TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11136:2015 VỀ VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN BACILLUS ANTHRACIS TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BẰNG PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ CÁC METYL ESTE CỦA AXIT BÉO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11136:2015

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN BACILLUS ANTHRACIS TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BẰNG PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ CÁC METYL ESTE CỦA AXIT BÉO

Microbiology of food – Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F

Lời nói đầu

TCVN 11136:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2004.11 Identification of Bacillus anthracis from culture. Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters (FAMEs);

TCVN 11136:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN BACILLUS ANTHRACIS TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BẰNG PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ CÁC METYL ESTE CỦA AXIT BÉO

Microbiology of food – Detection of Bacillus anthracis from culture by gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters

1. Phạm vi áp dụng

Tiẻu chuẩn này quy định phương pháp xác định các chủng phân lập Bacillus anthracis thuần trong môi trường nuôi cấy.

2. Nguyên tắc

Nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp MIDI (Microbial IDentification Inc) và chiết các axit béo sau khi xà phòng hóa trong dung dịch metanol-natri hydroxit loãng, sau đó được tạo dẫn xuất bằng dung dịch metanol-axit clohydric loãng để thu được các metyl este của axit béo (FAME) tương ứng. Các metyl este của axit béo được chiết ra khỏi pha nước bằng dung môi hữu cơ và dung dịch tạo thành được phân tích bằng sắc ký khí (GC). Phần mềm MIDI tự động thực hiện mọi quá trình phân tích và sử dụng thuật toán nhận dạng mẫu được công nhận để nhận dạng FAME chưa biết so với thư viện phổ.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

3.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích LC và sử dụng nước cất hoặc nước đã loại ion có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

CHÚ Ý: Rửa sạch tất cả các dụng cụ thủy tinh, kể cả các chai đựng thuốc thử bằng cách ngâm trong chất làm sạch chất lượng cao về sinh học, sau đó được rửa kỹ bằng nước cất. Làm khô các chai đựng Thuốc thử 2 và Thuốc thử 3 trước khi chuẩn bị hoặc bổ sung các chất phản ứng. Các ống đựng môi trường nuôi cấy và các chai đựng thuốc thử phải có nắp với lớp lót bằng Teflon. Chuẩn bị các thuốc thử trong chai màu nâu sạch, dung tích 1 lít đã dán nhãn, trong có que khuấy phủ Teflon để hỗ trợ cho việc trộn. Chỉ có phần thủy tinh và lớp Teflon có thể tiếp xúc với thuốc thử. Các thuốc thử phải bền ít nhất 60 ngày ở nhiệt độ phòng.

3.2. Thuốc thử 1, natri hydroxit trong metanol

Hòa tan 45 g natri hydroxit (NaOH) trong 150 ml metanol và 150 ml nước cất.

3.3. Thuốc thử 2, axit clohydric trong metanol

Trộn 325 ml axit clohydric (HCI) đã được chứng nhận hoặc đã được chuẩn hóa 6,00 M với 275 ml metanol.

3.4. Thuốc thử 3, dung môi hỗn hợp

Trộn 200 ml hexan với 200 m metyl-tert-butyl ete (MTBE).

3.5. Thuốc thử 4, dung dịch natri hydroxit

Hòa tan 10,8 g natri hydroxit trong 900 ml nước đã khử ion hoặc nước cất.

3.6. Dung dịch natri clorua bão hòa

Cho 40 g natri clorua (NaCI) vào 100 ml nước cất.

3.7. Dung dịch hiệu chuẩn

Hỗn hợp của các axit béo bão hòa mạch thẳng từ C9 đến C20 và 5 hydroxy axit, được cung cấp cùng hệ thống GC. Các hydroxy axit đặc biệt nhạy với các thay đổi về áp suất/nhiệt độ và nhiễm bẩn lớp lót cổng bơm. Vì vậy, các hợp chất này được dùng để kiểm soát chất lượng của hệ thống.

3.8. Môi trường nuôi cấy

Thạch trypticase đậu tương với 5% máu cừu đã khử fibrin, ví dụ BD Biosciences Codified Cat. No. 221239.

