TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10412-1:2014 (ISO 10633-1:1995) VỀ KHÔ DẦU – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSINOLAT – PHẦN 1 – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10412-1:2014

ISO 10633-1:1995

KHÔ DẦU – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSINOLAT –  PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Oilseed residues – Determination of glucosinolates content – Part 1: Method using high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 1010412-1:2014 hoàn toàn tương đương với ISO 10633-1:1995, đã được rà soát lại năm 2013, không thay đổi về bố cục và nội dung;

TCVN 10412-1:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

KHÔ DẦU – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSINOLAT –  PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Oilseed residues – Determination of glucosinolates content – Part 1: Method using high-performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng của các glucosinolat khác nhau trong hạt có dầu thuộc họ cải.

CHÚ THÍCH

1. Phương pháp này không xác định các glucosinolat được thay thế một phân tử glucose,tuy nhiên các hợp chất này không quan trọng trong hạt cải dầu thương mại.

2. Phương pháp này cho phép xác định glucosinolat chưa biến đổi. Tuy nhiên, phương pháp này không định tính và định lượng được các sản phẩm tạo thành từ việc phân hủy glucosinolat trong quá trình nghiền bột. Do đó, không thể xem xét ảnh hưởng của chấtnghèo dinh dưỡng của các sản phẩm phân hủy này.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4801:1989 (ISO 771:1977), Khô dầu – Phương pháp xác định hàm lượng ẩm và các chất bay hơi.

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 9610:2013 (ISO 5502:1992), Khô dầu – Chuẩn bị mẫu thử.

TCVN 10413-1:2014 (ISO 9167-1:1992), Hạt cải dầu – Xác định hàm lượng glucosinolat – Phần 1: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

3. Nguyên tắc

Chiết glucosinolat trong dung dịch metanol, sau đó tinh sạch và khử sulfat bằng enzym trên resin trao đổi ion. Phép xác định sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo với rửa giải gradient và detector UV.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với loại 2 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có các qui định khác.

4.1. Metanol, loại dùng cho HPLC, dung dịch 70 % (thể tích).

4.2. Natri axetat, dung dịch 0,02 mol/l ở pH 4,0.

4.3. Natri axetat, dung dịch 0,2 mol/l.

4.4. Imidazol format, dung dịch 6 mol/l.

Hòa tan 204 g imidazol trong 113 ml axit formic đựng trong bình định mức một vạch 500 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch.

4.5. Chất chuẩn nội

Sử dụng sinigrin ngậm một phân tử nước (kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước, M_r= 415,49) (xem A.1), hoặc glucotropaeolin (kali benzylglucosinolate, M_r = 447,52) đối với hạt có dầu chứa sinigrin tự nhiên (xem A.2).

Xem Phụ lục A về việc chuẩn bị và kiểm tra độ tinh sạch của các thuốc thử này.

4.6. Pha động

4.6.1. Dung môi A: nước được lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 μm và được tinh sạch qua hệ thống cột than hoạt tính1), hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

4.6.2. Dung môi B: axetonitril, loại dùng cho HPLC, dung dịch 20 % (thể tích) trong nước đã tinh sạch và được lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 μm. Nồng độ có thể thay đổi tương ứng với cột được sử dụng.

4.7. Resin trao đổi ion

4.7.1. DEAE Sepharose CL-6B2), dạng huyền phù có bán sẵn trên thị trường, hoặc sản phẩm tương đương.

4.7.2. Huyền phù DEAE Sephadex A25²⁾

Trộn 10 g resin DEAE Sephadex A25 (hoặc tương đương) trong dung dịch axit axetic 2 mol/l dư. Để cho lắng xuống. Thêm axit axetic 2 mol/l cho đến khi thể tích của dịch lỏng ngang bằng với thể tích của phần lắng.

4.8. Sulfatase, loại Helix pomatia typ H₁ (EC 3.1.6.1)3).

Tinh sạch, kiểm tra và pha loãng sulfatase theo phương pháp nêu trong A.3.1 đến A.3.4.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

5.1. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, có rửa giải gradient và duy trì nhiệt độ cột 30 °C, nối với detector UV cho phép đo ở bước sóng 229 nm.

