chế của quy trình].

9.2.5  Ngưng kết với kháng huyết thanh-H

Sau khi ngưng kết với kháng nguyên-O, tiến hành ngưng kết với kháng nguyên-H. Salmonella thường có hai loại kháng nguyên-H (pha 1 và pha 2). Nếu một pha-H được tìm thấy âm tính với các chủng hai pha, thì cần thực hiện phương pháp đo pha. Pha-H chính bị khng chế bằng phương pháp đảo pha. Bằng cách khống chế pha-H chính, thì pha-H thứ hai có thể được thể hiện và xác định.

Phương pháp thường được sử dụng để đảo pha là phương pháp của Sven Gard, xem 9.2.7. Đối với việc này, kháng huyết thanh đảo pha cụ thể được cho vào môi trường thạch và chủng Salmonella được cấy thành điểm trên đĩa. Môi trường thạch phải đủ mềm để cho Salmonella di chuyển dễ dàng trong môi trường. Nng độ thạch trong môi trường có thể thay đổi từ 0,5 % đến 1 % khối lượng (tùy thuộc vào nồng độ gel của thạch). Ví dụ sự di chuyển trên bề mặt môi trường được đưa ra trong A.3. Các ví dụ khác về đo pha được đưa ra trong Phụ lục F.

Đ kiểm tra về sự ngưng kết, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

9.2.6  Phép thử ngưng kết để xác định typ huyết thanh của năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

9.2.6.1  Yêu cầu chung

Để phát hiện năm serovar Salmonella đ cập trong Bảng 4, cần đến các kháng huyết thanh-O và kháng huyết thanh-H sau đây:

O:4, O:5, O:6 (O:61 hoặc O:6,7 hoặc O:6,14,24), O:7. O:8, O:9 và O:46.

H:i, H:2, H:G hoặc H:g (đơn giá), H:m, H:q, H:s, H:t, H:r, H:5, H:z10 và H:x.

Để xác định các typ huyết thanh của các chủng Salmonella theo thứ tự nêu trong Bảng 4, thực hiện quy trình quy định trong 9.2.6.2 đến 9.2.6.5 (xem sơ đồ tại Phụ lục D).

Để biết thêm thông tin về các phép th tuần tự các kháng nguyên khác nhau, xem Phụ lục B.

9.2.6.2  Nếu O:4 dương tính

Ngưng kết với O:5. Kết qu có thể là dương tính hay âm tính đối với Salmonella Typhimurium, vn còn có thông tin có thể liên quan đến các mc đích dịch tễ.

Ngưng kết với các kháng huyết thanh H:i và H:2 (có thể cần đảo pha).

Các serovar là chng Typhimurium nếu cả hai phản ứng này là dương tính.

Ngưng kết với O:12 là không cn thiết để chứng tỏ chng phân lập Salmonella Typhimurium, vì O:4 dương tính chứng tỏ có mặt O:12. Tương tự, việc phát hiện kháng nguyên H:1 không có khả năng phân biệt và không cần phải kiểm tra bổ sung.

9.2.6.3  Nếu O:9 dương tính

Ngưng kết với kháng huyết thanh H:G (hỗn hợp) hoặc với kháng huyết thanh H:g (kháng thể đơn giá).

Nếu phn ứng này dương tính, tiến hành ngưng kết tiếp với kháng huyết thanh H:m.

Nếu kết quả dương tính, ngưng kết với các kháng huyết thanh H:q và H:s để kiểm chứng âm.

Nếu những phản ng này âm tính, ngưng kết tiếp vi O:46 và nếu muốn, ngưng kết tiếp với O:12. Nếu O:46 âm tính (và O:12 dương tính), thì serovar của chủng là Enteritidis.

CHÚ THÍCH: Ngoài các yếu tố H:g,m, một số chủng Salmonella Enteritidis có thể cho phản ứng dương tính với kháng huyết thanh H:p hoc H:f hoặc H:t. Tuy nhiên, các chủng này là rất hiếm. Trừ các chủng đặc biệt có th có kháng nguyên H:1,7 như là pha thứ hai

9.2.6.4  Nếu O:7 dương tính

Ngưng kết với kháng nguyên H:r, H:2 và H:5 (có thể cần đo pha).

Nếu H:r và H:2 dương tính, serovar của chủng là: Virchow.

Nếu H:r và H:5 dương tính, serovar của chủng là: Infantis.

Việc phát hiện kháng nguyên H:1 không có khả năng phân biệt và không cần phải kiểm tra bổ sung.

9.2.6.5  Nếu O:8 dương tính

Ngưng kết với các kháng nguyên H:z10 và H:x.

Nếu c hai đều dương tính, ngưng kết tiếp với các kháng huyết thanh O:61 hoặc O:6,7 hoặc O:6,14,24.

Nếu O:61 hoặc O:6,7 hoặc O:6,14,24 dương tính thì các serovar của chủng là:Hadar.

Một số m kháng huyết thanh O:6,7 không phản ứng với chủng O:6,8. Khi mua kháng huyết thanh này, cần chắc chắn rng có phn ứng với chủng O:6,8 (hi các nhà sản xuất).

CHÚ THÍCH: Dạng biến th khun lc có th xảy ra với các biểu hiện của kháng nguyên O:61 bi một số serovar nhóm huyết thanh C2 (Tài liệu tham khảo [11]). Vì lý do đó, không phải lúc nào cũng có thể nhn biết được, ví dụ Salmonella Hadar và Salmonella Istanbul như các serovar rõ ràng.

9.2.7  Ví dụ về đảo pha sử dụng phương pháp Sven Gard

Ví dụ này mô tả việc đảo pha dùng cho việc xác định typ huyết thanh Salmonella Typhimurium. Nhìn chung, phương pháp này cũng áp dụng được cho các serovar Salmonella khác.

Khi O:4 và H:i dương tính, còn H:2 âm tính, thì chun b một đĩa thạch di chuyển (xem A.3 hoặc F.1), với kháng-H:i (ví dụ: hỗn hợp huyết thanh đảo pha có chứa H:i). Chm chủng vi khuẩn vào giữa đĩa thạch.  đĩa từ 34 °C đến 38 °C (6.1) qua đêm (khoảng 18 h).

Sau khi ủ, tàm lại việc ngưng kết chủng với kháng nguyên H:2.

Nếu H:2 lại âm tính, ngưng kết tiếp với H:i.

Nếu H:i âm tính hoặc có phản ứng yếu, thì chủng này không phải là Salmonella Typhimurium.