3.9. Vi sinh vật kiểm soát chất lượng (QC): B. cereus ATCC 14579.

3.10. Chuẩn hiệu chuẩn MIS (Microbial Identification System).

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Hệ thống nhận dạng, ví dụ: hệ thống nhận dạng vi khuẩn (MIS) Sherlock, phần mềm phiên bản 4.0 hoặc cao hơn (MIDI).

4.2. Thư viện các vi khuẩn khủng bố sinh học MIDI và phương pháp phiên bản BTR20 hoặc mới hơn.

4.3. Máy sắc ký khí, được trang bị detector ion hóa ngọn lửa (FID), bộ lấy mẫu tự động, bộ bơm mẫu, bộ điều khiển và khay lấy mẫu.

Điều kiện hoạt động:

4.4. Cột mao quản, ví dụ kích thước 25 m x 0,2 mm x 0,33 mm độ dày màng với 5% diphenyl + 95% dimetylsiloxan, hoặc tương đương.

4.5. Hệ thống máy tính, hệ thống MIDI chạy trên một máy tính tương thích.

4.6. Xyranh.

4.7. Lớp lót cổng bơm.

4.8. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 35 °C ± 1 °C. Không sử dụng tủ ấm có CO₂.

4.9. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ từ 95 °C đến 100 °C và ở 80 °C ± 1 °C. Không sử dụng khối gia nhiệt.

4.10. Máy trộn Vortex.

4.11. Que cấy, đường kính vòng 4 mm.

4.12. Bộ trộn quay.

4.13. Pipet, điều chỉnh được dung tích 2 ml và 5 ml.

4.14. Pipet Pasteur, dùng một lần.

4.15. Lọ lấy mẫu tự động, dung tích 2 ml, có nắp vặn.

4.16. Ống nuôi cấy, kích thước 13 mm x 100 mm, có nắp vặn.

5. Cách tiến hành

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng pipet chỉ có các phần Teflon hoặc thủy tinh tiếp xúc với thuốc thử. Không sử dụng pipet có bầu cao su. Làm nóng hoặc dùng ngọn lửa đốt đầu tip pipet Pasteur dùng một lần, có miếng đệm ngăn bọt khí để tránh nhiễu pic sắc ký. Các pipet tự động cần được kiểm tra trước khi dùng. Kiểm tra lượng phân phối của các pipet 2 ml và 5 ml bằng cách phân phối các lượng xác định vào ống đong chia vạch 10 ml.

5.2. Phân lập tế bào

Phòng thử nghiệm thực hiện theo quy trình thao tác chuẩn (SOP).

Lấy các đĩa thạch máu ra và để cho cân bằng đến nhiệt độ phòng.

Ghi lại mã nhận biết cho các đĩa thạch máu. Một người thứ hai kiểm tra ống thạch nghiêng và đĩa thạch máu để khẳng định chính xác việc truyền lại mã nhận biết.

Cấy đĩa thạch thứ nhất: Sử dụng kiểu ria cấy bốn vùng để có bốn mức mật độ và để kiểm tra độ thuần khiết.

Ủ đĩa thứ nhất trong tủ ấm (4.8) ở 35 °C ± 1 ^oC trong 24 h ± 2 h.

Cấy đĩa thạch thứ hai: tiệt trùng và làm nguội vòng cấy (4.11) bằng cách di vòng cấy trên phần không có vi khuẩn mọc của đĩa thạch thứ nhất. Chọn phần vi khuẩn thuần có mật độ thưa nhất, lấy một ít vi khuẩn ria cấy bốn vùng lên đĩa thạch thứ hai.

Ủ đĩa thứ hai trong tủ ấm (4.8) ở 35 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h.

Chuyển khoảng 40 mg tế bào (khoảng một vòng cấy đầy) từ vùng thưa nhất có vi khuẩn mọc theo đường cấy (pha log). Trường hợp điển hình, sinh khối tế bào được thu lấy từ vùng cấy thứ ba nhưng với các chủng Bacillus phát triển nhanh thì có thể thu lấy tế bào từ vùng thứ ba hoặc thứ tư. Chuyển các tế bào sang ống nuôi cấy có nắp vặn (4.16) sạch, khô, dán nhãn.

