TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10714:2015 (ISO 11053:2009) VỀ DẦU, MỠ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH ĐƯƠNG LƯỢNG BƠ CACAO TRONG SÔCÔLA SỮA

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10714:2015

ISO 11053:2009

DẦU, MỠ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH ĐƯƠNG LƯỢNG BƠ CA CAO TRONG SÔCÔLA SỮA

Vegetable fats and oils – Determination of cocoa butter equivalents in milk chocolate

Lời nói đầu

TCVN 10714 :2015 hoàn toàn tương đương với ISO 11053:2009;

TCVN 10714:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

DẦU, MỠ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH ĐƯƠNG LƯỢNG BƠ CA CAO TRONG SÔCÔLA SỮA

Vegetable fats and oils – Determination of cocoa butter equivalents in milk chocolate

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp phát hiện và định lượng đương lượng bơ caocao (CBE) và chất béo sữa (MF) trong sôcôla sữa bằng biểu đồ triacylglycerol (TAG) sử dụng sắc kí khí lỏng mao quản có độ phân giải cao (HR-GLC) và sau đó đánh giá dữ liệu bằng phân tích hồi qui bình phương nhỏ nhất từng phần và phân tích hồi qui. Giới hạn phát hiện đối với hỗn hợp CBE là 0,5 g CBE/100 g sôcôla sữa và giới hạn định lượng phần khối lượng CBE bổ sung vào sôcôla sữa là 5 % với sai số dự đoán là 0,7 g CBE/100 g sôcôla sữa.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1. Hàm lượng chất béo sữa của sôcôla sữa (milk fat content of milk chocolate)

Phần khối lượng của chất béo sữa trong sôcôla sữa được xác định bằng qui trình qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Phần khối lượng được biểu thị bằng số gam trên 100 g sôcôla sữa.

2.2. Đương lượng bơ cacao (cocoa butter equivalents)

Dầu thực vật và các chất béo không chứa cacao phát hiện được trong sôcôla sữa bằng qui trình qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Kết quả được biểu thị một cách định tính, nghĩa là CBE có mặt/CBE không có mặt (CÓ/KHÔNG).

2.3. Hàm lượng đương lượng bơ caocao của sôcôla sữa (cocoa butter equivalent content of milk chocolate)

Phần khối lượng của các chất xác định được bằng qui trình qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Phần khối lượng được biểu thị bằng số gam trên 100 g sôcôla sữa.

3. Nguyên tắc

Mẫu thử, nghĩa là các chất béo sôcôla thu được từ sôcôla sữa, sử dụng qui trình chiết nhanh chất béo, được tách bằng HR-GLC thành các phân đoạn TAG theo khối lượng phân tử tương đối và mức độ chưa bão hòa. Các phân đoạn TAG riêng lẻ, như 1-palmitoyl-2-stearoyl-3-butyroyl-glycerol (PSB), 1,3-dipalmitoyl-2-oleoyl-glycerol (POP), 1-palmitoyl-2-oleoyl-3-stearoyl-glycerol (POS), 1-palmitoyl-2,3- dioleoyl-glycerol (POO), 1,3-distearoyl-2-oleoyl-glycerol (SOS) và 1-stearoyl-2,3-dioleoyl-glycerol (SOO) được sử dụng:

a) để tính hàm lượng MF trong chất béo sôcôla (số gam MF trên 100 g chất béo sôcôla);

b) để xác định sự có mặt/không có mặt của các CBE trong chất béo sôcôla, dùng phương thức hồi qui tuyến tính đơn giản dựa vào TGA, POP, POS và SOS, được hiệu chính về sự phân bố TGA bắt nguồn từ MF, và nếu qui trình này cho thấy mẫu không phải bơ ca cao tinh khiết (CB);

c) để xác định hàm lượng hỗn hợp CBE trong chất béo sôcôla (số gam CBE trên 100 g chất béo sôcôla), sử dụng phương thức hồi qui bình phương nhỏ nhất từng phần (PLS) với sáu biến đầu vào, nghĩa là năm TAG, POP, POS, POO, SOS và SOO, đã được chuẩn hóa đến 100 % và xác định được hàm lượng MF của chất béo sôcôla.

Để đảm bảo ghi nhãn sôcôla sữa đúng, các kết quả thu được liên quan đến chất béo sôcôla được chuyển đổi thành số gam MF trên 100 g sôcôla và gam CBE trên 100 g sôcôla, cần xác định chính xác hàm lượng chất béo tổng số của sôcôla, dùng quy trình chiết Soxhlet (TCVN 10730:2015)[5]. Khi qui trình phát hiện chứng tỏ không có mặt CBE trong chất béo sôcôla, thì không cần định lượng và không cần tính hàm lượng chất béo tổng số.

4. Thuốc thử, dung dịch và chất chuẩn

CHÚ THÍCH Chỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ khi có qui định khác.

CẢNH BÁO – Cần chú ý mọi qui định về xử lý các chất gây nguy hại. Các tổ chức và cá nhân phải tuân thủ các biện pháp về an toàn kỹ thuật.

4.1. Chất chuẩn bơ cacao đã được chứng nhận (IRMM-801)1) (xem tài liệu tham khảo [6]), dùng để hiệu chuẩn và kiểm tra sự phù hợp của hệ thống.

4.2. Chất béo sữa tinh khiết, dùng để kiểm tra sự phù hợp của hệ thống.

4.3. 1-Palmitoyl-2-stearoyl-3-butyroyl-glycerol (PSB)2).

4.3.1. Yêu cầu chung

Để hiệu chuẩn, hòa tan khoảng 40 mg PSB trong bình định mức 50 ml (5.9) với isooctan để có được dung dịch gốc khoảng r = 0,8 mg/ml. Trộn kỹ cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

Từ dung dịch gốc PSB này, chuẩn bị một dãy năm dung dịch hiệu chuẩn trong nền mẫu (IRMM-801) bằng cách dùng cân phân tích (5.1) cân IRMM-801 (4.1) cho vào bình định mức 25 ml (5.9) rồi thêm các thể tích dung dịch gốc PSB tương ứng như trong Bảng 1. Thêm isooctan đến vạch.

Bảng 1 – Khối lượng của IRMM-801 và các thể tích của dung dịch gốc PSB được dùng để chuẩn bị dãy các dung dịch hiệu chuẩn PSB trong nền mẫu

Dung dịch hiệu chuẩn	IRMM-801 (4.1) được cân cho vào bình định mức 25 ml mg	Thể tích lấy từ dung dịch gốc PSB và cho vào  bình định mức 25 ml ml	Nồng độ của PSB trong dung dịch hiệu chuẩn rPSBi mg/ml	Nồng độ của dung dịch IRMM-PSB cuối cùng rIRMM-PSB mg/ml
1	~ 250	4	0,128	~10
2	~ 250	3	0,096	~10
3	~ 250	2	0,064	~10
4	~ 250	1	0,032	~10
5	~ 250	0,5	0,016	~10

4.3.2. Bơm lên cột lạnh (OCI)

Pha loãng từng dung dịch hiệu chuẩn bằng isooctan, j = 1 ml/5 ml, để thu được nồng độ IRMM-PSB cuối cùng (rIRMM-PSB) khoảng 2 mg/ml trong mỗi dung dịch và dải nồng độ PSB (rPSB) dao động từ 0,025 6 mg/ml (dung dịch hiệu chuẩn 1) đến 0,003 2 mg/ml (dung dịch hiệu chuẩn 5).

