TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-32:2015 VỀ BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 32: BỆNH GUMBORO Ở GIA CẦM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-32:2015

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 32: BỆNH GUMBORO Ở GIA CẦM

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 32: Infectious bursal disease

Lời nói đầu

TCVN 8400-32:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần:

– TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

– TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

– TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

– TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

– TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

– TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

– TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

– TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

– TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

– TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

– TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

– TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

– TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela;

– TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

– TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

– TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

– TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

– TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

– TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

– TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

– TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

– TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

– TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

– TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

– TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

– TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

– TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

– TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

– TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

– TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

– TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

– TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò;

– TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

– TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

– TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 32: BỆNH GUMBORO Ở GIA CẦM

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 32: Infectious bursal disease

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Gumboro do virus thuộc giống Avibirnavirus, họ Birnaviridae gây ra ở gia cầm.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1. Bệnh Gumboro (Infectious bursal disease)

Bệnh do virus thuộc giống Avibirnavirus, họ Birnaviridae gây ra ở gà; gà tây, vịt, gà sao và đà điểu cũng có thể bị nhiễm.

CHÚ THÍCH: Bệnh Gumboro đặc trưng bởi sự phá hủy các cơ quan lympho, đặc biệt là các tế bào lympho ở túi Fabricius, tuy nhiên chỉ ở gà có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Tế bào đích của virus là lympho B ở giai đoạn chưa biệt hóa dẫn đến suy giảm miễn dịch. Virus Gumboro thuộc nhóm ARN virus, cấu tạo virus bao gồm axit ribonucleic bên trong, bao quanh là lớp vỏ bọc cấu tạo bằng protein, ngoài phần vỏ bọc protein virus không có vỏ bọc lipid.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp parafin

3.1.1. Formalin, dung dịch 10 % (thể tích)

Chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % (thể tích) và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với tỷ lệ 1 : 9 (thể tích).

3.1.2. Etanol 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

3.1.3. Xylen.

3.1.4. Haematoxylin.

3.1.5. Eosin.

3.1.6. Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

3.1.7. Keo dán lamen.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime RT-PCR (phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase theo thời gian thực)

3.2.1. Kít tách chiết ARN (axit ribonucleic)

3.2.2. Kít nhân gen, dùng cho phản ứng realtime RT-PCR.

3.2.3. Cặp mồi và mẫu dò (primers và probe).

3.2.4. Etanol tuyệt đối, dùng cho tách chiết mẫu ARN/ADN.

3.2.5. Dung dịch PBS, pH 7,0 (xem Phụ lục A).

3.2.6. Mẫu ARN đối chứng dương, tách chiết từ virus gây bệnh Gumboro, có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước.

3.2.7. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.8. Nước, tinh khiết không có nuclease.

3.3. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym)

Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể Gumboro. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1. Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 80 °C đến âm 20 °C.

4.1.2. Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.1.3. Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 r/min đến 2 500 r/min.

4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp parafin

4.2.1. Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.2. Máy xử lý mẫu mô tự động.

4.2.3. Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.2.4. Khay sắt, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.5. Máy làm lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.2.6. Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 mm đến 5 mm.

4.2.7. Nồi dãn tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.2.8. Phiến kính, vô trùng.

4.2.9. Lamen, vô trùng.

4.2.10. Bộ cốc nhuộm tiêu bản.

4.2.11. Kính hiển vi quang học, vật kính 4 X, 10 X, 20 X, 40 X, 60 X.

4.3. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT- PCR

4.3.1. Máy nhân gen (realtime PCR).

4.3.2. Máy ly tâm, tạo gia tốc ly tâm 3 000 g, 6 000 g và 20 000 g.

4.3.3. Cối chày sứ, vô trùng.

4.3.4. Máy spindown.

4.4. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

4.4.1. Máy đọc ELISA, có thể đọc được bước sóng 650 nm.

5. Chẩn đoán lâm sàng

5.1. Đặc điểm dịch tễ

– Gà, gà tây, vịt, gà sao và đà điểu có thể bị nhiễm, nhưng thường chỉ thấy gà có biểu hiện triệu chứng lâm sàng;

– Ở gà lứa tuổi mẫn cảm nhất với bệnh là từ 3 tuần tuổi đến 6 tuần tuổi;

– Thời gian ủ bệnh kéo dài từ 2 ngày đến 3 ngày;

– Tỷ lệ chết lên đến 30 % ở các đàn gà hướng thương phẩm và 60 % ở các đàn gà hướng sinh sản. Tỷ lệ chết cao nhất trong khoảng thời gian từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 sau khi nhiễm virus;

– Virus bài tiết qua phân 2 ngày sau khi nhiễm và kéo dài ít nhất từ 10 ngày đến 14 ngày;

– Virus lây lan qua không khí hoặc qua thức ăn, nước uống.