Nếu H:i cho phn ứng dương tính (mạnh), thì lặp li việc đảo pha. Chuẩn b lại đĩa thạch vi kháng-H:i và lấy vi khun từ điểm xa nhất mọc lan trên đĩa thạch, đảo pha thứ nhất để cấy vào đĩa thứ hai. Lặp lại quy trình đảo pha như trên.

CHÚ THÍCH 1: Đôi khi cn bổ sung kháng huyết thanh H:i vào thạch (của đĩa đảo pha lặp lại) để thu được phản ứng tốt hơn.

CHÚ THÍCH 2: Cũng có thể có các biến thể một pha của Salmonella Typhimurium, ví dụ do thiếu hoặc không thể hiện pha H thứ hai 1.4.[5]12:i:-. Trong khi xác định typ huyết thanh biến thể này, có thể phi lặp lại một lần hoặc nhiều ln việc đảo pha đ loại tr sự có mặt của pha th hai. Ngoài ra, cò th sử dụng phương pháp phân tử để khng đnh có phải biến thể của Salmonella Typhimurium hay không.

10  Kiểm soát chất lượng

Huyết thanh được sử dụng để ngưng kết phải trong (trừ các kháng huyết thanh được sử dụng để thử nghiệm latex). Luôn luôn phải kiểm tra huyết thanh trước khỉ s dụng. Trường hợp b đục, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các quy trình kiểm soát chất lượng của quy trình xác định typ huyết thanh như sau:

– Mỗi tuần làm việc chọn hai chủng (hoặc s lượng chủng chiếm khoảng 2 % khối lượng chủng phân lập được). Mỗi chủng được cấy hai lần. Các chủng cấy chuyển được xử lý như là hai chủng mới phân lập để xác định typ huyết thanh. Sau khi hoàn thành công việc, các kết quả của hai chủng và các chủng cấy chuyển được so sánh về sự khác biệt. Nếu có bất kỳ một sự khác biệt nào, thì sẽ được nghiên cứu tiếp.

– Phòng thử nghiệm u giữ đầy đủ chủng gốc các serovar Salmonella đặc hiệu (ví dụ: từ bộ sưu tập chủng cấy hoặc từ các nghiên cứu so sánh liên phòng). Chủng lưu gốc này, định k (ví dụ: hàng tuần) chọn một hoặc hai serovar của 10 serovar thường gặp nhất trong phòng thử nghiệm để kiểm tra quy trình xác định typ huyết thanh. Các serovar được sử dụng để thực hiện việc kiểm soát chất lượng có thể thay đổi hàng tuần đ đảm bảo rằng trong một khoảng thời gian các kháng huyết thanh khác nhau đều đã được kiểm tra.

– Phải kiểm tra khả năng xác định typ huyết thanh giữa các phòng thử nghiệm khác nhau. Đ thực hiện, nên thưng xuyên tham gia vào các nghiên cứu so sánh liên phòng, khi có thể.

11  Báo cáo kết quả

Đối với các chủng phân lập thuộc S. enterica subsp. enterica, thì báo cáo tên (đầy đ) và khi có thể/khi cần kèm theo công thức kháng nguyên. Đối với các loài (phân loài) khác, thì báo cáo công thức kháng nguyên tìm thấy được.

Các ký hiệu của các công thức kháng nguyên là như sau:

Kháng nguyên-O (cách nhau bằng du phy), kháng nguyên-Vi (nếu có): các kháng nguyên-H của pha đầu tiên (cách nhau bằng du phy): các kháng nguyên-H của pha thứ hai (nếu có; cách bằng dấu phẩy); kháng nguyên-H của pha thứ ba (nếu có).

Ví dụ, theo hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor (Tài liệu tham khảo [9]), công thức Kháng nguyên đầy đủ của Salmonella Typhimurium là: 1,4,[5],12:i:1,2.

Với các kháng nguyên-O O:1,4,[5],12; trong đó yếu tố O được gạch dưới được xác định bng thể thực khun biến trạng và chỉ xuất hiện nếu chủng cy được dung gii bng thực khuẩn thể biến trạng tương ứng và trong du ngoặc vuông ch ra rng có thể có hoặc không có mặt yếu t liên quan đến thực khuẩn thể biến trạng (Tài liệu tham khảo [9]); với các kháng nguyên-H, H:i đối với pha thứ nhất và H:1,2 đối với pha thứ hai.

Để báo cáo chính thức, công thức kháng nguyên của chủng phân lập, tốt nhất là không có ngoặc vuông hoặc không có gạch dưi. Báo cáo công thức kháng nguyên đã được xác định, ví dụ 4,12:i:1,2.

Đối với các phân loài khác của S. enterica, loài có serovar phù hợp được thể hiện bằng ký hiệu sau đây (Tài liệu tham khảo [9]):

II đối với serovar S. enterica subsp. salamae;

llla đối với serovar S. enterica subsp. arizonae;

lllb đối vi serovar S. enterica subsp. diarizonae;

IV đối vi serovar S. enterica subsp. houtenae;

VI đối với serovar S. enterica subsp. indica.

Ví dụ về báo cáo kết quả của các loài khác với S. enterica subsp. enterica là S. II 30:z10:e,n,x,z15.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

A.1  Yêu cầu chung

Trong Phụ lục này đưa ra các môi trường nuôi cấy liên quan đến các phép th sinh hóa (xem Phụ lục C). Thành phần của các môi trường nuôi cấy nêu trong phụ lục này được lấy làm ví dụ. Môi trường nuôi cấy có các tên gọi tương tự có thể được nêu trong tài liệu hoặc được bán sẵn với các thành phần hơi khác nhau. Do đó, điều quan trọng đối với mỗi phép thử sinh hóa cần kiểm tra các phản ứng của môi trường nuôi cấy với các chủng kim chứng dương tính và âm tính điển hình.

ĐIỀU QUAN TRỌNG – Nếu môi trường nuôi cấy hoặc thuốc thử được chuẩn b từ môi trường nuôi cấy hoàn chnh khô hoặc thuốc thử hoặc môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn được sử dụng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất v chuẩn bị, điều kiện bảo qun, hạn sử dụng và cách sử dụng.

Thời hạn sử dụng của các môi trường nuôi cấy nêu trong phụ lục này đã được thể hiện trong một số tài liệu nghiên cứu. Người sử dụng cần kiểm tra xác nhn điều này trong các đều kiện bảo quản của mình [xem TCVN 8128 (ISO 11133)].