5.3. Chuẩn bị các metyl este axit béo từ tế bào nuôi cấy

CHÚ Ý: Phải thực hiện chính xác các bước quy định. Mọi sai lệch sẽ cho kết quả không chính xác.

5.3.1. Xà phòng hóa

Đặt giá đựng các ống sinh khối tế bào vào nồi cách thủy đun sôi (4.9). Dùng pipet lấy 1,0 ml ± 0,1 ml thuốc thử 1 (3.2) cho vào mỗi ống. Vặn chặt nắp ống. Sau 30 min, lấy giá đựng ống nghiệm ra và làm nguội dưới vòi nước lạnh.

5.3.2. Metyl hóa

Cho 2,0 ml ± 0,1 ml thuốc thử metyl hóa (thuốc thử 2) (3.3) vào mỗi ống. Trộn dung dịch trên máy trộn Vortex (4.10) khoảng từ 5 s đến 10 s và vặn chặt nắp. Làm nóng các ống nghiệm ở 80 °C ± 1 °C trong nồi cách thủy (4.9) khoảng 10 min ± 1 min. Lấy giá đựng ống nghiệm ra và làm nguội dưới vòi nước lạnh.

5.3.3. Chiết

Cho 1,25 ml ± 0,1 ml dung môi hỗn hợp (thuốc thử 3) (3.4) vào mỗi ống. Vặn chặt nắp. Đặt các ống nghiệm trong bộ trộn quay (4.12) và trộn nhẹ trong 10 min. Sử dụng một pipet Pasteur (4.14) sạch cho mỗi ống và loại bỏ pha nước.

5.3.4. Rửa

Bổ sung 3,0 ml ± 0,1 ml dung dịch natri hydroxit (thuốc thử 4) (3.5) vào mỗi ống. Vặn chặt nắp. Đặt các ống vào bộ trộn quay của phòng thử nghiệm (4.12) và trộn nhẹ trong 5 min. Nếu cần, thêm vài giọt dung dịch natri clorua bão hòa (3.6) ống để hỗ trợ cho việc phá nhũ tương. Giữ ống theo phương thẳng đứng, cuộn ống nhanh giữa hai lòng bàn tay và để yên trong vài phút. Ngoài ra, có thể ly tâm 3 min ở tốc độ 2000 r/min. Chuyển ngay pha phía trên và không để lớp phía trên tiếp xúc với dịch rửa.

5.3.5. Chuyển dịch chiết

Dán nhãn các lọ lấy mẫu tự động tương ứng chính xác với các lọ thử nghiệm. Sử dụng một pipet Pasteur (4.14) cho mỗi dung dịch, chuyển khoảng 2/3 lớp hữu cơ phía trên vào các lọ lấy mẫu tự động đã dán nhãn. Đậy nắp với màng ngăn PTFE.

5.3.6. Bảo quản dịch chiết

Bảo quản các lọ đã đậy nắp ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh (từ 2 °C đến 8 °C) đến 7 ngày. Sau khi phân tích GC, dịch chiết có thể được bảo quản trong tủ lạnh đến 7 ngày.

5.4. Chuẩn hiệu chuẩn

Các dữ liệu thời gian lưu được chuyển đổi bởi hệ thống phần mềm sang số liệu chiều dài chuỗi tương đương (ECL) để xác định tên axit béo của vi khuẩn. Giá trị ECL đối với mỗi axit béo thu được là hàm số thời gian rửa giải liên quan đến các thời gian rửa giải của các axit béo mạch thẳng đã biết và được thiết lập theo 0,010 đơn vị ECL. Phần mềm này so sánh giá trị ECL cho các dãy ổn định nhất (mạch thẳng bão hòa hoặc axit mạch nhánh) với các giá trị thiết lập về lý thuyết. Nếu có sự khác biệt so với các chuẩn, thì hệ thống có thể tự động hiệu chuẩn lại.