5.2. Triệu chứng lâm sàng

– Giai đoạn đầu của bệnh: đàn gia cầm xơ xác, bay nhảy lung tung, mổ nhau; sau đó xuất hiện các triệu chứng nghoẹo đầu, rúc mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, gia cầm thường thích nằm, mắt lim dim, mệt mỏi và thường dồn về một góc chuồng;

– Giai đoạn sau: cơ vùng hậu môn co bóp nhanh, mạnh, không bình thường, giống như gia cầm muốn đi ngoài nhưng không thực hiện được; biểu hiện ngứa vùng hậu môn, hay quay đầu lại mổ vùng hậu môn; con vật bị tiêu chảy. Phân loãng, lúc đầu có màu trắng ngà sau đó chuyển dần sang màu vàng trắng, xanh vàng, đôi khi lẫn máu. Gia cầm kém ăn hoặc bỏ ăn, sốt, thân nhiệt tăng cao sau đó giảm xuống và chết sau vài ngày.

5.3. Bệnh tích đại thể

– Xác gia cầm thường khô do bị mất nước, quanh hậu môn thường bẩn;

– Cơ đùi và cơ ngực sung huyết, xuất huyết lấm chấm: trường hợp sung huyết, khi lột da thấy cơ khô nhanh và có màu sẫm; trường hợp xuất huyết, lột da thấy có các vệt xuất huyết, có khi chạy dài thành tia;

– Túi Fabricius ở giai đoạn đầu (khoảng 3 ngày đầu) sưng to, xung quanh túi có thủy thũng, đặc biệt là vùng cuống túi tiếp giáp trực tràng; túi chuyển màu trắng đục; túi bở, các nếp múi khế rìa tù; giai đoạn tiếp theo túi thường có xuất huyết điểm hoặc kéo dài thành vệt ở niêm mạc túi. Giai đoạn sau cùng kích thước túi Fabricus trở về bình thường sau đó teo nhỏ đi;

– Đôi khi thấy xuất huyết ở dạ dày tuyến, tăng dịch nhày trong ruột;

– Gan có thể bị sưng và nhồi huyết, lách phì đại, thận sưng.

5.4. Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng

Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng giữa bệnh Gumboro và một số bệnh khác trên gia cầm theo Bảng 1.

Bảng 1 – Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng

Bệnh	Biểu hiện
Gumboro	Xác gia cầm thường khô do bị mất nước, quanh hậu môn thường bẩn. Cơ đùi và cơ ngực sung huyết, xuất huyết lấm chấm hoặc thành tia. Túi Fabricius ở giai đoạn đầu (khoảng 3 ngày đầu) sưng to, thủy thũng, các nếp múi khế rìa tù; giai đoạn tiếp theo túi thường có xuất huyết điểm hoặc kéo dài thành vệt ở niêm mạc túi. Giai đoạn sau cùng kích thước túi Fabricus trở về bình thường sau đó teo nhỏ đi.
Newcastle	Xảy ra ở gà mọi lứa tuổi, có triệu chứng ủ rũ, phân trắng và bệnh tích xuất huyết dạ dày tuyến giống Gumboro. Nhưng diễn biến bệnh Newcastle kéo dài còn bệnh Gumboro thường chỉ xảy ra trong vòng từ 5 ngày đến 10 ngày là kết thúc; trong bệnh Newcastle túi Fabricius không sưng, không xuất huyết, không teo và không sung huyết.
Cúm gia cầm	Xảy ra ở nhiều loài gia cầm và mọi lứa tuổi, có triệu chứng giống bệnh Gumboro là xù lông, tiến triển bệnh nhanh, xuất huyết dạ dày tuyến. Nhưng bệnh cúm gia cầm sưng phù đầu, mặt, xuất huyết da chân, các cơ quan phù tạng sung huyết, xuất huyết tràn lan.
Viêm phế quản truyền nhiễm (IB)	Bệnh xảy ra rất nhanh trong toàn đàn với các triệu chứng: sốt, ủ rũ, xù lông, kém ăn, thở khó, thở bằng miệng và luôn kèm theo tiếng khò khè, chảy nước mũi, nước mắt. Khí quản, phế quản xuất huyết, có chứa dịch nhầy.