A.2  Thạch dinh dưỡng

A.2.1  Thành phần

Chất chiết từ thịt 3,0 g
Peptona 5,0 g
Natri clorua (NaCI)(tùy chọn) 5,0 g
Thạch từ 9g đến 18 gb
Nước 1 000 ml
a Ví dụ: thủy phân casein bng enzym  
b Tùy thuộc vào sức đông của thạch.  

A.2.2  Chuẩn bị

Đun nóng để hòa tan các thành phần trong nước.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyn môi trường nuôi cấy vào bình (6.6) có dung tích thích hợp.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) ở 121 °C trong 15 min.

Chuyển khong 20 ml môi trường đã tan chảy vào các đĩa Petri vô trùng với đường kính 90 mm (6.7). Để cho đông đặc.

Bảo quản các đĩa đã rót (hướng lên trên), tránh hút ẩm và để ở nơi ti ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. Nếu cần, làm khô các đĩa tc khi sử dụng.

A.3  Môi trường thạch  Sven Gard (ví dụ)

A.3.1  Ví dụ 1 (Tài liệu tham khảo [16])

Sử dụng thạch dinh dưỡng với nồng độ thạch ci biến

Cần xác định nồng độ thạch của thạch dinh dưng dùng cho đảo pha H trong đĩa Petri. Nồng độ này có thể thay đổi từ 0,5 % đến 1 % phần khi lượng, tùy thuộc vào mẻ thạch được sử dụng. Môi trường thạch yêu cầu phải đủ mềm cho Salmonella di chuyển dễ dàng trên khắp môi trường sau khi ủ qua đêm từ 34 °C đến 38 °C (6.1). Các thử nghiệm sơ bộ, không bổ sung kháng huyết thanh, do đó cn sử dụng môi trường thạch dinh dưng (pH 7,4) được chun b cho mục đích đó hoặc thạch dinh dưỡng của phòng thử nghiệm thông thường, được làm bán đặc bằng cách bổ sung canh thang với t lệ thích hợp để qua đêm. Thể tích cần cho một đĩa Petri 10 cm là 30 ml.

Việc di chuyển trên bề mặt thạch sẽ dễ hơn nếu bổ sung natri desoxycholate (0,3 g/l) vào môi trường (natri desoxycholate kích thích sự di chuyển), xem A.3.2.

A.3.2  Ví dụ 2

A.3.2.1  Thành phn

Chất chiết từ thịt 5,0 g
Chất chiết nm men 1,0 g
Canh thang đậu tương trypto-casein 30,0 g
Glucose 0,35 g
Natri desoxycholat 1,0 g
Thạch từ 5 g đến 9 ga
Nước 1 000 ml

a Tùy thuộc vào sức đông của thạch. Có th cn ci thiện để xác định nồng độ của thạch đối với môi trường cn thiết cho sự di chuyn tối ưu cSalmonella.

A.3.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH đ sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,6 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy vào bình (6.6) có dung tích thích hợp.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 110 °C trong 20 min.

Làm nguội thạch đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C (6.8), hoặc bảo quản trong chai đậy kín ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

Ngay trước khi sử dụng:

– bổ sung một giọt kháng huyết thanh có liên quan (SG1 đến SG6) vào môi trường tan chy và trộn đều;

– rót khoảng 10 ml vào các đĩa Petri đường kính 55 mm (6.7) hoặc rót khong 20 ml vào các đĩa Petri đường kính 90 mm.

A.4  Canh thang malonat

A.4.1  Thành phn (Tài liệu tham khảo [14])

Amoni sulfat 2,0 g
Dikali phosphat 0,6 g
Monokali phosphat 0,4 g
Natri clorua 2,0 g
Natri malonat 3,0 g
Bromothymol xanh 0,025 g
Nước 1 000 ml

A.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 6,7 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy vi các lượng 5 ml vào các ng cho phép có đủ oxy đ xảy ra phản ứng malonat. Ví dụ, sử dụng các ống kích thước xấp xỉ 22 mm 220 mm.

Khử trùng trong ni hp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Bo qun ở nơi ti ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.5  Canh thang Dulcitol (Tài liệu tham khảo [2])

A.5.1  Môi trường hoàn chnh

A.5.1.1  Thành phn

Chất chiết từ thịt 3,0 g
Peptona 10,0 g
Natri clorua 5,6 g
Chất chỉ th Andrade (A.5.2) 10 ml
Dung dịch Dulcitol (A.5.3) 50 ml
Nước 1 000 ml

a Ví dụ: phân giải casein bng enzym.

A.5.1.2  Chun bị

Hòa tan các thành phần trong nước.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩa 15 ml.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Bảo quản ở nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.5.2  Chất ch thị Andrade

A.5.2.1  Thành phần (sau Andrade-Penny năm 1895; trích dẫn trong Tài liệu tham kho [7])

Fuchsin axit 0,5 g
Natri hydroxit (1,0 mol/l) 0,5 g
Nước 1 000 ml

A.5.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan fuchsin trong nước, thêm natri hydroxit. Nếu sau vài giờ mà fuchsin không mất màu thì thêm 1 ml hoặc 2 ml natri hydroxit. Thuốc thử này có hạn sử dụng dài và cần chuẩn bị một lượng đủ lớn để dùng trong nhiu năm.

A.5.3  Dung dịch Dulcitol

A.5.3.1  Thành phần

Dulcitol 10 g
Nước 1 000 ml

A.5.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan dulcitol trong nước.

Tiệt trùng bng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm.

Bo quản ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.6  Dung dịch ONPG (0,013 3 mol/l) (Tài liệu tham khảo [2])

A.6.1  Môi trường hoàn chnh

A.6.1.1  Thành phần

o-Nitrophenyl-D-galactoside (ONPG) 0,08 g
Dung dịch mononatri phosphat (NaH2PO4.H2O; A.6.2) 5 ml
Nước 15 ml

A.6.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan ONPG trong nước ở khoảng 37 °C. Thêm dung dịch NaH2PO4 1,0 mol/l (A.6.2.1). Dung dịch phải không màu. Bảo quản dung dịch ở 5 °C (6.3).

Trước khi sử dụng, làm ấm một lượng thích hợp (đủ cho s lượng phép thử) dung dịch ONPG đến khoảng 37 °C.

A.6.2  Dung dịch mononatri phosphat (1,0 mol/l)

A.6.2.1  Thành phần

NaH2PO4.H2O 6,9 g
Dung dịch NaOH, 300 g/l 3 ml
Nước 45 ml

A.6.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan NaH2PO4.H2O trong nước. Thêm dung dịch NaOH 300 g/l và chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ( 25 °C). Thêm nước đến 50 ml và bo quản dung dịch ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.7 Canh thang D-tartrat (axit tartrat hữu cơ)

A.7.1  Thành phn

Peptona 10,0 g
Kali natri (+) tartrat 10,0 g
Dung dịch bromothymol xanh, 10 g/l 2,4 ml
Nước 1 000 ml

a Ví dụ: phân gii casein bng enzym.