5.2. Cột sắc ký dùng cho HPLC, loại C₁₈ hoặc C₈, cỡ hạt nhỏ hơn hoặc bằng 5 μm, ví dụ4):

Cột Lichrosorb RP 18, ≤ 5 μm (150 mm x 4,6 mm);

Cột Spherisorb ODS2, ≤ 5 μm (250 mm x 4 mm; 250 mm x 5 mm);

Cột Novapak C₁₈, ≤ 4 μm (150 mm x 4 mm);

Cột Lichrospher RP8, ≤ 5 μm (125 mm x 4 mm);

Cột Nucleosil C₁₈, ≤ 5 μm (200 mm x 4 mm).

Hiệu năng của cột phải được kiểm tra thường xuyên, tốt nhất là sử dụng mẫu so sánh của desulfoglucosinolat5) từ hạt cải dầu. Đặc biệt, cột không được làm suy giảm 4-hydroxyglucobrassicin, một glucosinolat quan trọng nhưng tương đối không ổn định.

Các cột mới phải tuân theo theo hướng dẫn của nhà sản xuất để ổn định cột sao cho thu được các kết quả tái lập.

5.3. Máy đo phổ hai chùm tia, có khả năng hoạt động trong vùng tia UV  của quang phổ và ở nhiệt độ được kiểm soát 30 °C, được trang bị cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 1 cm và hệ thống máy ghi.

5.4. Máy nghiền tinh, ví dụ như cối xay cà phê.

5.5. Máy ly tâm, thích hợp để sử dụng với các ống nghiệm (5.6) và có thể đạt được gia tốc hướng tâm 5 000 g.

5.6. Ống nghiệm polypropylen, dung tích 6 ml.

5.7. Nồi cách thủy, hoặc các thiết bị gia nhiệt khác, có thể duy trì ở 75 °C ± 1 °C.

5.8. Bông thủy tinh.

5.9. Pipet Pasteur, dài 150 mm và có giá đỡ thích hợp hoặc một vài dụng cụ thích hợp khác.

6. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 9609 (ISO 5500)6).

7. Chuẩn bị mẫu thử

Giảm mẫu phòng thử nghiệm theo TCVN 9610 (ISO 5502) để thu được kích cỡ yêu cầu của mẫu thử nghiệm. Nghiền mẫu nếu cần.

Lấy một mẫu từ mẫu này và xác định hàm lượng chất bay hơi và hàm lượng ẩm theo TCVN 4801 (ISO 771).

Nếu kết quả nhỏ hơn 10 % (khối lượng), giá trị này sẽ được sử dụng để tính toán (9.1). Ngay sau đó xác định hàm lượng glucosinolat (Điều 8) sử dụng mẫu thử nghiệm không được xử lý thêm.

Nếu độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi vượt quá 10 % (khối lượng), thì làm khô mẫu thử nghiệm bằng dòng khí ở khoảng 45 °C, sau đó xác định lại hàm lượng. Tiếp tục quy trình này cho đến khi hàm lượng ẩm và chất bay hơi thu được nhỏ hơn 10 % (khối lượng). Giá trị cuối cùng được sử dụng để tính kết quả. Xác định ngay hàm lượng glucosinolat (Điều 8) sử dụng các phần mẫu thử đã sấy khô.

8. Cách tiến hành

CHÚ THÍCH 3 Nếu cần kiểm tra xem có đáp ứng các yêu cầu về độ lặp lại, thực hiện hai phép xác định riêng rẽ theo 8.1 đến 8.4 và 8.6 trong các điều kiện lặp lại.

8.1. Phần mẫu thử

Cân 100 mg phần mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 7), chính xác đến 0,1 mg, cho vào hai ống nghiệm (5.6) ghi nhãn A và B.

8.2. Chiết glucosinolat

8.2.1. Đặt các ống nghiệm trong nồi cách thủy (5.7) ở 75 °C và để trong 1 min. Thêm 2 ml dung dịch metanol đang sôi (4.1) và sau đó thêm ngay:

– vào ống nghiệm A 200 μl dung dịch chuẩn nội 5 mmol/l (A.1.1); và

– vào ống nghiệm B 200 μl dung dịch chuẩn nội 20 mmol/l (A.1.2).