6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh Gumboro

6.1.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà nghi mắc bệnh mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau:

– Túi Fabricius: cắt ngang túi;

– Lách: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm;

– Hạch ruột vùng đầu manh tràng: cắt toàn bộ hạch.

Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3 1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1:10, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tể, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.1.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, băng dính gói kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới formalin (3.1.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1:10.

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

– Mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) thời gian 24 h;

– Cắt các bệnh phim đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.2.1).

6.1.4. Cách tiến hành

6.1.4.1. Đúc khuôn

– Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2 , thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy chuyển mẫu mô tự động (4.2.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

– Đúc khuôn: rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt chuyên dụng (4.2.4), gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.1.4.2. Cắt tiêu bản

– Cắt gọt khối parafin (6.1.4.1) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5);

– Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 μm đến 5 mm, cắt một vài lát;

– Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C. Dùng phiến kính (4.2.8) vớt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản

– Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

– Rửa dưới vòi nước chảy làm sạch eosin (3.1.5) còn bám trên phiến kính;

– Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kinh hiển vi quang học (4.2.11).

6.1.5. Đọc kết quả^[1]

– Mẫu lấy vào giai đoạn đầu của quá trình viêm: cấu trúc các nang lympho của túi Fabricius không còn rõ hình đa giác, chuyển sang hình tròn hoặc hình ovan, vách ngăn các nang giãn rộng, phù, xuất huyết, có sự xâm nhập của các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào lympho hoại tử. Tế bào lưới nội mô tăng sinh;

– Mẫu lấy vào giai đoạn phản ứng viêm giảm: nang túi Fabricius tăng sinh các tế bào biểu mô phần giữa lớp vỏ và tủy;

– Lách, hạch lympho manh tràng có các tế bào lympho bị hoại tử.

6.2. Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện virus Gumboro

6.2.1. Lấy mẫu

Chọn 3 đến 5 con gia cầm nghi bệnh, mổ lấy từ 3 g đến 5 g túi Fabricius cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm virus: được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 ^oC đến 8 ^oC). Mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu mẫu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo quản trong tủ âm 20 °C (4.1.1).

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lấy 1 g mẫu mô túi Fabricius, cắt nhỏ rồi nghiền thành huyễn dịch với dung dịch PBS (3.2.5) theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích) trong cối chày sứ (4.3.3). Ly tâm (4.3.2) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ARN cho phản ứng realtime RT-PCR.

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy miniKit (Cat. No.74104)1) (xem Phụ lục B)

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi và mẫu dò

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút Gumboro sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.3) được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 – Trình tự cặp mồi và mẫu dò^[2]

Mẫu dò, mồi	Trình tự từ 5’ đến 3’
Mẫu dò	FAM-TCTTTTTCCCTGGATTCCCTGGCTCA-TAMRA
Mồi xuôi	GGACACAGGGTCAGGGTCAAT
Mồi ngược	GCAGTGTGTAGTGAGCACCCA

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

– Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

– Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước (3.2.8));

– Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (6 ml mồi gốc và 94 ml nước(3.2.8)).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR system (Cat # 11732 – 020)2), thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 – Thành phần phản ứng

Thành phần	Thể tích ml
Reaction Mix 2X	12,5
Hỗn hợp Enzym (Enzyme mix)	0,5
Mồi/ mẫu dò	1,5
Nước tinh khiết không có nuclease	5,5
Tổng thể tích	20,0

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

– Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ARN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

– Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

– Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ARN (phụ lục B) vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

– Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương, mẫu kiểm chứng âm.

– Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.3.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong bảng 4.

Bảng 4 – Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C	15 min	1
95 °C	2 min
95 °C	10 s	40
60 °C	30 s	40

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.3.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền)

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Gumboro

6.3.1. Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu tĩnh mạch cánh hoặc máu tim của gà nghi mắc bệnh nhưng chưa tiêm phòng vắc xin. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1).

6.3.3. Chuẩn bị mẫu

Chắt huyết thanh từ xy lanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.3.4. Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Gumboro (Infectious Brusal disease test kit) của hãng IDEXX3)

6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

– Các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đến 26 °C);

– Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu (Lấy 1 ml huyết thanh pha với 500 ml dung dịch pha loãng mẫu);

– Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 10 lần (Wash Concentrate 10 X): lấy 1 phần nước rửa đậm đặc pha với 9 phần nước cất;

– Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 ml/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;

– Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control – NC), kiểm chứng dương (Positive Control – PC).

6.3.4.2. Tiến hành phản ứng

Bước 1: Nhỏ huyết thanh

– Nhỏ 100 ml dung dịch pha loãng mẫu vào giếng có mẫu trắng (Blank);

– Nhỏ 100 ml kiểm chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm;

– Nhỏ 100 ml kiểm chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối chứng dương;

– Nhỏ 100 ml huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng vào các giếng thích hợp;

– Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;

– Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

– Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể (conjugate)

– Nhỏ 100 ml dung dịch kháng kháng thể vào các giếng;

– Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 30 min;

– Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

– Nhỏ 350 ml dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 3: Nhỏ cơ chất

– Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất TMB vào các giếng;

– Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 °C đến 26 °C trong 15 min.

Bước 4: Dừng phản ứng

– Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào các giếng;

Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm.

6.3.5. Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

– Giá trị OD của đối chứng dương trừ giá trị OD của đối chứng âm phải lớn hơn 0,075;

– Giá trị OD của đối chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.

Tính kết quả:

– Trung bình của đối chứng âm: [NC1 A (650) + NC2 A(650)] / 2 = NC x tb

– Trung bình của đối chứng dương: [PC1 A (650) + PC2 A (650)] / 2 = PC x tb

– Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu – NC x tb) / (PCx tb – NC x tb)

– Hiệu giá của mẫu: log₁₀ Titer = 1,09 (log₁₀ S/P) + 3,36

CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.

Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

– Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Gumboro có S/P lớn hơn hoặc bằng 0,20;

– Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Gumboro có S/P nhỏ hơn 0,20.

7. Kết luận

Gia cầm được xác định mắc bệnh Gumboro khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong các phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này.

 

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.1. Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)              9,47 gm

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)              9,08 gm

Nước cất                                              900 ml

A.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ARN sử dụng kít QIAGEN RNeasy miniKit (CAT. No. 74104) như sau:

– Lấy 600 ml dung dịch RLT (lysis buffer) vào ống 1,5 ml;

– Lấy 200 ml mẫu (dịch nổi được xử lý ở 6.2.3) vào ống có chứa dung dịch RLT. Lắc ống bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s;

– Cho tiếp 400 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào ống. Lắc ống bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s;

– Chuyển 600 ml dung dịch sang cột lọc (dùng cho tách chiết ARN) đựng trong ống thu, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s;

– Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống thu và lặp lại bước trên với 600 ml dung dịch còn lại;

– Lấy 700 ml dung dịch RW1 nhỏ vào cột lọc, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s. Đỗ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống;

– Lấy 500 ml RPE nhỏ vào cột lọc, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s: Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống. Lặp lại bước này 1 lần nữa;

– Chuyển cột lọc sang ống thu mới. Ly tâm (4.3.2) cột lọc với gia tốc 12 000 g trong 2 min;

– Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml sạch Rnase;

– Nhỏ 50 ml nước sạch Rnase vào cột lọc, ủ trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

– Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 10 000 g trong 1 min;

– Bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml có chứa ARN;

– Cất mẫu ARN ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime RT-PCR ngay và bảo quản ở âm 20 °C để lưu mẫu trong thời gian dài.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Thierry van den Berg, 2008. Poultry disease. 6^th Edition. Saunders Elsevier. p.359 – 366.

[2] Judit Iván, Maja Velhner, Krisztina Ursu, Péter Germán, Tamás Mató, Csaba Nick Drén, and János Mészáros, 2005. Delayed vaccine virus replication in chickens vaccinated subcutaneously with an immune complex infectious bursal disease vaccine: Quantification of vaccine virus by real-time polymerase chain reaction, Can J Vet Res. Apr; 69(2): 135-142.

[3] JICA, 2003., Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition. p 163-164.

[4] N.Eterradossi and Y.M.Saif, 2008. Disease of Poultry. 12^th Edition. Blackwell Publishing. p.185-208.

[5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thuý, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại Học Nông Nghiệp.

[6] T.P. van den Berg, N. Eterradossi, D. Toquin & G. Meulemans, “Infectious bursal disease (Gumboro disease)”, Rev. sci. tech. Off. int Epiz, 2000, 19 (2), 527-543. Available at: http://www.oie.int/doc/ged/D9315.PDF.

[7] Overview of lnfectious bursal disease in poultry. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/poultry/infectious_bursal_disease/overview_of_infectious_bursal _disease_in_poultry.html

[8] Infectious bursal disease (Gumboro). Available at: http://www.thepoultrysite.com/publications/6/diseases-of-poultry/193/infectious-bursal-disease-gumboro

[9] Thierry van den Berg (2000), Acute infectious bursal disease in poultry: A review, Avian Pathology, Taylor and Francis publishers, p.175-194.

---