A.7.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cn.

Chnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ng có dung tích danh định 15 ml.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 115 °C trong 10 min.

Bảo quản ở nơi ti ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.8  Dung dịch chì axetat

A.8.1  Thành phần

Chì axetat khoảng 50 g
Nước 10 ml

A.8.2  Chuẩn bị

Cho nước vào chai có nắp vặn thích hợp. Bổ sung đủ lượng chì axetat để tạo dung dịch bo hòa (nghĩa là có thấy chì axetat không tan rõ trên đáy chai).

Bảo qun ở nhiệt độ phòng đến 6 tháng.

A.9  Canh thang tim-não (BHI)

A.9.1  Thành phần

Bột não 12,5 g
Bột tim bò 5,0 g
Pepton proteose 10,0 g
Glucose 2,0 g
Natri clurua 5,0 g
Dinatri phosphat 2,5 g
Nước 1 000 ml

A.9.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bng cách đun nóng, nếu cần.

Chnh pH đ sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyn môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩa 15 ml.

Kh trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Bo qun nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.1 Dung dịch nước muối formal (1 % phần th tích)

A.10.1  Thành phần

Dung dịch formaldehyd, 370 g/l 40,0 ml
Dung dịch natri clurua 170 g/l 200 ml
Nước Lên đến 4 000 ml

A.10.2  Chuẩn bị

Cho dung dịch formaldehyd vào dung dịch natri clurua. Thêm nước đến tổng th tích 4 I.

A.11  ỐNG Craigie

A.11.1  Thành phần

Canh thang dinh dưnga 25,0 g
Thạch 2,75 g
Nước 1 000 ml

a Đối với các thành phn, xem A.2 (không có thạch).

A.11.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phn trong nước bằng cách đun nóng.

Chnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ng hoặc chai miệng rộng có nắp vặn có dung tích danh nghĩa khoảng 15 ml và chứa các ống Craigie (các ống hẹp ngắn, mở ở c hai đầu). Ống Craigie cn cao hơn bề mặt thạch.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 115 °C trong 10 min.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng đến 2 tháng.

A.12  Gelatin dinh dưng

A.12.1  Thành phn

Chất chiết từ thịt 3,0 g
Peptona 5,0 g
Gelatin 120,0 g
Nước 1 000 ml

a Ví dụ: phân giải casein bằng enzym.

A.12.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bng cách đun nóng.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng tà 6,8 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi nuôi cấy trường với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩa 15 ml.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Để môi trường nguội theo vị trí thẳng đứng và bảo quản ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về các quy trình xác định typ huyết thanh của chủng phân lập Salmonella chưa biết

Trong Hình B.1 chỉ ra các bước cần thực hiện trưc khi xác định typ huyết thanh các chủng phân lập Salmonella. Đưa ra các đề xuất về cách xử lý với các chủng tự ngưng kết (chủng thô), xem 9.2.3.

Các ví dụ về quy trình có thể được sử dụng để xác định typ huyết thanh chủng phân lập Salmonella chưa biết được tóm tắt trong Bảng B.1 và Hình B.2. Trong Bng B.2 đưa ra thông tin về thành phần của các kháng huyết thanh đa giá (có thể khác nhau giữa các nhà cung cấp). Hình B.2 và Bảng B.2 thu được từ Tài liệu tham khảo [6].

Hình B.1 – Các bước cần thực hiện trưc khi xác định typ huyết thanh Salmonella spp.

Bảng B.1 – Quy trình xác định typ huyết thanh chủng phân lập Salmonella chưa biết bằng cách ngưng kết với các kháng huyết thanh OMA và OMB đa giá

Bước 1

Phân tích kháng nguyên-O

Sử dụng các kháng huyết thanh đa giá

1.1             OMA

Nếu dương tính: bước 2.1.1

Nếu âm nh: sang bưc 1.2

1.2                OMB

Nếu dương tính: bước 2.2.1

Nếu âm tính: xem chú thích a

Bước 2

Phân tích kháng nguyên-O

Sử dụng các nhóm kháng huyết thanh đặc hiệu – dùng cho một chủng phân lp đối với nhóm huyết thanhb

2.1.1    O:4,5 hoặc nhóm B

Nếu dương tính: bước 3.1.1

Nếu âm tính: bưc 2.1.2

2.1.2     O:9 hoặc nhóm D

Nếu dương tính: bước 3.1.2

Nếu âm tính: bước 2.1.3

2.1.3    O:3,10,15 hoặc nhóm E

Nếu dương tính: bước 3.1.3

Nếu âm tính: bưc 2.1.4

2.1.4       O:21 hoặc nhóm L

Nếu âm tính: bước 2.1.5

2.1.5     O:1,2 hoặc nhóm A

2.2.1   O:6,7,8 hoặc nhóm C

Nếu dương tính: bước 3.2.1

Nếu âm tính: bước 2.2.2

2.2.2  O:13.22,23 hoặc O:13

Nếu dương tính: bưc 3.2.2

Nếu âm tính: bước 2.2.3

2.2.3               O:11

Bước 3

Phân tích kháng nguyên-O

Sử dụng các kháng huyết thanh đơn giá – nhận biết serovar kháng nguyên-O đặc hiệu

3.1.1   Chng phân lập nhóm B:

O:5, O:27

3.1.2   Chủng phân lập nhóm D:

O:46 đối với nhóm D2

O:2đối với nhóm D3

3.1.3 Chủng phân lập nhóm E:

O:10,O:15,O:34 đi với nhóm E1

O:19 đối với nhóm E4

3.2.1 Chủng phân lập nhóm C

O:7 đối với nhóm C1

O:8, O:61O:20 đối với nhóm C2-3

O:14, O:24, O:25 đối vi nhóm H

3.2.2  Chng phân lập nhóm G

O:22, O:23

Bước 4

Phân tích kháng nguyên lông

Sử dụng các kháng huyết thanh đa giá

H đa giá (pha 1 và pha 2)

H đa giá (pha 2)

Sử dụng các kháng huyết thanh đơn giá

H:1(1,2) → (H:2, H:5, H:6, H:7)d

H:a, H:b, H:c, H:d,

H:E→(H:h, H:n, H:x, Hz15)d

H:G(g.m) → (H:f, H:g, H:m; H:p, H:q H:s, H:t, H:u]d

H:i, H:k.

H:L→(H:v, H:w, H:l,z13, H:l,z28)d

H:y H:z,

H:Z4→ (H:z23, H:z24H:z32)d

H:z6, H:z10, H:z29, H:z35, v.v…

a Trong trường hợp phng âm tính với cả hai kháng huyết thanh đa giá thì thử phân lập tiếp với kháng huyết thanh đa giá hoặc nhóm kháng huyết thanh đặc hiệu cho phép nhận biết lên đến nhóm O:67 hoặc gửi chủng phân lập đến phòng th nghiệm chun.

b Nếu trong Bưc 1 kháng huyết thanh đa giá của kháng thể khác với OMA và OMB được sử dụng thi kháng huyết thanh nhóm đặc hiệu trong bước 2 phải được sa lại tương ứng.

c Có th b qua việc sử dụng kháng huyết thanh đa giá kháng H và chọn kháng huyết thanh đơn giá tương ứng với bằng chng phân lp serovar của nhóm huyết thanh được ước tính.

d Kháng huyết thanh trong ngoặc đơn cần thiết đ nhn biết các kháng nguyên của phức hợp kháng nguyên H tương ứng.

 

Có th sử dụng huyết thanh O:1,2 đ kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên O:1

a) Các kháng nguyên thân – Các phép thử tun tự có th tiến hành với các kháng huyết thanh đơn giá và đa giá để phát hiện kháng nguyên Salmonella thân (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước tiếp theo trong dãy hàng ngang được thực hiện khi các thử nghiệm trưc đó cho thy có phản ứng dương tính (ví dụ: nếu O:4,5  dương tính, thì tiếp theo kiểm tra đối với O:5, v.v…). Thành phần của các kháng huyết thanh đa giá được s dụng trong sơ đ được đưa ra trong Bng B.2.]

b) Kháng nguyên lông – Các phép thử tuần tự có thể tiến hành với các kháng huyết thanh đơn giá và đa giá để phát hiện các kháng nguyên Salmonella lông (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước tiếp theo trong đường ngang được thực hiện khi các th nghiệm trước đó cho thấy có phản ứng dương tính. Thành phn của các kháng nguyên đa giá được sử dụng trong sơ đ này được nêu trong Bảng B.2.]

Hình B.2 – Phát hin kháng nguyên

Bảng B.2 – Thành phần của các kháng huyết thanh đa giá liên quan đến Hình B.2 (Tài liệu tham khảo [6])

Yếu t

Kháng huyết thanh đa giá

Kháng nguyêtương ứng

O

OMA

1,2,12 + 4,5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3,19 + 21

OMB

6,7 + 6,8+ 11 + 13,22+ 13,23 + 6,14,24 + 8,20

H

H1

1,2 + 1,5 + 1,6 + 1,7 + z6

HE

e,h + e,n,x + e,n,z15

HG

f,g + g,p + g,m,s + g,m + m,t

HMA

a + b + c + d + i + z10 + z29

HMB

e,h + e,n,x + e,n,z15 + G

HMC

k + y + L + z4 + r

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phép thử sinh hóa

C.1  Phân biệt các phân loài Salmonella

C.1.1  Yêu cu chung

Để phân biệt các phân loàSalmonella, cần thực hiện một số phép thử sinh hó(xem bng 2). Một số ví dụ v các phép thử được đưa ra trong C.1.2 đến C.1.5.

C.1.2  Phép thử malonat

Cấy vào canh thang malonat (xem A.4) dịch cấy thu được từ thạch nghiêng hoặc từ canh thang mới cấy (tốt nhất là cấy một vòng cy 3 mm đầy canh khun).

Ủ ấm canh thang đã cấy trong khong từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và quan sát phản ứng sau 24 h ± 3 h và sau 48 h ± 3 h.

Trong trường hợp có phản ứng dương tính, màu sắc của môi trường thay đổi từ màu xanh lá cây sang màu xanh chàm (Prussian blue).

C.1.3  Phép th dulcitol

Cấy vào canh thang dulcitol (xem A.5) vi 1 ml canh khun hoặc từ môi trường thạch nghiêng mới.

Ủ canh thang đã cy trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và quan sát các phản ứng sau 24 h ± 3 h và sau 48 h ± 3 h.

Trong trường hợp có phản ứng dương tính (axit hóa), thì môi trường sẽ chuyn sang màu hng.

C.1.4  Phép thử ONPG

Nuôi cy chủng phân lập cần thử nghiệm trên thạch dinh dưỡng nghiêng (hoặc môi trường khác) (xem A.2) có chứa 1,0 % khối lượng lactose. Nhũ hóa mọt vòng cấy đầy sinh khối vi khuẩn vào 0,25 ml dung dịch nước muối sinh lý để thu được huyn phù “đặc. Thêm 1 giọt toluen vào mỗi ống và lắc đều để gii phóng enzym.

Để các ống ở nhiệt độ trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 5 min.

Thêm 0,25 mol dung dịch ONPG 0,013 3 mol/l (A.6) vào mỗi ống dung dịch huyền phù cần th nghiệmỦ các ống trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và kiểm tra các ống ở các khong thời gian đến 24 h. Màu vàng chứng tỏ kết quả dương tính.

C.1.5  Phép thử gelatinase

Cấy đâm sâu chất cấy thu được từ chủng cấy thuần được  “qua đêm” vào môi trưng gelatin dinh dưỡng (xem A.12).

Ủ các ống trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 24 h ± 3 h.

Đặt ống trong nước đá hoặc để trong t lạnh khoảng 30 min. Nếu gelatin b phân giải, thì môi trường trong ng đông đặc sau khi làm lạnh, điều này cho thấy sự có mặt của gelatinase.

Ngoài ra, ống có thể được ủ ở 25 °C đến 1 tuần, kiểm tra hàng ngày về sự hóa lỏng của gelatin. Vì gelatin có thể hóa lng ở nhiệt độ 28 °C, nên cần làm mát các ống đã  đ đảm bảo rằng việc hóa lng là do gelatinase và không phải do nhiệt độ ủ. Điều này có thể hữu ích cho việc sử dụng một ống không nuôi cấy làm kiểm chứng.

C. 2  Phân biệt giữa Salmonella Paratyphi B và Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java

Để phân biệt giữa Salmonella Paratyphi B và Salmonella Paratyphi B biovar Java, cn thực hiện phép thử phản ứng trên D-tartrat. Ngoài ra, có thể thực hiện phép thử PCR, như trong Tài liệu tham khảo [15].

Đối với phản ứng D-tartrat, có th thực hiện quy trình sau đây (Tài liệu tham khảo [1]).

– Nuôi cấy chủng cần thử nghiệm trên môi trường thạch không chọn lọc.

– Hòa khuẩn lạc trong dung dịch nước muối 8,5 g/l đến mật độ khong 109 cfu/ml.

– Cấy các phần 50 µl của từng chủng vào hai ống chứa canh thang D-tartrat (xem A.6). Cũng cấy hai chủng kim chứng vào hai ống canh thang D-tartrat. Phép kiểm chứng: dương tính là Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java, âm tính là Salmonella Paratyphi B.

–  các ống hiếu khí (không lắc) trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 18 h ± 2 h.

– Sau khi ủ, kiểm tra các ống về sự đổi màu. Nếu môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng thì chứng tỏ phản ứng dương tính.

– Thêm vào một dãy các ống đựng canh thang mỗi ống 0,5 ml dung dịch chì axetat bão hòa (xem A.8) và để yên các ống tối thiểu 30 min để cho kết tủa lắng xung.

– Sau đó, kiểm tra các ống v kết tủa (thường sau 1 h đến 2 h). Trường hợp phản ứng dương tính thì có kết tủa lắng ở đáy ng và trường hợp phản ứng âm tính thì kết tủa vẫn còn lơ lng trong môi trường canh thang. Các ống nghiệm này được so sánh với các ống kiểm chứng dương tính và âm tính. Nếu phép thử dương tính thì chủng được coi là Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java và ng D-tartrat th hai được loại b.

– Nếu phép thử âm tính thì ống thứ hai và các ống kiểm chứng được  thêm 6 ngày (tổng thời gian ủ là 7 ngày).

– Sau khi  xong, bổ sung chì axetat vào các ng như trên.

– Các chủng dương tính sau 7 ngày được coi là Salmonella Paralyphi B typ sinh học Java và chủng âm tính được coi là Salmonella Paratyphi B.

 

Phụ lục D

(tham kho)

Sơ đồ tổng thể về xác định typ huyết thanh của năm sarovar Salmonella có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng

0:4

0:9

0:7

0:7

0:8

+

+

+

+

+

(O:5→ + hoặc -)

H:G hoặc H:g

H:r

H:r

H:z10

+

+

+

+

H:i

H:m

H:2

H:2

H:x

+

H:2

+

+

+

+

H:q, H:s

H:5

H:5

O:6 (O:61, O:6,7) hoặc O:6,14,24]

+

+

0:46

Salmonella ser. Typhimurium

Salmonella ser. Enteritidis

Salmonella ser. Virchow

Salmonella ser. Infantis

Salmonella ser. Hadar

 

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phương pháp đĩa chuẩn độ vi giếng để xác định typ huyết thanh Salmonella spp.

E.1  Yêu cu chung

Quy trình nêu trong phụ lục này được dựa trên Tài liệu tham khảo [21].

Trong các phòng thử nghiệm việc xác định typ huyết thanh với số lượng lớn các chủng Salmonella, sử dụng kỹ thuật đĩa chuẩn độ vi giếng kết hợp với hệ thống phân phối kháng huyết thanh bán tự động vào các đĩa có thể có nhiều ưu điểm.

Tổng quan về các phương pháp:

– Các huyền phù vi khun được chun bị để phát hiện các kháng nguyên O (huyền phù-O) và các kháng nguyên-H (huyền phù H). Huyền phù vi khuẩn được chun bị bằng cách nuôi cấy từng chủng cn thử nghiệm trong hai canh thang não-tim (xem A.9): một trong chai đối với huyền phù O và một trong ống nghiệm đối với huyền phù H. Cả hai canh thang được ủ ở nhiệt độ trong khong từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 4 h đến 5 h.

– Sau khi ủ, các huyền phù O được hấp bằng hơi nước trong 30 min và sau đó pha loãng vi một lượng tương đương dung dịch nước mui 8,5 g/l.

– Sau khi ủ, các huyền phù H bị diệt bằng cách thêm một lượng tương đương dung dịch nước muối formal 1 % (xem A.10) và để yên ở nhiệt độ phòng qua đêm trước khi thử nghiệm.

– Kháng huyết thanh được phân phi vào đĩa 96 giếng đáy tròn, sử dụng pipet đa kênh hoặc hệ thống phân phối tự động. Các đĩa đã chun bị có thể được gắn kín và bảo qun ở 5 °C (6.3) tối đa 2 tuần.

– Các huyền phù O và H đã chuẩn bị được phân phối thủ công vào các đĩa vi giếng đã được chun b, sử dụng pipet bằng cht dẻo dùng một lần hoặc pipet có đầu tip dùng một lần.

– Các đĩa ngưng kết O được gắn kín và ủ ở 50 °C (6.9) trong 18 h ± 3 h.

– Các đĩa ngưng kết H được ủ trong 2 h trong ni cách thủy ở 50 °C (6.9). Tt nhất là sử dụng ni cách thủy có giá đỡ không có lỗ nằm ngang bằng mức nước.

– Sau khi ủ, kiểm tra ngưng kết. Quan sát sự ngưng kết lắng dưới đáy giếng và tốt nhất là quan sát từ phía dưới đĩa, sử dụng gương.

Trước khi sử dụng; xác định độ chuẩn của các kháng huyết thanh cần thử nghim trong các đĩa vi giếng.

Các kháng huyết thanh dự định sử dụng trong phương pháp đĩa vi giếng là 23 kháng huyết thanh-O được sắp xếp trong hai đĩa vi giếng có kiểm soát dung dịch mui trong đĩa thứ hai. Đĩa đu tiên chứa kháng huyết thanh-O đa giá (PSO), bảy kháng huyết thanh đối với các nhóm 4,5,12; 6,7; 6,8; 9,12; 3,10; 13,22; 6,14,24 và bốn kháng huyết thanh hấp thụ 1, 20, 27 và 46. Các đĩa thứ hai chứa các kháng huyết thanh hấp thụ 4, 5, 7,8,9,10,14,15,19, 22 và 23.

E.2  Đĩa vi giếng 1 đối với các kháng nguyên O

Cột của đĩa

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Huyết thanh trong từng giếng của cột

PSO

4,5,12

6,7

6,8

9,12

3,10

13,22

6,14,24

1

20

27

46

E.3  Đĩa vi giếng 2 đối với các kháng nguyên O

Cột của đĩa

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Huyết thanh trong từng giếng của cột

4

5

7

8

9

10

14

15

19

22

23

Kiểm chứng

Mỗi chủng được thử nghiệm đối với tất cả các huyết thanh trong đĩa vi giếng. Tám chủng có thể được thử nghiệm trong mỗi bộ hai đĩa vi giếng.

Đ xác định kháng nguyên-H, mỗi chủng được thử nghiệm với một bộ gồm 11 kháng huyết thanh và nước muối kiểm chứng. Các kháng huyết thanh được gợi ý là Salmonella H đa giá (PSH 1+2) có chứa kháng thể H = a cho đến H = z29 để bao trùm pha 1 và kháng thể đối với pha 2 phức H = 1,2,5,6,7 (PSH 2). Bốn kháng huyết thanh đối vi các phức H = E;G;L;1,2,5,6,7 và sáu kháng huyết thanh hấp thụ đối với H = b,d,i,r,z,z10

E.4  Đĩa vi giếng đối với các kháng nguyên-H

Cột của đĩa

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Huyết thanh trong từng giếng của cột

PSH 1+2

E

G

L

PSH2

b

d

i

r

z

z10

Kiểm chứng

Việc nhận biết pha 1 là hoàn chnh đối với các chủng ngưng kết với PSH 1+2 và một trong sáu kháng huyết thanh hấp thụ và không cn tiếp tục thử đối với pha 1. Đối với các chủng ngưng kết với PSH và một trong bốn phức, thì cần thử nghiệm tiếp để nhận biết các kháng nguyên đơn giá. Các chủng chỉ ngưng kết với PSH được thử nghiệm với các kháng huyết thanh H = a,c,k,y,z4 và z29.

Sau khi đảo pha, cần lặp lại quy trình thử kháng nguyên-H để xác định các Kháng nguyên của pha khác.

 

Phụ lục F

(Tham khảo)

Ví dụ về các quy trình đảo pha

F.1  Phương pháp Sven Gard rút gọn

Phương pháp này được trích dẫn từ Tài liệu tham khảo [8], [13].

Chuẩn bị đĩa Petri đưng kính 55 mm (6.7) vi 10 ml thạch di động bồ mặt đã đông đặc (A.3). Thêm 0,1 ml kháng Salmonella H từng git một và dàn đều trên bề mặt, sử dụng một thìa vô trùng (thy tinh). Cấy chủng tại một điểm duy nhất ở giữa đĩa.

 đĩa đã cấy ở 34 °C đến 38 °C (6.1) từ 18 h đến 21 h. Chủng di động trên bề mặt không bị ức chế pha H sử dụng để xác định lần thứ hai.

Phương pháp rút gọn này thường cho phép nhận biết pha thứ hai ở lần thử đầu tiên. Phương pháp này có ưu thế là các đĩa thạch được chuẩn bị trước và được bo qun để sử dụng khi cần nhằm ci thiện sự biểu hiện của kháng nguyên-H hoặc để xác định pha.

F.2  Phương pháp ống Craigie

F.2.1  Yêu cầu chung

Ống Craigie được sử dụng để biểu lộ kh năng di động. Phương pháp này gồm có một ống hoặc lọ rộng miệng, có nắp vặn, có chứa thạch bán đặc (thạch từ 0,2 % đến 0,4 % phần khối lượng) ở giữa có ống hẹp, ngắn mở ở hai đu, sao cho nó nhô ra trên mặt thạch (xem Hình F.1). cẩn thận cấy đâm sâu chủng cn thử nghiệm vào trong từng ống. Sau khi ủ, lấy chủng cấy trên bề mặt thạch di động bên ngoài ống trung tâm tạo ra một qun thể tế bào di động (Tài liệu tham kho [5]).

F.2.2  Chuẩn b ống Craigie cho đảo pha

– Đặt ống môi trường Craigie (xem A.11) vào trong nồi hấp (hoặc các thiết bị thích hợp khác) trong 30 min để làm tan chảy thạch.

– Đặt ống Craigie với thạch đã tan chảy vào trong nồi cách thủy ở 47 °C đến 50 °C (6.8) đ cho cân bằng nhiệt.

– Thêm 200 ml kháng huyết thanh cần thiết vào ống Craigie.

– Trộn đều bằng cách lắc nhẹ.

– Đặt ống Craigie ở 5 °C (6.3) để cho đặc lại.

F.2.3  Quy trình đảo pha sử dụng ng Craigie

– Cấy Salmonella vào ống Craigie bằng que cấy nhựa dùng một ln hoặc que cấy thẳng (chủng cấy được cấy vào trong ống bên trong).

– Ủ ống Craigie ở nhiệt độ trong khoảng từ 34 °C đến 30 °(6.1).

– Kim tra sự phát triển vi khun trong ống Craigie sau 24 h, 48 h  72 h.

– Khi xut hiện vi khuẩn trên b mặt thạch (bên ngoài ống trung tâm), gạt phần vi khuẩn phát triển vào canh thang não-tim (xem A.9).

– Sau đó canh khuẩn được đêm thử về kháng nguyên-H của nó.

CHÚ DN

1  nắp  đường đi của Salmonella sau đảo pha
 miệng ống  b mặt được cấy truyn
 đim cy 7  ống Craigie
 môtrường bán đc  

Hình F.1 – Phương pháp ng Craigie

F.3  Phương pháp cầu-giy

Quy trình nêu trong điều này được lấy từ Tàliệu tham khảo [4], là quy trình được sửa đổi từ quy trình ban đầu nêu trong Tài liệu tham khảo [23].

Xem Hình F.2. Lấy một dải thạch trypton đậu tương (rộng 1 cm) đ tạo thành rãnh đi qua tâm của đĩa. Các dài giấy lọc (3 mm x 3 cm) được bố trí trên rãnh này. Kháng huyết thanh dựa theo pha nhận biết được chấm vào giữa cầu-giấy (được nhận biết bằng các vòng tròn màu trắng). Các chủng vi khuẩn được cấy vào phần cuối bên trái của các dải (được nhận biết bằng các vòng tròn màu trắng). Sau khi ủ, các pha biến thể, th hiện một kháng nguyên lông khác, di chuyển về phía cuối bên phải của di. Sau khi ủ 16 h, có thể nhìn thấy sự phát triển vi khuẩn xung quanh viền giấy lọc (thể hiện bằng các điểm tam giác màu trắng). Các chủng được cấy trong đĩa ở Hình F.2 là (A) S. Choleraesuis var. Kunzendorf (6,7:c:-); (B) S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); và (C) S. Stanley (4,5,12:d:1;2)

Hình F.2 – Phương pháp cầu-giy đối với đảo pha Salmonella

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ALFREDSSON G.A., BARKER R.M., OLD D.C., DUGUID J.p. Use of tartaric acid isomers and citric acid in the biotyping of Salmonella typhimurium. J. Hyg. (Lond). 1972, 70 pp. 651-666

[2] US Food and Drug officials. 2001.BacteriologicalAnalyticalManual.BAMR53:ONPGtest. Available (viewed 2013-06-04] at: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm062262.htm

[3] BRENNER F.W., VlLLAR R.G., ANGULO F.J.TAUXE R., SWAMINATHAN B. Salmonella nomenclature. J. Clin. Microbiol. 2000, 38 pp. 2465-2467

[4] CHIOU C.S., HUANG J.F., TSAI L.H., Hsu K.M., LIAO C.S., CHANG H.L. A simple and low-cost paper- bridged method for Salmonella phase reversal. Diagn. Microbiol. InfectDis. 2006, 54 pp. 315-317

[5] Craigie J. STUDIES ON THE SEROLOGICAL REACTIONS OF FLAGELLA OF B. TYPHOSUS. J. IMMUN. 1931, 21 p. 417

[6] DANAN C., FREMY S., MOURY F., BOHNERT M., BRISABOIS A. 2009. Determining the serotype of isolated Salmonella strains in the veterinary sector using the rapid slide agglutination test. Cahiers de la Référence, N°.2, CR2-09M01, December 2009. Available (viewed 2013-06-04] at: http://www.afssa.fr/euroreference/numero2/index.htm

[7] EWING W.H. Edwards and Ewing’s identification of Enterobacteriaceae. New York:Elsevier, Fourth edition, 1986

[8] GARD s. Das Schwarmphanomen in der Salmonella-Gruppe und seine praktische Ausniitzung. [The swarming phenomenon in the Salmonella group and its practical use], z. Hyg. Infektionskr. 1938,120 pp. 615-619.

[9] GRIMONT P.A.D., & WEILL F.-X. 2007. Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9th edition1). WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Paris:lnstitut Pasteur. Available (viewed 2013-06-04] at:http://www. pasteur.fr/ip/portal/action/ WebdriveActionEvent/oid/01s-000036-089.

[10] GUIBOURDENCHE M., ROGGENTIN R, MlKOLEIT M., FlELDS P.I., BOCKEMÜHL J., GRIMONT P.A.D. et al. Supplement 2003-2007 (No. 47) to the White-Kauffmann-Le Minor scheme. Res. Microbiol. 2010,161 pp. 26-29

[11] HENDRIKSEN R.S., MlKOLEIT M., CARLSON V.P., KARLSMOSH s., VlEIRA A.R., [ENSEN A.B., et al. WHO Global Salm-Surv Exlernal Quality Assurance System for Xác định typ huyết thanh of Salmonella– Isolates from 2000 to 2007. J. Clin. Microbiol. 2009, 47 pp. 2729-2736

[12] KAUFFMANN F. On the principles of classification and nomenclature of EnterobacteriaceaeInt. Bull. Bacteriol. NomenclTaxon. 1959, 9 pp. 1-6

[13] KOEHN A; Technical modification of the swarming plate method according to Sven Gard in Salmonella diagnosisZentralbl. Bakteriol. 1970, 215 pp. 449-455

[14] LEIFSON E. Fermentation of natri malonate as a means of differentiating Aerobacter and Escherichia coli. ]. Bacteriol. 1933, 26 pp. 329-330

[15] MALORNY B., BUNGE C., HELMUTH R. Discrimination of D-tartrate-fermenting and non-fermenting Salmonella entérica subsp. entérica isolates by genotypic and phenotypic methodsJ. Clin. Microbiol. 2003, 41 pp. 4292-4297

[16] POPOFF M. Y. Guidelines for the preparation of Salmonella antisera. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Paris:lnstitut Pasteur, 2001

[17] POPOFF M.Y., & LE MINOR L.E. Genus XXXIII. Salmonella Lignieres 1900, 389. InBRENNER D. J., KRIEG N.R., STALEY J.T. editorsBergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd edition, Vol. 2. The Proteobacteria, Part B The Gammaproteobacteria. New York, NY:Springer, 2005, pp. 764-799

[18] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., BRENNER F.W. Supplement 1998 (No. 42] to the Kauffmann- White scheme. Res. Microbiol. 2000, 154 pp. 63-65

[19] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., GHEESLING L.L. Supplement 2001 (No. 45] to the Kauffmann- White scheme. Res. Microbiol. 2003, 151 pp. 173-174

[20] American Society for Microbiology. Publications Board meeting minutesSalmonella nomenclature. ASM News. 1999, 65 p. 769

[21] SHIPP C.R., & ROWE B. A mechanized microtechnique for Salmonella serotyping. J. Clin. Pathol. 1980, 33 pp. 595-597

[22] TINDALL B.J., GRIMONT P.A.D., GARRITY G.M., EUZEBY J.P. Nomenclature and taxonomy of the genus SalmonellaInt.J.Syst.Evol. Microbiol. 2005, 55 pp. 521-524

[23] Wang T.K., TSENG T.C., LEE J.H., Wang W.T., TSAI J.L., Ho S.I., Pan T.M. Analysis of Salmonella serovars in Taiwan by the phase induction method] [Article in Chinese]. Zhanghua Min Guo Wei Shang Wu Ji Mian YiXue Za Zhi [Chin. J. Microbiol. Immunol.]. 1994, 27, pp. 13-24



1) Supplementto the White-Kauffmann-Le Minor scheme are published in Res. Microbiol., a publication of the Institut Pasteur (formerly Ann. Inst. Pasteur/Microbiol), e.g. Reference [10].

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10780-3:2016 (ISO/TR 6579-3:2014) VỀ VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA – PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP
Số, ký hiệu văn bản TCVN10780-3:2016 Ngày hiệu lực
Loại văn bản Tiêu chuẩn Việt Nam Ngày đăng công báo
Lĩnh vực Khoa học - Công nghệ
An toàn thực phẩm
Ngày ban hành
Cơ quan ban hành Tình trạng Còn hiệu lực

Các văn bản liên kết

Văn bản được hướng dẫn Văn bản hướng dẫn
Văn bản được hợp nhất Văn bản hợp nhất
Văn bản bị sửa đổi, bổ sung Văn bản sửa đổi, bổ sung
Văn bản bị đính chính Văn bản đính chính
Văn bản bị thay thế Văn bản thay thế
Văn bản được dẫn chiếu Văn bản căn cứ

Tải văn bản