CHÚ THÍCH 4 Xem 4.5 về việc sử dụng dung dịch chuẩn nội thay thế.

8.2.2. Tiếp tục gia nhiệt ở 75 °C thêm 10 min, lắc ống nghiệm sau từng khoảng thời gian nhất định. Trộn các lượng chứa trong mỗi ống nghiệm và sau đó ly tâm ở 5000 g trong 3 min. Chuyển phần dịch lỏng phía trên trong mỗi ống nghiệm vào hai ống nghiệm khác (5.6) được dán nhãn A’ và B’.

8.2.3. Thêm 2 ml metanol đang sôi (4.1) vào từng ống nghiệm A và B có chứa cặn rắn và đun nóng lại trong nồi cách thủy (5.7) đặt ở 75 °C trong 10 min, lắc ống nghiệm sau từng khoảng thời gian nhất định.

Ly tâm trong 3 min và sau đó chuyển phần dịch lỏng phía trên ống nghiệm A và B tương ứng vào ống nghiệm A’ và B’ có chứa phần dịch lỏng thu được trong 8.2.2.

8.2.4. Điều chỉnh thể tích của các dịch chiết hỗn hợp trong ống nghiệm A’ và B’ đến khoảng 5 ml bằng nước và trộn.

Nếu bảo quản ở nơi tối trong tủ lạnh đông ở – 18 °C, các dịch chiết này có thể giữ được 2 tuần.

8.3. Chuẩn bị cột trao đổi ion

Cắt một số pipet Pasteur (5.9) theo yêu cầu, ví dụ hai pipet mỗi mẫu, sao cho có được thể tích 1,2 ml trên từng pipet và nút bông thủy tinh (5.8) trên cổ của từng pipet. Đặt pipet thẳng đứng.

Chuyển 0,5 ml huyền phù đã trộn kỹ của resin trao đổi ion (4.7.2) vào từng pipet, để lắng và ráo.

Rửa pipet bằng 2 ml imidazol format (4.4) và sau đó rửa hai lần, mỗi lần dùng 1 ml nước.

8.4. Tinh sạch và khử sulfat

8.4.1. Thực hiện các thao tác đối với từng dịch chiết hỗn hợp.

8.4.2. Chuyển 1 ml dịch chiết (8.2.4) vào cột đã chuẩn bị (8.3) không làm đảo trộn bề mặt resin và để ráo. Thêm hai lần, mỗi lần 1 ml đệm natri axetat (4.2), để cho đệm ráo sau mỗi lần thêm.

8.4.3. Thêm 75 μl dung dịch sulfataza đã pha loãng, đã tinh sạch (4.8) vào cột. Để qua đêm ở nhiệt độ môi trường.

8.4.4. Đặt ống nghiệm (5.6) dưới cột để thu dịch rửa giải.

Rửa giải desulfoglucosinolate thu được hai lần, mỗi lần 1 ml nước, để ráo nước sau mỗi lần thêm.

8.4.5. Trộn kỹ dịch rửa giải. Nếu không phân tích sắc ký ngay thì dịch rửa giải có thể bảo quản được một tuần ở nơi tối trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

8.5. Phép thử trắng

Nếu cần (xem 9.3), thực hiện phép thử trắng sử dụng cùng quy trình trên phần mẫu thử được lấy từ cùng một mẫu thử nhưng không dùng dung dịch chuẩn nội sinigrin để phát hiện và định lượng sự có mặt của sinigrin trong phần mẫu thử.

8.6. Phương pháp sắc ký

8.6.1. Điều chỉnh thiết bị

Điều chỉnh điều kiện sắc ký của máy (5.1) như sau:

– tốc độ dòng của pha động (4.6): phụ thuộc vào bản chất của cột (xem 8.6.2) và thường là 1 ml/min;

– nhiệt độ cột (5.2): 30 °C;

– bước sóng phát hiện: 229 nm.

8.6.2. Phép xác định

Bơm vào máy sắc ký không quá 50 μl dung dịch desulfoglucosinolat thu được trong 8.4.4, vận hành theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất đối với các thiết bị.

Sử dụng rửa giải gradient thích hợp với cột sử dụng.

CHÚ THÍCH

5. Các rửa giải gradient sau đây được đưa ra làm ví dụ.

a) Đối với cột Lichrosorb RP18, ≤ 5 μm (150 mm x 4.6 mm):

– 100 % dung môi A (4.6.1) trong 1 min.

– rửa giải gradient tuyến tính đến 20 min cho đến khi thu được 0 % dung môi A và 100 % dung môi B (4.6.2)

– rửa giải gradient tuyến tính đến 5 min cho đến khi thu được 100 % dung môi A và 0 % dung môi B.

– 100 % dung môi A trong 5 min để đạt được sự cân bằng.

b) Đối với cột Lichrosorb RP8, ≤ 5 μm (125 mm x 4 mm):

– 100 % dung môi A đến 2 min 30 s.

– rửa giải gradient tuyến tính đến 18 min cho đến khi thu được 0 % dung môi A và 100 % dung môi B;

– 100 % dung môi B trong 5 min;

– rửa giải gradient tuyến tính đến 2 min cho đến khi thu được 100 % dung môi A và 0 % dung môi B:

– tiếp tục thêm 5 min nữa để đạt được sự cân bằng.

6. Các chế độ gradient có thể được điều chỉnh để phân tách tối ưu theo các cột được sử dụng.

8.6.3. Kiểm tra sắc ký đồ

Chỉ đưa vào tính toán các pic có diện tích lớn hơn 1 % của tổng diện tích các pic.

Thứ tự rửa giải các pic với cột loại C₁₈ và rửa giải gradient thích hợp (xem ví dụ đưa ra trong 8.6.2) được đưa ra trong Hình 1.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Tính hàm lượng của từng glucosinolat

Hàm lượng của từng glucosinolat, biểu thị bằng micromol trên gam chất khô của sản phẩm, theo công thức:

Trong đó:

A_g là diện tích pic của desulfoglucosinolat cần xác định, tính bằng đơn vị tích phân;

A_s là diện tích pic của chất chuẩn nội được sử dụng (desulfosinigrin hoặcdesulfoglucotropaeolin), tính bằng đơn vị tích phân;

K_g là hệ số đáp ứng của desulfoglucosinolat được nghiên cứu (9.2);

K_s là hệ số đáp ứng của chất chuẩn nội được sử dụng (desulfosinigrin hoặc desufoglucotropaeolin);

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

n là lượng chất chuẩn nội được thêm vào ống nghiệm trong 8.2 (sinigrin hoặc glucotropaeolin), tính bằng micromol (μmol);

w là độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi của mẫu thử, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.

Nếu cần biểu thị kết quả theo độ ẩm và hàm lượng chất dễ bay hơi w_s [ví dụ w_s = 9 % (khối lượng)], thì nhận kết quả thu được theo chất khô (như trên) với:

9.2. Hệ số đáp ứng

Phải sử dụng các hệ số đáp ứng sau:

CHÚ THÍCH 7 Các hệ số đáp ứng này được xác định bằng thực nghiệm và được thống nhất bằng sự thỏa thuận giữa các phòng thử nghiệm khác nhau tham gia vào thử nghiệm; chúng có thể cần được bổ sung hoặc sửa đổi đúng trình tự.

9.3. Tính hàm lượng glucosinolat tổng số

Hàm lượng glucosinolat tổng số, biểu thị bằng micromol trên gam chất khô của sản phẩm, bằng tổng hàm lượng của từng glucosinolat (với diện tích pic tương ứng lớn hơn 1 % của tổng diện tích các pic).

Nếu chênh lệch giữa kết quả của hàm lượng glucosinolat tổng số sử dụng cả hai nồng độ đáp ứng các yêu cầu về độ lặp lại (xem 10.1), chất chuẩn nội không bị nhiễm bẩn. Trong trường hợp này, lấy kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định.

Nếu các yêu cầu về độ lặp lại không được đáp ứng, lặp lại quá trình trên hai phần mẫu thử khác nhau và thực hiện phép thử trắng, (8.5) không dùng dung dịch chuẩn nội. Diện tíchchất nhiễm bẩn được loại trừ từ diện tích chất chuẩn nội để đưa ra diện tích đúng của chất chuẩn nội được sử dụng theo 9.1. Lấy kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định.

Glucotropaeolin (A.2) có thể được sử dụng như là dung dịch chất chuẩn nội theo 8.2.1.

10. Độ chụm

Chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng để xác định độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B.

10.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 10 % trung bình cộng của hai kết quả với giá trị tối thiểu 1 μmol/g.

10.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 20 % trung bình cộng của hai kết quả với giá trị tối thiểu 2 μmol/g.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;

– phương pháp thử đã sử dụng;

– kết quả thử nghiệm thu được;

– kết quả cuối cùng thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại.

Báo cáo thử nghiệm cũng phải đề cập mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

Hình 1 – Ví dụ về sắc ký đồ điển hình

PHỤ LỤC A

(quy định)

Chuẩn bị thuốc thử

A.1. Sinigrin ngậm một phân tử nước

A.1.1. Sinigrin ngậm một phân tử nước, dung dịch 5 mmol/l

Hòa tan trong nước 207,7 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc 6 tháng trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

A.1.2. Sinigrin ngậm một phân tử nước, dung dịch 20 mmol/l

Hòa tan trong nước 831,0 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc 6 tháng trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

A.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng một hoặc một số trong ba phép thử sau:

– phân tích HPLC sử dụng phương pháp quy định trong TCVN 10413-1 (ISO 9167-1);

– phân tích sinigrin bằng HPLC (kỹ thuật cặp ion)

– phân tích sinigrin đã silyl hóa và khử sulfat bằng sắc ký khí.

Đối với từng phép thử, sắc ký đồ chỉ có một pic chính chiếm ít nhất 98 % diện tích tổng các píc.

Xác nhận độ tinh khiết bằng cách định lượng glucose tách ra sau khi thủy phân với myrosinase (thioglucosit glucohydrolase; EC 3.2.3.1). Đo glucose bằng phương pháp enzym sử dụng các bộ thử có bán sẵn trên thị trường. Đưa vào tính toán glucose tự do hiện có. Chất này được xác định tương tự nhưng không bổ sung myrosinase. Nồng độ phân tử của glucose tách ra đạt ít nhất bằng 98 % nồng độ phân tử của dung dịch sinigrin đã kiểm tra.

A.2. Glucotropaeolin

CHÚ THÍCH 8 Glucotropaeolin thường khó phân tách ra khỏi các glucosinolat tự nhiên cóhàm lượng thấp.

A.2.1. Glucotropaeolin, dung dịch 5 mmol/l

Hòa tan trong nước 223,8 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc thời gian 6 tháng trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

A.2.2. Glucotropaeolin, dung dịch 20 mmol/l

Hòa tan trong nước 895,0 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc thời gian 6 tháng trong tủ lạnh đông ở -18 °C.

A.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết theo quy trình quy định trong A.1.3.

A.2.4. Hệ số đáp ứng

Xác nhận lại các hệ số đáp ứng của glucotropaeolin, so sánh với sinigrin, tương ứng với các hệ số đáp ứng được đưa ra trong 9.2.

A.3. Sulfatase

A.3.1. Chuẩn bị cột trao đổi ion

Cắt 7 cm phía trên cổ bình 5 pipet Pasteur (5.9) và nút bông thủy tinh (5.8) vào cổ. Đặt pipet thẳng đứng và thêm vào từng lượng vừa đủ resin trao đổi ion (4.7.1), khi nước chảy hết thì thu lấy 500 μl thể tích resin.

Rót 1 ml dung dịch imidazole format (4.4) vào từng pipet và rửa hai lần, mỗi lần 1 ml nước.

A.3.2. Tinh sạch

Cân 25 mg sulfatase loại Helix pomatia typ H1 (4.8), chính xác đến 0,1 mg. Hòa tan trong 2,5 ml nước và chuyển 500 μl dung dịch này vào từng cột đã chuẩn bị trong A.3.1. Rửa từng cột với 1.5 ml nước và loại bỏ dịch rửa giải. Sau đó thêm 1,5 ml dung dịch natri axetat 0,2 mol/l (4.3) và thu dịch rửa giải từ năm cột vào ống nghiệm.

Cô đặc dịch rửa giải bằng cách lọc, sử dụng bộ Iọc nhúng chìm7) cho đến khi thu được khoảng 100 μl dịch lỏng (không cho sulfatase có khối lượng phân tử cao hơn 5 000 đi qua). Thêm 2,5 ml nước và cô đặc thêm một lần nữa bằng cách lọc cho đến khi còn lại khoảng 100 μl dịch lỏng. Pha loãng đến 2,5 ml bằng nước và bảo quản sulfatase đã tinh sạch trong tủ lạnh  ở -18 °C (với một lượng nhỏ cho phép rã đông một lượng cần thiết để sử dụng ngay).

A.3.3. Kiểm tra hoạt độ sulfatase

A.3.3.1. Chuẩn bị dung dịch sinigrin 0,15 mmol/l, được bổ sung đệm đến pH 5,8.

Chuẩn bị ba dung dịch như sau:

a) chuyển 1 ml axit axetic vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và pha loãng bằng nước đến vạch;

b) chuyển 1 ml etylen diamin vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và pha loãng bằng nước đến vạch;

c) trộn 73 ml dung dịch a) với 40 ml dung dịch b) và sử dụng dung dịch a) hoặc dung dịch b) để chỉnh hỗn hợp đến pH 5,8 là thích hợp.

Rót 3 ml dung dịch sinigrin 5 mmol/l (A.1.1) vào bình định mức một vạch dung tích 100 ml và pha loãng bằng dung dịch c) đến vạch.

A.3.3.2. Kiểm tra hoạt độ

Dùng pipet chuyển 2 ml dung dịch sinigrin đã bổ sung đệm (A.3.3.1) vào cuvet đo và cuvet so sánh của máy đo phổ hai chùm tia (5.3), được chỉnh đến bước sóng 228 nm với nhiệt độ cuvet là 30 °C. Ở thời gian t = 0, thêm 50 μl sulfatase đã tinh sạch (A.3.2) vào cuvet đo và bật máy ghi ngay. Dừng máy ghi khi không có sự chênh lệch độ hấp thụ (A_e). Dựng đường tiếp tuyến với điểm t = 0 và đo gradient  DA/Dt.

Đơn vị hoạt độ của sulfatase tương ứng với nồng độ 1μmol/min của sinigrin desulfat tạo thành ở 30 °C và pH 5,8.

Hoạt độ của dung dịch đã kiểm tra, được biểu thị bằng đơn vị hoạt độ trên mililit dung dịch sulfatase, theo công thức:

Trong đó:

DA/Dt  là gradient của đường tiếp tuyến tại điểm t = 0, tính bằng đơn vị độ hấp thụ trên phút;

V  là thể tích môi trường phản ứng (ví dụ: 2,05 x 10^–3 lít), tính bằng lít (I);

De (khoảng 1 500 l.mol^-1.cm^–1) là chênh lệch giữa hệ số tắt phân tử của sinigrin và desulfosinigrin ở 228 nm; nghĩa là:

Trong đó:

A_e là chênh lệch giữa độ hấp thụ của sinigrin desulfat ở điểm cân bằng và độ hấp thụ ở thời điểm t = 0;

l là chiều dài đường quang thích hợp, tính bằng centimet (ví dụ 1 cm);

c là nồng độ của sinigrin khử sulfat ở điểm cân bằng, tính bằng mol trên lít (mol/l).

Do đó:

mol/l

Trong đó 0,95 là hiệu suất ở điểm cân bằng của sinigrin khử sulfat.

Ngoài ra, hoạt độ của sulfatase có thể được tính theo công thức sau:

A.3.4. Pha loãng

Dùng pipet chuyển 1 ml sulfatase đã tinh sạch (A.3.2) vào bình định mức một vạch dung tích 10 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

Chia dung dịch thành các lượng nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

PHỤ LỤC B

(tham khảo)

Kết quả phép thử nghiệm liên phòng

Phép thử nghiệm liên phòng thực hiện năm 1992 bởi tổ chức Tiêu chuẩn hóa quốc tế (ISO) đưa ra các kết quả thống kê (được đánh giá theo ISO 57258)) đưa ra trong Bảng B.1. Mười một phòng thử nghiệm tham gia và mỗi phòng thực hiện hai phép xác định trên cùng một mẫu thử. Không có các ngoại lệ.

Bảng B.1 – Xác định hàm lượng glucosinolat trong hạt có dầu