4.3.3. Bơm chia dòng (ví dụ tỉ lệ chia dòng 1:10)

Pha loãng từng dung dịch hiệu chuẩn bằng isootan, j = 1 ml/2 ml để thu được nồng độ IRMM-PSB cuối cùng (rIRMM-PSB) khoảng 5 mg/ml trong từng dung dịch và nồng độ PSB (rPSB) dao động từ 0,064 mg/ml (dung dịch hiệu chuẩn 1) đến 0,008 mg/ml (dung dịch hiệu chuẩn 5).

CHÚ THÍCH Nồng độ PSB cuối cùng phải được tính bằng cách sử dụng khối lượng thực tế trong dung dịch chuẩn gốc.

4.4. a-Cholestan3), r = 100 mg/100 ml, được sử dụng làm chất chuẩn nội.

Hòa tan khoảng 50 mg a-cholestan trong 50 ml isooctan.

– Để bơm lên cột lạnh: Pha loãng theo tỉ lệ 1:250 (r = 0,004 mg/ml).

– Để bơm chia dòng (ví dụ, tỉ lệ chia dòng 1:10): Pha loãng theo tỷ lệ 1:100 (r = 0,01 mg/ml).

4.5. Dung môi chiết chất béo, các dung môi không bị clo hóa (ví dụ, ete dầu mỏ, n-hexan, n-heptan, isooctan).

4.6. Axit clohydric, c(HCl) = 4 mol/l.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Cân phân tích, có thể đọc chính xác đến 0,1 mg.

5.2. Tủ sấy, có thể sử dụng buồng sấy.

5.3. Giấy lọc, đường kính 15 cm [ví dụ S&S 589/14)].

5.4. Máy nghiền trộn thực phẩm, máy trộn gia dụng có thiết kế mô tơ ở phía trên buồng trộn để tránh làm tan chảy mẫu.

5.5. Bộ cô quay. Có thể sử dụng qui trình làm bay hơi khác.

5.6. Buồng làm bay hơi, có nguồn cung cấp khí nitơ.

5.7. Bình hút ẩm, có nắp đậy kín, chứa chất hút ẩm hiệu quả.

5.8. Bộ chiết Soxhlet, có các khớp nối hình côn chuẩn, dung tích siphon khoảng 100 ml (ống chiết 33 mm x 88 mm), bình nón 250 ml và bộ gia nhiệt điều chỉnh được nhiệt độ (hoặc loại tương đương).

5.9. Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml và 100 ml (hoặc các dung tích khác nếu cần), loại A qui định trong TCVN 7153 (ISO 1042) ^[2].

5.10. Pipet, dung tích từ 1 ml đến 10 ml (hoặc các loại dung tích khác, nếu cần), loại A qui định trong TCVN 7151 (ISO 648) hoặc ISO 8655-2 ^[4].

5.11. Microxyranh, có dung tích tối đa 10 ml, được chia vạch đến 0,1 ml hoặc bộ bơm mẫu tự động

5.12. Máy sắc kí khí (GC), được gắn với hệ thống bơm lên cột lạnh hoặc hệ thống bơm chia dòng và detector ion hóa ngọn lửa (FID).

CHÚ THÍCH 1 Có thể sử dụng các hệ thống bơm thay thế [ví dụ, có thể sử dụng bộ hóa hơi có cài đặt chương trình nhiệt độ (PTV) hoặc bơm có kim tiêm rời] với điều kiện là cho các kết quả tương đương như trong 10.2.

Quá trình tách và định lượng sẽ đáp ứng yêu cầu nếu tuân thủ các điều kiện thực nghiệm sau đây:

Cột GLC:	CB-TAP dài 25 m đường kính trong 0,25 mm làm bằng silica nung chảy được phủ bằng pha tĩnh phenylmethylmethylpolysiloxan chịu nhiệt, phân cực trung bình, độ dày màng 0,10 mm.
Chương trình lò đối với OCI:	ở 100 oC giữ được ít nhất 2 min; tăng 30 oC/min đến 270 oC giữ được trong 1 min, tăng 2,5 oC/min đến 340 oC giữ trong 7 min
Chương trình lò đối với chia dòng:	200 oC giữ được trong ít nhất 1 min; tăng 14 oC/min đến 270 oC giữ được trong 1 min, tăng 2,5 oC/min đến 340 oC giữ được trong 10 min
Detector (FID):	360 oC
Khí mang đối với OCI:	H2 (độ tinh khiết ³ 99,999 %) có tốc độ dòng không đổi 3,5 ml/min (khí mang phù hợp khác là heli)
Khí mang đối với chia dòng:	H2 (độ tinh khiết ³ 99,999 %) có tốc độ dòng không đổi 2,5 ml/min (khí mang phù hợp khác là heli)

CHÚ THÍCH 2 Các cột và các điều kiện thực nghiệm thay thế, dùng trong nghiên cứu cộng tác quốc tế (xem Tài liệu tham khảo [7]) được nêu trong Bảng A.1. Các điều kiện vận hành có thể được thay đổi để tách được tối ưu.

5.13. Hệ thống dữ liệu sắc kí

6. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 2625 (ISO 5555)^[3]. Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

7. Chuẩn bị mẫu

7.1. Chuẩn bị IRMM-801 để hiệu chuẩn và kiểm tra sự phù hợp của hệ thống

Trước khi mở và sử dụng IRMM-801 (4.1), làm ấm ampun trong tủ sấy (5.2) cho đến khi lượng chứa bên trong tan chảy. Khi thu được dung dịch trong, trộn bằng cách đảo chiều ampun nhiều lần, ít nhất 20 s. Sau đó mở ampun và chuyển lượng chứa vào lọ sạch, có thể đậy kín rồi bảo quản trong điều kiện lạnh để sau đó sử dụng.

7.2. Chuẩn bị chất béo sữa tinh khiết dùng để kiểm tra sự phù hợp của hệ thống

Nếu không sẵn có MF tinh khiết, có thể thu được bằng cách làm tan chảy mẫu bơ và để cho lớp chất béo chảy qua giấy lọc gấp nếp (5.3) ở 50 ^oC trong tủ sấy (5.2).

7.3. Chuẩn bị mẫu sôcôla

7.3.1. Yêu cầu chung

Làm lạnh khoảng 200 g sôcôla cho đến cứng và dùng máy nghiền thực phẩm (5.4) để nghiền thành hạt mịn. Trộn kỹ và bảo quản trong lọ có nắp đậy kín trong điều kiện lạnh.

7.3.2. Chiết nhanh chất béo

Chất béo sôcôla được tách ra khỏi 5 g sôcôla đã nghiền (7.3.1) bằng cách chiết hai đến ba lần, mỗi lần dùng 10 ml dung môi chiết chất béo thích hợp (4.5). Li tâm và gạn. Gộp tất cả các dịch chiết và dùng bộ cô quay (5.5) làm bay hơi phần lớn dung môi chiết chất béo, cuối cùng làm khô dưới dòng nitơ (5.6).

Chất béo sôcôla thu được bằng cách chiết nhanh chất béo được dùng cho phân tích TAG cuối cùng bằng HR-GLC. Để phát hiện CBE trong sôcôla, không cần biết hàm lượng chính xác tổng chất béo có trong sôcôla. Khi không phát hiện được CBE, thì phần thứ hai của tiêu chuẩn, nghĩa là việc định lượng CBE xung quanh giới hạn qui định 5 % là không cần thiết. Khi phát hiện có CBE, thì phải thực hiện phần định lượng sử dụng cùng một TAG như đã dùng để phát hiện CBE. Tuy nhiên, trong trường hợp này thì dùng qui trình trong 7.3.3 để xác định chính xác lượng chất béo tổng số trong sôcôla. Quy trình chiết thay thế có thể được sử dụng với điều kiện cho các kết quả tương đương.

7.3.3. Xác định tổng hàm lượng chất béo

Tách chất béo sôcôla và xác định tổng hàm lượng chất béo có trong mẫu sôcôla sữa (được chuẩn bị như trong 7.3.2) bằng bộ chiết Soxhlet (TCVN 10730:2015[5]) như sau.

Dùng cân (5.1) cân từ 4 g đến 5 g sôcôla cho vào cốc có mỏ từ 300 ml đến 500 ml. Thêm từ từ, trong khi vẫn khuấy, 45 ml nước sôi để thu được huyền phù đồng nhất. Thêm 55 ml HCl (4.6) với vài hạt trợ sôi đã khử chất béo hoặc các chất chống trào khác rồi khuấy. Đậy mặt kính đồng hồ, đun từ từ dung dịch đến sôi và để sôi trong 15 min. Tráng mặt kính đồng hồ bằng 100 ml nước. Lọc dung dịch qua giấy lọc gấp nếp trung bình (5.3), hoặc loại tương đương, tráng cốc có mỏ ba lần bằng nước. Tiếp tục rửa cho đến khi phần dịch lọc cuối cùng không chứa clo (5.3). Chuyển giấy lọc cùng với mẫu vào ống chiết đã khử chất béo rồi sấy 2 h trong cốc có mỏ nhỏ ở nhiệt độ 100 ^oC. Đặt nút bông thủy tinh lên trên giấy lọc. Thêm vài hạt chống trào đã khử chất béo vào bình nón 250 ml rồi sấy 1 h ở 100 ^oC. Để nguội bình đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm (5.7) rồi dùng cân (5.1) để cân. Cho ống chứa mẫu đã khô vào thiết bị Soxhlet (5.8), có viên xoắn ốc hoặc bi thủy tinh. Tráng cốc phân hủy, cốc sấy và mặt kính đồng hồ ba lần, mỗi lần 50 ml ete dầu mỏ rồi cho nước rửa vào ống chiết. Cho đối lưu mẫu đã phân hủy 4 h, chỉnh nhiệt độ sao cho xiphông chiết nhiều hơn 30 lần. Lấy bình ra và làm bay hơi dung môi. Sấy bình ở 102 ^oC đến khối lượng không đổi (1,5 h). Để nguội trong bình hút ẩm (5.7) đến nhiệt độ phòng rồi dùng cân (5.1) để cân. Khối lượng không đổi đạt được khi khoảng thời gian sấy liên tiếp 1 h cho thấy hao hụt chất béo < 0,05 %. Các kết quả của hai phép xác định kép phải không được chênh lệch quá 0,1 % chất béo.

Phần khối lượng, của chất béo tổng số trong sôcôla, w_{fat, choc}, biểu thị bằng phần trăm, được tính bằng công thức (1):

 (1)

Trong đó

m là khối lượng của sôcôla, tính bằng gam (g);

m_fat là tổng khối lượng của chất béo thu được từ sôcôla được chiết bằng bộ chiết Soxhlet (TCVN 10730:2015 ^[5])

Có thể sử dụng các quy trình chiết thay thế khác (ví dụ chiết bằng dung môi tăng cường, bằng cacbon dioxit siêu tới hạn hoặc bằng cách sử dụng lò vi sóng) với điều kiện cho các kết quả tương đương. Chất béo sôcôla thu được bằng chiết Soxhlet không được dùng để phân tích TAG bằng HR-GLC vì trong một số trường hợp có thể cho thấy sự thay đổi sắc ký đồ của TGA thu được.

Báo cáo kết quả đến hai chữ số thập phân.

8. Cách tiến hành

8.1. Dựng đường chuẩn để xác định hàm lượng PSB

Năm dung dịch hiệu chuẩn chứa các nồng độ PSB khác nhau (4.3) nhưng luôn có cùng nồng độ a-cholestan (4.4), được chuẩn bị như sau:

Để bơm lên cột lạnh (OCI):

– Dung dịch hiệu chuẩn 1 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 1} = 0,012 8 mg/ml; r_{a-cholestan 1} = 0,002 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 1 (r_{PSB 1} = 0,025 6 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,004 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 2 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 2} = 0,009 6 mg/ml; r_{a-cholestan 2} = 0,002 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 2 (r_{PSB 2} = 0,019 2 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,004 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 3 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 3} = 0,006 4 mg/ml; r_{a-cholestan 3} = 0,002 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 3 (r_{PSB 3} = 0,012 8 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,004 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 4 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 4} = 0,003 2 mg/ml; r_{a-cholestan 4} = 0,002 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 4 (r_{PSB 4} = 0,006 4 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,004 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 5 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 5} = 0,001 6 mg/ml; r_{a-cholestan 5} = 0,002 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 5 (r_{PSB 5} = 0,003 2 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,004 mg/ml; 4.4).

Dùng hệ thống bơm lện cột lạnh, bơm 0,5 ml từng dung dịch hiệu chuẩn vào hệ thống HR-GLC.

Đối với hệ thống bơm chia dòng:

– Dung dịch hiệu chuẩn 1 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 1} = 0,032 mg/ml; r_{a-cholestan 1} = 0,005 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 1 (r_{PSB 1}= 0,064 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,01 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 2 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 2} = 0,024 mg/ml; r_{a-cholestan 2} = 0,005 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 2 (r_{PSB 2} = 0,048 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,01 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 3 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 3} = 0,016 mg/ml; r_{a-cholestan 3} = 0,005 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 3 (r_{PSB 3}= 0,032 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,01 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 4 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 4} = 0,008 mg/ml; r_{a-cholestan 4} = 0,005 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 4 (r_{PSB 4} = 0,016 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,01 mg/ml; 4.4).

– Dung dịch hiệu chuẩn 5 (Nồng độ cuối cùng r_{PSB 5} = 0,004 mg/ml; r_{a-cholestan 5} = 0,005 mg/ml): Chuyển 1 ml dung dịch hiệu chuẩn 5 (r_{PSB 5} = 0,008 mg/ml; 4.3) vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (r = 0,01 mg/ml; 4.4).

Dùng hệ thống bơm chia dòng bơm 1 µl dung dịch thử nghiệm cuối cùng vào hệ thống HR-GLC.

Có thể sử dụng bộ bơm mẫu và lượng mẫu khác với điều kiện là hệ thống detector cho độ nhạy tuyến tính và tuân thủ các tiêu chí phù hợp của hệ thống (10.2).

8.2. Tách các TAG riêng rẽ của IRMM-801 bằng HR-GLC

IRMM-801 (4.1) phải được làm ấm trong tủ sấy (5.2) cho đến khi tan chảy hoàn toàn. Dùng pipet (hoặc dụng cụ tương tự) để chuyển mẫu, trong suốt quá trình cân phải đưa nhiệt độ trong tủ sấy về khoảng 55 ^oC để tránh tách phân đoạn chất béo trong khi xử lý mẫu.