5.5. Sự phù hợp của hệ thống

Điền vào bảng định tính hiệu năng (PQ) đối với mỗi mẻ thử nghiệm. Mỗi mẻ có 2 lần chạy hiệu chuẩn, một kiểm chứng dương tính vi khuẩn Bacillus cereus (ATCC 14.579) và một mẫu trắng để kiểm chứng âm tính ban đầu. Phép kiểm chứng dương tính B. cereus là phép chẩn đoán đối với quy trình chuẩn bị mẫu và yêu cầu phải có chỉ số tương tự Similarity Index (SI) > 0,600. Phép kiểm chứng âm tính là chẩn đoán về các chất nhiễm bẩn. Các dữ liệu hiệu chuẩn thứ hai là chẩn đoán về các vấn đề của phần cứng.

5.6. Xác định

Mỗi phép xác định bao gồm:

– Bơm chất chuẩn hiệu chuẩn MIS (3.10) hai lần.

– Bơm mẫu trắng QC.

– Bơm chủng vi khuẩn kiểm chứng Bacillus cereus.

Điền các thông số vào bảng MIDI PQ ngay sau khi hai lần chạy 2 GC. Nếu thông số bất kỳ nằm ngoài phạm vi, thì dừng lại và thực hiện hành động khắc phục.

– Nếu bảng MIDI PQ được thông qua, thì tiếp tục bơm từng dịch chiết thử nghiệm.

– Hệ thống sẽ tự động bơm dung dịch chuẩn hiệu chuẩn bổ sung sau lần chạy thứ 11.

5.7. Giải thích kết quả

Việc nhận biết vi khuẩn được dựa trên hệ thống SI, biểu thị mối tương quan giữa các thành phần axit béo của vi khuẩn thử nghiệm so với các thành phần axit béo của mẫu chuẩn. Sự phù hợp chính xác cho SI = 1,000. Chủng cấy được xác định là B. anthracis khi đây là lựa chọn thứ nhất và SI > 0,400, như đã được xác định trong nghiên cứu chọn lọc dương/chọn lọc âm.

Hệ thống tự động kiểm tra phản ứng GC tổng và các pic một cách chính xác. Đánh dấu sắc ký đồ không đáp ứng được các quy định về chất lượng. Các hướng dẫn được đưa ra để khắc phục sự cố và thử nghiệm lại. Nếu kết quả thử vẫn có vấn đề thì phép thử không hợp lệ.

a) Xác định Bacillus anthracis là dương tính hay âm tính, áp dụng các quy tắc sau đây:

– nếu phép thử bị đánh dấu thì phép thử đó không hợp lệ.

– nếu Bacillus anthracis (BA) có SI < 0,400 và BA có SI < NN SI, khi đó phép thử là âm tính Bacillus anthracis.

– nếu BA có SI > 0,400 và BA SI > NN SI, khi đó phép thử là dương tính Bacillus anthracis.

BA SI là chỉ số tương đồng cao nhất được báo cáo cho hệ thống MIDI về B. anthracis. NN SI là chỉ số tương đồng cao nhất được báo cáo cho hệ thống MIDI về mục nhập lân cận gần nhất.

Điểm ngắt SI 0,400 đối với B. anthracis được thiết kế để đảm bảo sự phù hợp với cơ sở dữ liệu phản ánh sự thích ứng mức loài xác định.

b) Tỷ lệ độ nhạy

Độ nhạy là khả năng mà phương pháp sẽ phân loại mẫu thử là dương tính, mẫu thử được biết là dương tính. Ước tính độ nhạy (p+) thu được bằng cách đếm số lượng dương tính đã biết đối với phương pháp thử (ai) ngoài các mẫu thử B. anthracis (n_i) đối với phòng thử nghiệm thứ i:

c) Tỷ lệ đặc hiệu

Tỷ lệ đặc hiệu là khả năng mà phương pháp sẽ phân loại mẫu thử là âm tính, mẫu thử được biết là âm tính. Ước tính tỷ lệ đặc hiệu (p_) thu được bằng cách đếm số lượng âm tính đã biết đối với phương pháp thử (b_i) ngoài các mẫu thử lân cận gần nhất (m_i) đối với phòng thử nghiệm thứ i:

6. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) các kết quả thu được;

d) ngày kết thúc thử nghiệm;

e) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả.