TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-24:2014 VỀ BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 24: BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-24 : 2014

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 24: BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM

Animal disease – Diagnostic procedure – Part 24: Infectious bronchitis disease

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh viêm phế quản truyền nhiễm do vi rút thuộc giống Coronavirus gây ra trên gà.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

2.1. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm là bệnh hô hấp ở gà, do vi rút thuộc giống Coronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Gà nuôi thương phẩm và gà đẻ trứng là những đối tượng bị ảnh hưởng chính của bệnh này.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

3.1. Etanol 70 %.

3.2. Etidi bromua 10 mg/ml.

3.3. Nước tinh khiết không có Nuclease.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

4.1. Cối, chày sứ, kéo, vô trùng;

4.2. Micropipet, có đầu típ các cỡ sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc);

4.3. Đĩa 96 giống, đáy chữ V hoặc chữ U;

4.4. Máy ly tâm, có thể thực hiện ở gia tốc 900g, 8000g;

4.5. Máy PCR;

4.6. Thiết bị điện di (bể điện di, khuôn đúc thạch, lược, máy chiếu UV…);

4.7. Xi ranh, dung tích 1 ml và 5 ml;

4.8. Tăm bông, vô trùng.

5. Cách tiến hành

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1. Đặc điểm dịch tễ

Gà ở mọi lứa tuổi đều có thể bị mắc bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. Mặc dù có nhiều thể bệnh khác nhau, nhưng viêm đường hô hấp là thể chính của bệnh này. Mức độ trầm trọng của bệnh tuỳ thuộc vào lứa tuổi gà mắc bệnh và tình trạng nhiễm khuẩn kế phát, ví dụ: với Mycoplasma gallisepticum.

Gà nhỏ mẫn cảm với bệnh hơn gà lớn và có thể bị chết sau từ 6 đến 7 ngày do nhiễm khuẩn kế phát và kiệt sức, tỷ lệ chết có thể đến 15%. Gà đẻ trứng có biểu hiện giảm đẻ khoảng từ 10 % đến 30 % trong từ 3 tuần đến 4 tuần sau khi nhiễm bệnh.

Bệnh lây truyền qua đường hô hấp do con vật hít phải không khí trong chuồng nuôi đã nhiễm mầm bệnh, qua thức ăn nước uống, dụng cụ chăn nuôi và người chăn nuôi đã mang mầm bệnh. Vi rút có khả năng truyền lây qua trứng.

5.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Gà bị bệnh nói chung có những biểu hiện như thở khó, thở khò khè, vươn cổ lên thở, hắt hơi, kém ăn, xù lông, ở gà đẻ trứng có biểu hiện dừng đẻ hoặc giảm đẻ, vỏ trứng đẻ ra mềm và nhăn nheo. Một số gà chết do bị nhiễm khuẩn kế phát và sức đề kháng giảm.

Nếu gà mắc bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm mà ghép với nhiễm khuẩn Mycoplasma(bệnh gây viêm khớp, bại liệt), thì có phân màu trắng, mào xanh tím, uống nước nhiều. Nếu bị nhiễm kế phát với vi khuẩn thương hàn hoặc E. coli thì gà bị tiêu chảy có phân trắng xanh và loãng.

5.1.3. Bệnh tích

– Viêm tích dịch ở xoang mũi, khí quản.

– Túi khí đục, có thể chứa dịch tiết vàng.

– Viêm phổi

– Thận sưng, nhạt màu, trong ống dẫn niệu chứa tinh thể urat.

– Thoái hóa buồng trứng, vòi dẫn trứng sưng. Đôi khi thấy lòng đỏ trong bụng của gà mắc bệnh do màng trứng bị viêm.

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1. Lấy mẫu

5.2.1.1. Lấy mẫu bệnh phẩm để phát hiện kháng nguyên

Lấy mẫu bệnh phẩm để xét nghiệm cần được thực hiện sớm, ngay khi gà có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Bệnh phẩm bao gồm:

– Dịch đường hô hấp trên của gà còn sống, dùng tăm bông (xem 4.8) để ngoáy dịch

– Phổi được bảo quản trong hộp đựng mẫu bệnh phẩm hoặc trong túi nilon vô trùng.

– Đối với những con bị viêm thận hoặc viêm buồng trứng thì có thể lấy thận hoặc ống dẫn trứng làm mẫu.

Tất cả mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm sớm nhất khi có thể (kèm theo phiếu bệnh phẩm).

5.2.1.2. Lấy mẫu bệnh phẩm để phát hiện kháng thể

Lấy máu gà để chắt huyết thanh. Dùng bơm tiêm (xem 4.7) lấy máu gà kiểm tra, đặt nghiêng, yên tĩnh cho máu đông và tránh dung huyết, sau đó chắt huyết thanh cho xét nghiệm phát hiện kháng thể IB.

Bảo quản mẫu trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm sớm nhất khi có thể (kèm theo phiếu bệnh phẩm).

CHÚ THÍCH: không lấy mẫu huyết thanh của gà đã tiêm phòng vắc xin IB để xét nghiệm kháng thể cho mục đích chẩn đoán bệnh.

5.2.2. Phát hiện và giám định kháng nguyên

5.2.2.1. Xử lý bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng (phổi, thận, ống dẫn trứng): lấy từ 1 g đến 2 g, dùng kéo (xem 4.1) cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ (xem 4.1) vô trùng với dung dịch PBS thành huyễn dịch 10 %, bổ sung 0,1 ml dung dịch kháng khuẩn. Ly tâm với gia tốc 900 g trong 10 min, rồi thu lấy dịch nổi để xét nghiệm vi rút bằng phương pháp RT-PCR.

Bệnh phẩm là máu được giữ ở 4 °C đến 8 °C, chờ đông rồi chắt lấy huyết thanh để chẩn đoán phát hiện kháng thể (xem 5.2.3) bằng phương pháp HI hoặc ELISA.

5.2.2.2. Phương pháp RT-PCR

5.2.2.2.1. Nguyên tắc

Phản ứng RT-PCR dùng để phát hiện ARN của vi rút IB bằng việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn S1 của gen glycoprotein có độ dài khoảng 700 bp. Cặp mồi này có thể phát hiện được nhiều chủng IBV khác nhau. Trình tự đoạn các mồi như sau:

Bảng 1 – Trình tự cặp mồi

5.2.2.2.2. Cách tiến hành

Mẫu bệnh phẩm sau khi được xử lý (xem 5.2.2.1) đem chiết tách ARN, việc chiết tách có thể bằng kít thương mại (xem phụ lục A mục A.1).

a) Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt

Công thức pha hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt có thể được thay đổi cho phù hợp với từng loại mồi và từng loại kít RT-PCR khác nhau (xem A.2 và A.3 phụ lục A).

b) Tiến hành phản ứng

Sau khi chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, đưa mẫu vào máy PCR (4.5) và chạy chương trình (chu trình nhiệt) đã được cài đặt (xem A.3 phụ lục A)

Mỗi một lần chạy phản ứng, ngoài mẫu xét nghiệm, cần có một đối chứng dương và một đối chứng âm. Đối chứng dương là mẫu ARN của vi rút IB đã biết, đối chứng âm là nước tinh khiết không có nuclease (xem 3.3).

c) Điện di và hiển thị sản phẩm PCR

Sau khi chạy phản ứng RT-PCR, tiến hành điện di sản phẩm PCR (xem A.4 phụ lục A)

d) Đọc kết quả

Đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV(xem 4.6) (UV transilliuminator) có bước sóng 590 nm. Các mẫu có hiển thị sản phẩm giống như đối chứng dương và có kích thước 700 bp là âm tính. Mẫu âm tính không có vạch sản phẩm xuất hiện.

Nếu sản phẩm hiện lên mờ hoặc không rõ nét (trường hợp nghi ngờ) thì tiến hành lặp lại phản ứng RT- PCR một lần nữa.

5.2.3. Phát hiện kháng thể

Phản ứng huyết thanh học có ý nghĩa chẩn đoán khi gà mắc bệnh có triệu chứng, bệnh tích nghi IB và chưa tiêm phòng vắc xin IB, hoặc sử dụng để đánh giá kết quả tiêm phòng vắc xin IB.

5.2.3.1. Xử lý bệnh phẩm

Bệnh phẩm là máu sau được xử lý (xem 5.2.2.1) lấy huyết thanh làm phản ứng HI

5.2.3.2. Phương pháp HI

Dùng đĩa ngưng kết 96 giếng (xem 4.3) để làm phản ứng.

a) Cách tiến hành (Xem B.3 phụ lục B)

b) Đọc kết quả

Phản ứng dương tính: có sự ức chế ngưng kết hồng cầu ở hiệu giá pha loãng ≥ 1/16.

Phản ứng âm tính: không có sự ức chế ngưng kết hoặc có sự ức chế ngưng kết ở hiệu giá pha loãng < 1/16.

CHÚ THÍCH: Phương pháp này không đòi hỏi nhiều thiết bị máy móc, thực hiện đơn giản. Tuy nhiên, phương pháp này không phân biệt được kháng thể IB do tiêm phòng vắc xin hay do nhiễm thực địa.

5.2.3.3. Phương pháp ELISA

Có thể sử dụng các kít thương mại đã được cấp phép sử dụng và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất để xét nghiệm kháng thể bệnh IB (tham khảo Phụ lục C).

CHÚ THÍCH: Phương pháp này nhanh, nhạy và dễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể do tiêm phòng vắc xin IB hay kháng thể do nhiễm thực địa.

6. Báo cáo kết quả

Gà được xác định là mắc bệnh viêm phế quản truyền nhiễm khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm và có kết quả xét nghiệm dương tính bằng một trong những phương pháp RT-PCR, HI hoặc ELISA.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Chuẩn bị phản ứng RT-PCR

A.1. Chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm

Chiết tách ARN theo qui trình của kit Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 được thực hiện như sau:

– Nhỏ 200 μl dịch nghiền phủ tạng vào ống ly tâm 1,5 ml cùng với 500 μl Qiagen® buffer RLT có 1 % β-ME, lắc đều trên máy lắc Vortex rồi ly tâm nhẹ;

– Thêm 500 μl etanol 70 % (xem 3.1) vào ống, lắc mạnh bằng máy Vortex rồi ly tâm nhẹ;

– Chuyển toàn bộ dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g (xem 4.4) ở nhiệt độ phòng;

– Cho 700 μl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g, thay ống thu mới vào cột lọc;

– Nhỏ 500 μl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g, thay ống thu mới, lặp lại 2 lằn với dung dịch rửa RPE buffer;

– Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ tối đa, bỏ ống thu;

– Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 μl nước tinh khiết không có Nuclease (xem 3.3) vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu ARN;

– Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi tiến hành RT-PCR. Nếu thực hiện sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ không lớn hơn -20 °C.

A.2. Chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng RT-PCR dùng kít của hãng Invitrogen (Cat. 11732-020).

A.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được cài đặt theo hướng dẫn kèm theo kit Invitrogen (Cat. 11732-020) như sau:

A.4. Điện di và hiển thị sản phẩm PCR

Pha 1,5 g bột agarose (gel) với 100 ml 1xTAE rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 °C đến 60 °C), thêm tiếp 2 μl etidium bromua 10 mg/ml (xem 3.2). Sau đó, đổ vào khay rồi cắm lược. Để gel cứng lại trong vòng 30 min -1 h, rồi rút lược ra.

Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di (xem 4.6) (đến vạch “full level”), đặt khay gel vào vịtrí trong bể điện di. Pha 2 μl đệm tải mẫu (loading dye) với 6 μl 100 bp ladder rồi dùng micropipet (xem 4.2) đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel. Pha 2 μl đệm tải mẫu với 10 μlmẫu (sản phẩm PCR) rồi đưa vào các giếng còn lại của miếng gel. Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 25 min đến 35 min.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng HI

B.1. Dung dịch PBS, pH từ 7,0 đến 7 4, chuẩn bị như sau:

Điều chỉnh pH = 7,2 bằng dung dịch NaOH hoặc dung dịch HCl. Hấp vô trùng ở 121 °Ctrong vòng 20 min. Bảo quản ở 4 °C.

B.2. Cách pha kháng nguyên 4 đơn vị HA

Ví dụ: Hiệu giá kháng nguyên được ghi trên lọ là 1/256 thì 4HA bằng 1/256 x 4 = 1/64

Kháng nguyên pha 4 đơn vị HA cần phải điều chỉnh để phản ứng HI có kết quả chính xác.

Cách pha: Ví dụ: 4HA bằng 1/64.

Pha 4HA gồm 1 phần kháng nguyên và 63 phần nước sinh lý (hoặc PBS).

Kiểm tra kháng nguyên 4 HA đã pha: Tiến hành phản ứng HA nếu kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2 là kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn) là kháng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên là kháng nguyên pha loãng. Dựa vào kết quả đó để bổ sung thêm kháng nguyên hoặc nước sinh lý để có kháng nguyên 4HA chuẩn.

B.3. Cách tiến hành phản ứng HI

– Cho dung dịch PBS (xem phụ lục B mục B.1) vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12, mỗi giếng 25 μl.

– Cho 25 μl huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1.

– Pha loãng huyết thanh: Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 1, hút 25 μl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 μl chuyển sang giếng 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 25 μl đi ở giếng 11.

– Cho kháng nguyên IB chuẩn 4 đơn vị HA (xem B.2 phụ lục B) vào các giếng từ 1 đến 11, mỗi giếng 25 μl.

– Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng.

– Cho 25 μl hồng cầu vào tất cả các giếng, lắc nhẹ 1 min. Giữ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả sau từ 15 min đến 30 min. (xem sơ đồ phản ứng HI bên dưới)

Sơ đồ thực hiện phản ứng HI

CHÚ THÍCH: HT: huyết thanh; KN: Kháng nguyên; HC: Hồng cầu.

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

Phương pháp Elisa phát hiện kháng thể IB

Bước 1: Nguyên liệu trong bộ kít nên để ra nhiệt độ phòng 30 min trước khi làm phản ứng.

Bước 2: Mẫu huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng bằng dung dịch pha loãng mẫu tỷ lệ1:500 trong các ống pha loãng mẫu vô trùng.

Bước 3: Nước rửa (trong bộ kít) được pha loãng 10 lần với nước cất.

Bước 4: Nhỏ 100 μl đối chứng âm chuẩn vào giếng A1 và A2;

Bước 5: Nhỏ 100 μl đối chứng dương chuẩn vào giếng B1 và B2;

Bước 6: Nhỏ 100 μl huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng vào giếng C1 và C2 , D1 và D2, nhỏ lần lượt cho đến hết các mẫu cần kiểm tra (mỗi mẫu hai giếng);

Bước 7: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

Bước 8: Rửa đĩa từ 3 lần đến 5 lần với lượng 350 μl cho mỗi giếng bằng nước rửa đã pha loãng;

Bước 9: Nhỏ 100 μl chất gắn kết vào tất cả các giếng;

Bước 10: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

Bước 11: Lặp lại bước 5;

Bước 12: Nhỏ 100 μl TMB vào tất cả các giếng;

Bước 13: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min;

Bước 14: Nhỏ 100 μl dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng;

Bước 15: Đưa vào máy đọc với giá trị đo ở bước sóng 650 nm và đọc kết quả

Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA

Đọc kết quả: Phản ứng được công nhận khi PCx_TB – NCx_TB ≥ 0,075; NCx_TB ≤ 0,150

Giá trị trung bình đối chứng âm:

Giá trị trung bình đối chứng âm:

Giá trị của mẫu:

– Giá trị S/P của mẫu ≤ 0,2: âm tính

– Giá trị S/P của mẫu > 0,2: dương tính

CHÚ THÍCH:

NC (negative control): đối chứng âm; NCx_TB : đối chứng âm trung bình

PC (positive control): kiểm soát đối chứng dương; PCx_TB : đối chứng dương trung bình

S/P (sample/positive): mẫu/đối chứng dương

TB mẫu: Giá trị trung bình mẫu

x_TB: Giá trị trung bình.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. OIE (2008). Infectious bronchitis. In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (P443-452), Chapter 2.3.2.

[2]. OIE, FAO – avian influenza and Newcastle Disease-A field and Laboratory Manual; llaria Capua.Dennis J.AIexander Editors (P175-176).

[3]. Bộ Nông nghiệp và PTNT – Viện Thú y Quốc gia – Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản JICA (2002). Bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm. Trong Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn vềcác bệnh gia súc ở Việt Nam (trang 164-165).