Đối với bơm lên cột lạnh (OCI): Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,1 g IRMM-801 (4.1) cho vào bình định mức 10 ml (5.9) và thêm isootan (4.5) đến vạch. Dùng pipet (5.10) lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml (5.9) khác rồi pha loãng đến vạch bằng cùng một loại dung môi (r = 0,2 mg/ml). Dùng hệ thống bơm lên cột lạnh bơm 0,5 µl dung dịch thử nghiệm cuối cùng này vào hệ thống HR-GLC.

Đối với bơm chia dòng: Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,1 g IRMM-801 (4.1) cho vào bình định mức 10 ml (5.9) và thêm isootan (4.5) đến vạch. Dùng pipet (5.10) lấy 1 ml dung dịch cho vào bình định mức 10 ml (5.9) khác rồi pha loãng đến vạch bằng cùng một loại dung môi (r = 1 mg/ml). Dùng hệ thống bơm chia dòng bơm 1 µl dung dịch thử nghiệm cuối cùng vào hệ thống HR-GLC,.

Có thể sử dụng dung môi chiết chất béo, lượng mẫu, bộ bơm khác với điều kiện là hệ thống detector cho độ nhạy tuyến tính và tuân thủ các tiêu chí phù hợp của hệ thống (10.2).

8.3. Tách các TAG riêng rẽ của MF tinh khiết bằng HR-GLC

Đối với bơm lên cột lạnh (OCI): Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,05 g MF tinh khiết (4.2) cho vào bình định mức 50 ml (5.9) và thêm isootan (4.5) (r = 1 mg/ml) đến vạch. Chuyển 1 ml dung dịch này vào ống nghiệm rồi thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (4.4) (dung dịch thử nghiệm thu được có r = 0,5 mg/ml). Dùng hệ thống bơm lên cột lạnh bơm 0,5 µl dung dịch thử nghiệm cuối cùng vào hệ thống HR-GLC,.

Đối với bơm chia dòng: Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,25 g MF tinh khiết (4.2) cho vào bình định mức 50 ml (5.9) và thêm isootan (4.5) (r = 5 mg/ml) đến vạch. Chuyển 1 ml dung dịch này vào ống nghiệm rồi thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (4.4) (dung dịch thử nghiệm r = 2,5 mg/ml). Dùng hệ thống bơm chia dòng bơm 1 µl dung dịch thử nghiệm cuối cùng vào hệ thống HR-GLC.

Có thể sử dụng các dung môi chiết chất béo, lượng mẫu, bộ bơm khác với điều kiện hệ thống detector cho độ nhạy tuyến tính và tuân thủ các tiêu chí phù hợp của hệ thống (10.2).

8.4. Tách các TAG riêng rẽ của chất béo sôcôla bằng HR-GLC

Mẫu thử [chất béo sôcôla được chiết ra khỏi sôcôla sữa bằng cách chiết nhanh chất béo (7.3.2)] phải được làm ấm trong tủ sấy (5.2) cho đến khi tan chảy hoàn toàn. Nếu mẫu dạng lỏng chứa một ít chất lắng cặn, thì lọc mẫu trong tủ sấy để thu được dịch lọc trong. Dùng pipet (hoặc dụng cụ tương tự) để chuyển mẫu. Trong suốt quá trình cân phải đưa nhiệt độ trong tủ sấy về khoảng 55 oC để tránh tách phân đoạn chất béo trong khi xử lý mẫu.

Đối với bơm lên cột lạnh (OCI): Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,1 g chất béo sôcôla (thu được trong 7.3.2) cho vào bình định mức 100 ml (5.9) và thêm isootan (4.5) (r = 1 mg/ml) đến vạch. Chuyển 1 ml dung dịch này vào ống nghiệm rồi thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (4.4) (dung dịch thử nghiệm (r = 0,5 mg/ml). Dùng hệ thống bơm lên cột lạnh bơm 0,5 µl dung dịch thử nghiệm cuối cùng vào hệ thống HR-GLC.

Đối với bơm chia dòng: Dùng cân (5.1) cân khoảng 0,5 g chất béo sôcôla (thu được trong 7.3.2) trên cân phân tích (5.1) cho vào bình định mức 100 ml (5.9) và thêm isootan (4.5) (r = 5 mg/ml) đến vạch. Chuyển 1 ml dung dịch này vào ống nghiệm rồi thêm 1 ml dung dịch a-cholestan (4.4) (dung dịch thử nghiệm r = 2,5 mg/ml). Dùng hệ thống bơm chia dòng bơm 1 µl dung dịch thử nghiệm cuối cùng vào hệ thống HR-GLC.

Có thể sử dụng các dung môi chiết chất béo, lượng mẫu, bộ bơm khác với điều kiện là hệ thống detector cho độ nhạy tuyến tính và tuân thủ các tiêu chí phù hợp của hệ thống (10.2).

8.5. Nhận biết

Nhận biết 1-palmitoyl-2-stearoyl-3-butyroyl-glycerol (PSB) và a-cholestan bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu các chất chuẩn. Nhận biết năm phân đoạn chính của TAG 1,3-dipalmitoyl-2-oleoyl-glycerol (POP), 1-palmitoyl-2-oleoyl-3-stearoyl-glycerol (POS), 1-palmitoyl-2,3-dioleoyl-glycerol (POO), 1,3-distearoyl-2-oleoyl-glycerol (SOS) và 1-staaroyl-2,3-dioleoyl-glycerol (SOO) bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu thử với thời gian lưu của IRMM-801 (8.2).

Thông thường, các TAG xuất hiện theo trật tự số lượng nguyên tử cacbon tăng dần và tăng dần theo số nguyên tử chưa bão hòa nếu cùng số nguyên tử cacbon. Thứ tự rửa giải của các TAG của IRMM-801 (8.2) nêu trong Hình B.1. Thứ tự rửa giải của các TAG của MF tinh khiết trung bình (8.3) nêu trong Hình B.2.

9. Tính kết quả

9.1. Định lượng PSB và MF trong chất béo sôcôla và sôcôla

9.1.1. Xác định hệ số đáp ứng PSB

Xác định hệ số đáp ứng PSB bằng cách bơm năm dung dịch hiệu chuẩn (8.1), dùng các điều kiện thực nghiệm như các các điều kiện đã dùng cho mẫu thử. Đối với từng dung dịch hiệu chuẩn, i, tính hệ số đáp ứng detector đối với PSB, F_{PSB; i}, bằng công thức (2):

trong đó

A_{PSB; i} là diện tích pic của PSB trong dung dịch hiệu chuẩn thứ i (8.1);

A_{cholestan, i} là diện tích pic của chất chuẩn nội a-cholestan trong dung dịch hiệu chuẩn thứ i (8.1);

r_{PSB; i} là nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn PSB thứ i (8.1), tính bằng miligam trên mililit (mg/ml);

r_cholestan;i là nồng độ chất chuẩn nội a-cholestan trong dung dịch hiệu chuẩn thứ i (8.1), tính bằng miligam trên mililit (mg/ml).

Hệ số đáp ứng trung bình đối với PSB, F PSB , thu được từ năm dung dịch hiệu chuẩn cần được tính và dùng cho các phép tính tiếp theo.

9.1.2. Định lượng PSB trong chất béo sôcôla

Phần khối lượng của PSB trong mẫu thử (chất béo sôcôla), w_{PSB;choc fat}, tính bằng phần trăm, được tính bằng công thức (3):

Trong đó

A_PSB là diện tích pic của PSB trong mẫu thử (8.4);

A_cholestan là diện tích pic của dung dịch chuẩn nội a-cholestan trong mẫu thử; (8.4);

_PSB là hệ số đáp ứng trung bình đối với PSB (9.1.1);

r_cholestan là nồng độ của chất chuẩn nội a-cholestan trong mẫu thử (8.4), tính bằng miligam trên mililit (mg/ml);

r_sample là nồng độ của mẫu thử (8.4), tính bằng miligam trên mililit (mg/ml); Báo cáo các kết quả đến hai chữ số thập phân.

9.1.3. Định lượng MF trong chất béo sôcôla

Phần khối lượng của MF trong chất béo sôcôla, w_{MF; choc fat}, tính bằng phần trăm, được tính bằng công thức (4):

w_{MF; choc fat} = 0,19 + 44,04 w_{PSB; choc fat} (4)

Trong đó w_{PSB; choc fat} là phần khối lượng của PSB trong chất béo sôcôla, được tính bằng phần trăm [xem Công  thức  (3)].

CHÚ THÍCH Hàm hiệu chuẩn được thiết lập bằng cách sử dụng các dữ liệu từ cơ sở dữ liệu phân tích bổ sung trên sắc kí đồ TAG của trên 900 sắc ký đồ TAG được chuẩn bị từ các hỗn hợp CB-MF và CB-CBE-MF có hàm lượng MF đã biết, mô phỏng các thành phần của chất béo sôcôla thực (xem Tài liệu tham khảo [8]).

Báo cáo các kết quả đến hai chữ số thập phân.

9.1.4. Định lượng MF trong sôcôla

Phần khối lượng của MF trong sôcôla, w_{MF; choc}, tính bằng phần trăm, được tính bằng công thức (5):

Trong đó

w_{fat; choc} là phần khối lượng của tổng chất béo trong sôcôla, tính bằng phần trăm (%) [xem Công thức (1)];

w_{MF, chocfat} là phần khối lượng của MF trong chất béo sôcôla, tính bằng phần trăm (%) [xem Công thức (4)].

9.2. Phát hiện CBE trong chất béo sôcôla

9.2.1. Xác định các hệ số đáp ứng đối với POP, POS và SOS

Xác định hệ số đáp ứng detector của từng TAG thứ i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng, trong IRMM-801, F_i, bằng cách bơm dung dịch IRMM-801 (8.2), dùng các điều kiện thực nghiệm giống như đã dùng cho mẫu thử. Tính F_i bằng công thức:

Trong đó

A_{i; ref} là diện tích pic của mỗi TAG thứ i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng, trong IRMM-801 (8.2);

: ref là tổng các diện tích pic đặc trưng cho tất cả TAG trong IRMM-801 (8.2);

P_{i; ref} là phần trăm của mỗi TAG thứ i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng trong IRMM-801 (8.2) [xem Công thức (6)];

w_i;ref là phần khối lượng của mỗi TAG thứ i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng trong IRMM-801 (8.2) như cho trong giấy chứng nhận (POP = 16,00 %, POS = 39,40 %, SOS = 27,90 %) (xem Tài liệu tham khảo [6]), tính bằng phần trăm (%).

Báo cáo các kết quả đến hai chữ số thập phân.

9.2.2. Tính phần trăm phần khối lượng POP, POS và SOS trong chất béo sôcôla

Tính phần khối lượng của từng TAG thứ i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng, wi; total, trong mẫu thử tương ứng với tất cả các TAG có mặt trong mẫu thử, tính bằng phần trăm, theo công thức (8):

Trong đó

A_i là diện tích pic tương đương với từng TAG thứ i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng trong mẫu thử (8.4);

là tổng của các diện tích pic phân bố cho tất cả TAG trong mẫu thử (8.4);

F_i là hệ số đáp ứng đối với từng TAG thứ i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng [xem Công thức (7)].

Báo cáo các kết quả đến hai chữ số thập phân.

9.2.3. Hiệu chính đối với phân bố MF

Tính khối lượng bổ sung của từng TAG i, nghĩa là POP, POS và SOS tương ứng có nguồn từ MF, wi; MF, tính bằng phần trăm phần khối lượng, theo công thức (9):

Trong đó

_{i ;ref MF} là phần trăm phần khối lượng trung bình của từng TAG thứ i trong MF, nghĩa là POP = 3,99 %, POS = 2,19 %, SOS = 0,45 % [các giá trị này thu được từ dữ liệu cơ sở (xem Tài liệu tham khảo [9])];

w_{MF; choc} là phần trăm phần khối lượng của MF trong mẫu thử [xem Công thức (4)].

Lấy phần trăm phần khối lượng thu được của ba TAG có nguồn gốc từ MF [Công thức (9)] trừ phần trăm phần khối lượng thu được của ba TAG đối với mẫu thử [Công thức (8)].

w_i;corr = w_{i; total} – w_i;MF  (10);

Thông thường phần trăm phần khối lượng của ba TAG [Công thức (10)] thu được đến 100 % [Công thức (11)];

w_{POP; corr} + w_{POS; corr} + w_{POS; corr} = 100 (11)

Làm tròn các kết quả đến hai chữ số thập phân.

9.2.4. Xác định chất béo sôcôla có phải là bơ ca cao tinh khiết hay không

Về nguyên tắc, sự có mặt của CBE trong CB được phát hiện bằng cách áp dụng phân tích hồi qui tuyến tính liên quan đến phần trăm phần khối lượng tương đối của ba thành phần TAG, nghĩa là POP, POS và SOS. Độ biến thiên của thành phần TAG của CB được tính bằng Công thức (12), sử dụng phần trăm phần khối lượng các phần của POP, POS và SOS đã được chuẩn hóa, nghĩa là wPOP + wPOS + wSOS = 100 (xem Tài liệu tham khảo [10], [11]).

w_POP = 43,73 – 0, 73w_SOS (12)

(S _residual = 0,125)

Trong đó S _residual là độ lệch chuẩn của phần còn lại.

Nguyên tắc của phương pháp là đối với các mẫu CB tinh khiết, w_POS là hằng số thực nghiệm đối với các biến động lớn của w_POP và w_SOS tạo ra trong mối quan hệ tuyến tính [còn được gọi là “đường CB” như trong Công thức (12)] giữa w_POP và w_SOS. CBE và các hỗn hợp chất béo khác làm cho phép phân tích TAG bị lệch ra khỏi “đường CB” đến mức mà giá trị w_POS lệch khỏi giá trị của bơ cacao. Công thức (12) được thiết lập bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu đã chuẩn hóa TAG của 74 CB riêng lẻ chưa qua xử lý đã được đánh giá (xem Tài liệu tham khảo [10]). IRMM-801 (4.1) được sử dụng để chuẩn hóa phương pháp phân tích áp dụng để xác định sắc ký đồ TAG của các CB. Đối với 99 % các phép phân tích, thì CB tinh khiết phù hợp với Công thức (13):

w_POP < 44,03 – 0,73w_SOS  (13)

Giá trị w_POP lớn hơn, tính được theo Công thức (13), có nghĩa là mẫu không phải là CB tinh khiết. Trong trường hợp sôcôla sữa, dùng phần trăm phần khối lượng TAG đã hiệu chính để cung cấp phần trăm khối lượng của các TAG, POP, POS và SOS, có nguồn gốc từ MF [được xác định trong Công thức (10)]. Sau khi chuẩn hóa phần trăm phần khối lượng các TAG đã hiệu chính của MF thu được đến 100 % [Công thức (11)], có thể áp dụng cùng một nguyên tắc như đối với CB hoặc sôcôla đen [Công thức (13)], để phát hiện có hay không có CBE trong chất béo sôcôla sữa.

w_{POP; corr} < 44,03 – 0, 73w_SOS;corr (14)

Nếu giá trị w_{POP; corr} lớn hơn như được tính trong Công thức (14), có nghĩa là mẫu không phải CB tinh khiết.

CHÚ THÍCH Ưu điểm của cách tiếp cận phương pháp này là sử dụng IRMM-801 (4.1) để hiệu chuẩn, các phòng thử nghiệm có thể sử dụng biểu thức toán học để kiểm tra xác nhận độ tinh khiết của các CB, không phải khắc phục vấn đề thiết lập “đường CB” như yêu cầu trước đó. Hiệu chuẩn bằng IRMM-801 (4.1) tự động liên kết các kết quả thu được trong phòng thử nghiệm với dữ liệu TAG bơ cacao và nguyên tắc quyết định xây dựng [Công thức (13)].

9.3. Định lượng CBE trong chất béo sôcôla và sôcôla

9.3.1. Xác định các hệ số đáp ứng đối với POP, POS, POO, SOS và SOO

Xác định các hệ số đáp ứng detector của từng TAG thứ j, nghĩa là POP, POS, POO, SOS và SOO trong IRMM-801, F_j bằng cách bơm dung dịch IRMM-801 (8.2), sử dụng các điều kiện thực nghiệm tương tự như đã dùng cho mẫu.

Tính F_j bằng công thức:

 (15)

 (16)

Trong đó

Aj_;ref là diện tích pic của từng TAG thứ j, nghĩa là POP, POS, POO, SOS và SOO tương ứng trong IRMM-801 (8.2);

 là tổng các diện tích pic của tất cả các TAG thứ j, nghĩa là POP, POS, POO, SOS và SOO trong IRMM-801 (8.2);

P_{j; ref} là phần trăm của từng TAG thứ j, nghĩa POP, POS, POO và SOO trong IRMM-801 (8.2);

w_j;ref là phần khối lượng của từng TAG thứ j, nghĩa là POP, POS, POO, SOS và SOO trong IRMM-801 (8.2) như trong giấy chứng nhận (POP = 18,14 %, POS = 44,68 %, POO = 2,26 %, SOS = 31,63 % và SOO = 3,29 %, nghĩa là được chuẩn hóa đến 100 %) (xem Tài liệu tham khảo [6]), tính bằng phần trăm.

Báo cáo các kết quả đến hai chữ số thập phân

9.3.2. Tính phần trăm phần khối lượng của POP, POS, POO, SOS và SOO trong chất béo sôcôla

Tính phần trăm phần khối lượng của từng POP, POS, POO, SOS và SOO tương ứng trong mẫu thử, w_{j; choc fat} bằng công thức:

 (17)

Trong đó

F_j là hệ số đáp ứng của từng TAG thứ j, nghĩa là POP, POS, POO, SOS và SOO tương ứng [xem Công thức (16)];

A_j là diện tích pic tương ứng với từng TAG thứ j, nghĩa là POP, POS, POO, SOS và SOO tương ứng trong mẫu thử (8.4).

Báo cáo các kết quả đến hai chữ cố thập phân.

9.3.3. Định lượng CBE trong chất béo sôcôla

Phần khối lượng, của CBE trong chất béo sôcôla, tính bằng phần trăm, w_{CBE, choc fat} tính được theo Công thức (18) thu được bằng phân tích hồi qui PLS của các tỷ lệ tương ứng của năm TAG chính, nghĩa là w_{POP; choc fat} ; w_{POS; choc fat} ; w_{POO; choc fat}, w_{SOS; choc fat} ; w_{SOO; choc fat} xác định được theo Công thức (17) và hàm lượng MF của chất béo sôcôla, nghĩa là w_{MF; choc fat} xác định được bằng Công thức (4).

w_{CBE; choc fat} = – 4,24 – 0,23 w_{MF; choc fat} + 1,52 w_{POP; choc fat} – 1,47 w_{POS; choc fat} + 1,09 w_{POO; choc fat} + 1,29 w_{SOS; choc fat} + 0,26 w_{SOO; choc fat} (18)

Báo cáo kết quả đến một chữ số thập phân.

CHÚ THÍCH Phương thức định lượng này được thiết lập bằng cách sử dụng dữ liệu từ cơ sở dữ liệu về sắc ký đồ của hơn 700 TAG tính theo khối lượng được chuẩn bị từ các hỗn hợp CB-CBE-MF thay đổi theo kiểu loại và hàm lượng CB, CBE và MF (xem Tài liệu tham khảo [8]).

9.3.4. Định lượng CBE trong sôcôla

Phần khối lượng của CBE trong sôcôla, w_{CBE; choc} , tính bằng phần trăm, được tính theo công thức (19):

 (19)

Trong đó

w_{fat; choc} là phần khối lượng của tổng chất béo có trong sôcôla [xem Công thức (1)], tính bằng phần trăm (%);

w_{CBE; choc fat} là phần khối lượng của CBE trong chất béo sôcôla [xem Công thức (18)], tính bằng phần trăm (%).

Báo cáo kết quả đến một chữ số thập phân.

10. Yêu cầu đối với qui trình

10.1. Xem xét chung

Các chi tiết của quy trình sắc kí còn phụ thuộc vào các yếu tố khác trên thiết bị: loại cột, tuổi thọ cột và nhà cung cấp cột, cách bơm dung dịch thử nghiệm, cỡ mẫu và detector. Có thể sử dụng các chiều dài và các hãng khác nhau và các thể tích bơm có thể thay đổi, nếu hệ thống phù hợp với các yêu cầu của 10.2.

10.2. Sự phù hợp của hệ thống

10.2.1. Độ phân giải

– Hệ thống tách HR-GLC phải có khả năng tách tối ưu được các cặp POS/POO và SOS/SOO với độ phân giải sắc kí ít nhất 1,0. Yêu cầu này có thể chứng minh được bằng cách dùng IRMM-801 (8.2) như nêu trong Hình B.1.

– Hệ thống tách HR-GLC phải có khả năng tách PSB ra khỏi các pic bên cạnh trong phạm vi nhóm CN 38. Yêu cầu này có thể chứng minh bằng cách dùng mẫu MF tinh khiết (8.3) như cho trong Hình B.2 và Hình B.3.

– Hệ thống tách HR-GLC phải có khả năng không có sự đồng rửa giải đối với chất chuẩn nội a-cholestan. Yêu cầu này có thể chứng minh được bằng cách dùng mẫu MF (8.3), dùng a-cholestan làm chất chuẩn nội như trong Hình B.4.

Trong trường hợp không đáp ứng các yêu cầu trên thì tối ưu hóa các điều kiện sắc kí (ví dụ cỡ mẫu, nhiệt độ cột, dòng khí mang v.v…) để cho độ phân giải cao nhất.

10.2.2. Xác định các hệ số đáp ứng detector

– Kiểm tra giả định rằng các hệ số đáp ứng detector ion hóa ngọn lửa của TAG không sai lệch quá 20 %, thì phải phân tích IRMM-801 (8.2), áp dụng các điều kiện HR-GLC chuẩn. Kinh nghiệm cho thấy đối với hệ thống phân tích sắc kí vận hành đúng chức năng thì các hệ số đáp ứng đối với năm TAG (POP, POS, POO, SOS, SOO) thay đổi trong dải từ 0,80 đến 1,20. Chứng minh sự phù hợp của hệ thống bằng cách lặp lại phép phân tích (ít nhất ba lần lặp lại). Các hệ số biến thiên của các hệ số đáp ứng detector được xác định phải nhỏ hơn 5 %.

– Kiểm tra sự ổn định của hệ thống tách, cần phải thiết lập đường chuẩn đối với PSB có a-cholestan làm chất chuẩn nội (bơm từng dung dịch hiệu chuẩn ít nhất hai lần lặp lại). Tính trung bình hệ số đáp ứng detector đối với PSB. Các giá trị RF thu được trên các dung dịch hiệu chuẩn riêng biệt không được sai lệch quá 5 % so với giá trị trung bình.

Trong trường hợp không đáp ứng được yêu cầu trên, thì tối ưu hóa các điều kiện sắc kí (ví dụ, cỡ mẫu, nhiệt độ cột và dòng khí mang).

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm được nêu trong Bảng A.1. Các giá trị thu đước từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các nền mẫu khác với các dải nồng độ và các nền mẫu đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến hành trên cùng một vật liệu thử, thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người phân tích, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá 0,3 g/100 g sôcôla sữa.

Các giá trị đối với giới hạn tái lập, r, được tìm thấy trong nghiên cứu đánh giá xác nhận nêu trong Bảng A.3.

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người phân tích khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá 0,6 g/100 g sôcôla sữa.

Các giá trị về giới hạn tái lập, R, được tìm thấy trong nghiên cứu đánh giá xác nhận nêu trong Bảng A.3.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

 

Phụ lục A

(tham khảo)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Phương pháp náy đã được đánh giá xác nhận năm 2006, trong phép thử liên phòng thử nghiệm Châu Âu có 12 quốc gia tham gia (xem Tài liệu tham khảo [7]). Các chi tiết của phương pháp do các phòng thử nghiệm đơn lẻ áp dụng được nêu trong Bảng A.1. Phép nghiên cứu này đã thử nghiệm trên sáu mẫu sôcôla và bảy mẫu chất béo sôcôla có thành phần và các mức CBE khác nhau (Bảng A.2). Dữ liệu về độ chụm được nêu trong Bảng A.3.

Bảng A.1 – Các điều kiện HR-GLC phù hợp được dùng để phân tích TAG của chất béo sôcôla

Mã phòng thử nghiệm	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Khí mang
– loại	He	He	He	H2	H2	H2	H2	He	H2	H2	H2	H2
– nếu áp suất không đổi, Kpa	100	180	–	–	–	–	150	135	130	140	–	–
– nếu tốc độ dòng không đổi, ml/min	–	–	2,2	2	2	1,5	–	–	–	–	3,5	2
Đặc điểm cột
– pha tĩnh	Điểm tới hạn	CB-TAP	CB-TAP	CB-TAP	CB-TAP	CB-TAP	CB-TAP	CB-TAP	RTx- 65TG	CB-TAP	CB-TAP	CB-TAP
– chiều dài cột, m	25	25	25	25	25	25	25	25	30	25	25	25
– đường kính trong, mm	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
– độ dày màng, mm	0,05	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Chế  độ nhiệt độ
– lò cột
– nhiệt độ bơm, oC – thời gian giữ nhiệt, min	200 2	200 1	100 0,5	200 1	200 0	200 1	100 2	200 1	200 1	200 1	100 2	200 1
– tốc độ tăng 1, oC/min	20	14	40	14	20	24	30	14	15	30	30	14
– nhiệt độ, oC – thời gian giữ nhiệt, min	320 0	270 0	280 1	270 0	270 0	270 0	270 1	270 0	360 0	270 0	270 1	270 0
– tốc độ tăng 2, oC/min	1	2,5	2,5	2,5	5	2,5	3	2	1	2,5	3,5	2,5
– nhiệt độ, oC – thời gian giữ nhiệt, min	360 10	340 30	340 17	340 10	340 15	340 13	340 10	340 30	370 0	355 2	340 7	340 10
– tốc độ tăng 3, oC/min	–	10	–	–	25	–	–	–	–	–	–	–
– nhiệt độ cuối cùng , oC – thời gian giữ nhiệt, min	–	350 9	–	–	200	–	–	–	–	–	–	–
– nhiệt độ bơm, oC	65 đến 370	360	Chương trình nhiệt độ của  lò (oven track)	365	370	350		340	380	140 đến 340	Chương trình nhiệt độ của  lò (oven track)	360
– nhiệt độ detector, oC	370	360	360	365	360	370	350	360	380	350	360	360
Chế  độ bơm
– thủ công (M)/tự động (A)	M	A	–	A	A	A	M	A	A	A	A	A
– chia dòng/trên cột/PTV	PTV	chia dòng	OCI	chia dòng	chia dòng	chia dòng	OCI	chia dòng	chia dòng	PTV	OCI	chia dòng
– nếu chia dòng [tỉ lệ chia]	–	1:20	–	1:10	1:10	1:10	–	1:7	–	–	–	1:10

Bảng A.2 – Thành phần của các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm quốc tế để kiểm tra phương pháp

Mẫu	Mẫu sôcôla a	Loại CBE	CB %	CBE %	MF %
1	Sôcôla sữa, FCMP, không có CBE	–	29,67	0,00	không biết
2	Sôcôla sữa, FCMP, bổ sung CBE mức thấp	50 % PMF + 50 % SOS giàu chất béo	29,22	0,45	không biết
3	Sôcôla sữa, SKMP + MF, không  có CBE	–	25,70	0,00	không biết
4	Sôcôla sữa, SKMP + MF, bổ sung CBE mức thấp	50 % PMF + 50 % SOS giàu chất béo	23,67	2,03	không biết
5	Sôcôla sữa, mảnh vụn + MF + FCMP + SKMP + WP, bổ sung CBE ở mức qui định	50 % PMF + 50 % SOS giàu chất béo	14,60	5,11	không biết
6	Sôcôla trắng, bổ sung CBE ở mức qui định	50 % PMF + 50 % SOS giàu chất béo	23,50	3,95	không biết
	Các dung dịch chất béo sôcôla	Loại CBE	CB %	CBE %	MF %
7	CB Tây phi, không có CBE	–	100,00	0,00	0,00
8	CB Tây phi + hỗn hợp  của các mẫu 310 MF, không có CBE	–	85,01	0,00	14,99
9	CB Tây phi + hỗn hợp  của các mẫu 310 MF, bổ sung CBE mức  thấp	70 % PMF + 30 % SOS giàu chất béo	83,03	2,00	14,98
10	CB Tây phi + hỗn hợp của các mẫu 310 MF, bổ sung CBE ở mức qui định	70 % PMF + 30 % SOS giàu chất béo	68,95	16,03	15,02
11	CB Tây phi + hỗn hợp của các mẫu 310 MF, bổ sung CBE ở mức qui định	70 % PMF + 30 % SOS giàu chất béo	64,99	19,98	15,04
12	CB Tây phi + hỗn hợp của các mẫu 310 MF, bổ sung CBE ở mức qui định	100 % PMF mềm	64,94	20,08	14,99
13	CB Tây phi + hỗn hợp của các mẫu 310 MF, bổ sung CBE ở mức qui định	70 % PMF + 30 % SOS giàu chất béo	56,91	28,04	15,05
a mẫu được lấy trong phép thử 40 kg sôcôla hoàn chỉnh. FCMP = full cream milk powder (sữa bột nguyên kem); SKMP = skimmed milk powder (sữa bột gầy); WP = whey powder (bột whey), PMF = palm mid fraction (phân đoạn giữa của cây cọ)

Bảng A.3 – Dữ liệu về độ chụm đối với mẫu sôcôla (mẫu 5 và 6) và đối với mẫu chất béo sôcôla (mẫu 10 đến 13)

Mẫu	5	6	10	11	12	13
Số lượng các phòng thử nghiệm	12	12	12	12	12	12
Số lượng các phòng thử nghiệm ngoại lệ	0	1	0	0	0	0
Số lượng các phòng thử nghiệm được chấp nhận	12	11	12	12	12	12
Giá trị trung bình, g CBE/100 g sôcôla	5,20	4,08	4,62	5,81	5,35	8,23
Giá trị thực, g CBE/100 g sôcôla	5,11	3,95	4,81	5,99	6,02	8,41
Giới hạn lặp lại, r, [r = 2,8 x sr] , g/100 g	0,276	0,150	0,261	0,188	0,186	0,231
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, g/100  g	0,098	0,054	0,093	0,067	0,067	0,082
Hệ số biến thiên lặp lại, CV (r), %	1,893	1,315	2,020	1,153	1,244	1,001
Giới hạn tái lập, R, [R = 2,8 x sR] , g/100 g	0,590	0,534	0,497	0,463	0,527	0,518
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, g/100  g	0,211	0,191	0,177	0,165	0,188	0,185
Hệ số biến thiên tái lập, CV(R), %	4,053	4,678	3,843	2,847	3,518	2,248
Các mẫu sôcôla từ số 1 đến số 4 và các mẫu chất béo sôcôla từ số 7 đến số 9 có bổ sung CBE mức thấp được dùng để kiểm tra cách tiếp cận phát hiện. Hiệu quả của cách tiếp cận phát hiện (phần trăm mẫu được phân loại đúng) là 100 %.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc ký đồ

CHÚ DẪN

t thời gian lưu

1	PPP	tripalmitin	12		chưa xác định
2	MOP	1-myristoyl-2-oleoyl-3-palmitoyl-glycerol	13	SSS	tristearin
3	PPS	1,2-dipalmitoyl-3-stearoyl-glycerol	14	SOS	1,3-distearoyl-2-oleoyl-glycerol
4	POP	1,3- dipalmitoyl-2-oleoyl-glycerol	15	SOO	1-stearoyl-2,3-dioleoyl-glycerol
5	PLP	1,3- dipalmitoyl-2-linoleoyl-glycerol		SLS	1,3-distearoyl-2-linoleoyl-glycerol
6		chưa xác định	16
				OOO	triolein
7	PSS	1-palmitoyl-2,3,distearoyl-glycerol	17	SLO	1- stearoyl-2-linoleoyl-glycerol
8	POS	1-palmitoyl-2-oleoyl-3-stearoyl-glycerol	18		chưa xác định
9	POO	1-palmitoyl-2,3,dioleoyl-glycerol	19		chưa xác định
10	PLS	1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-stearoyl-glycerol	20	SOA	1-stearoyl-2-oleoyl-arachidoyl-glycerol
11	PLO	1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol	21	AOO	1-arachidoyl-2,3-dioleoyl-glycerol

Các điều kiện thực nghiệm

Cột GLC:	25 m x 0,25 mm cột mao quản silca nung chảy được phủ bằng Chrompack TAP 0,1 mm.
Chương trình nhiệt độ:	100 oC được giữ trong ít nhất 2 min; 30 oC/min đến 270 oC được giữ trong 1 min; 2,5 oC/min đến 340 oC được giữ trong 7 min;
Bơm:	Lên cột lạnh
Detector (FID):	360 oC
Khí mang:	H2 có tốc độ dòng không đổi 3,5 ml/min

Hình B.1 – Biểu đồ sắc kí triacylglycerol của IRMM-801

CHÚ DẪN

t	thời gian lưu
1	POP 1,3- dipalmitoyl-2-oleoyl-glycerol
2	POS 1-palmitoyl-2-oleoyl-3-stearoyl-glycerol
3	POO 1-palmitoyl-2,3,dioleoyl-glycerol
4	SOS 1,3-distearoyl-2-oleoyl-glycerol
5	SOO 1-stearoyl-2,3-dioleoyl-glycerol
I	chất béo sữa 100 % phần khối lượng
II	bơ cacao 100 % phần khối lượng
III	bơ cacao 85 % phần khối lượng + chất béo sữa 15 % phần khối lượng
CN 34 đến CN 54	các nhóm pic tương ứng với số nguyên tử cacbon

Hình B.2 – Biểu đồ sắc kí triacylglycerol của MF tinh khiết, CB tinh khiết và hỗn hợp của CB với MF

CHÚ DẪN

t	thời gian lưu
1	PSB 1-palmitoyl-2-stearoyl-3-butylroyl-glycerol
CN 32 đến CN 40	các nhóm pic theo số lượng cacbon

Hình B.3 – Biểu đồ triacylglycerol của MF tinh khiết: phần sắc kí đồ dùng cho một phần dịch rửa giải PSB

CHÚ DẪN

t	thời gian lưu
1	a-cholestan
CN 26 đến CN 34	các nhóm pic tương ứng với số nguyên tử cacbon

Hình B.4 – Sắc kí đồ triacylglycerol của MF tinh khiết có bổ sung a-cholestan: phần sắc ký đồ đối với một phần dịch rửa giải a-cholestan

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Pipet một mức

[2] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức

[3] TCVN 2625 (ISO 5555), Dầu mỡ động vật và thực vật – Lấy mẫu

[4] ISO 8655-2, Piston-operated volumetric apparatus – Part 2: Piston pipettes

[5] TCVN 10730:2015, Sản phẩm cacao – Xác định hàm lượng chất béo – Phương pháp chiết Soxhlet *)

[6] KOEBER, R., BUCHGRABER, M., ULBERTH, F., BACAROLO, R., BERNREUTHER, A., SCHIMMEL, H., ANKALAM, E., PAUWELS, J. The certification of the content of five triglycerides in cocoa butter. European commission, Geel, 2003. (Report EUR 20781 EN)

[7] BUCHGRABER, M., ANDRONI, S. Validation of an annalytical approach to determine cocoa butter equivalents in milk chocolate – Report on the final collaborative trial. European commission, Geel, 2006. 162 p. (Report EUR 22553 EN). Available (2009 – 03-20) at: http://www.irmm.jrc.be/html/activities/cocoa_buttter_caculation_toolbox/EUR22553EN_CT_MC.pdf

[8] BUCHGRABER, M., ANDRONI, S., ANKLAM, E. Quantification of milk fat in chocolate fats by triacyglycerol analysis using gas-liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, pp. 3275-3283

[9] BUCHGRABER, M., SENALDI, C., ULBERTH, F. ANKLAM, E. Determination of cocoa butter equivalents in milk chocolate by triacylglycerol profiling. J. Agric. Food chem. 2007, 55, pp. 3284-3291.

[10] BUCHGRABER, M., SENALDI, C., ULBERTH, F., ANKALAM, E. Detection and quantification of cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate by gas liquid chromatography of triacylglycerols, J. AOAC Int. 2004, 87, pp. 1153-1163

[11] BUCHGRABER, M, Ulberth, F. ANKALAM, E. Method validation for detection and quantification of cocoa butter equivalents in cocoa butter and plain chocolate. J, AOAC Int. 2004 , 87, pp. 1164-1172

---