TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9782:2013 VỀ THỊT – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9782 : 2013

THỊT – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS

Meat – Determination of residues of nitrofuran metabolites (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) by Liquid chromatography mass – Spectrometry LC-MS-MS

Lời nói đầu

TCVN 9782 : 2013 do Trung tâm kiểm tra vệ sinh Thú y TƯ1 – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỊT – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS

Meat – Determination of residues of nitrofuran metabolites (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) by Liquid chromatography mass – Spectrometry LC-MS-MS

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng các chất chuyển hóa của nitrofuran gồm furazolidone (AOZ), furaltadone (AMOZ), nitrofurantoin (AHD) và nitrofurazone (SEM) trong thịt tươi bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS.

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 mg / kg.

2. Nguyên tắc

Dư lượng các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt tươi được thủy phân bằng axit clohydric loãng để thu được mạch nhánh của các chất chất chuyển hóa nhóm nitrofuran gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM. Các mạch nhánh này được dẫn xuất hóa bằng 2-nitrobenzaldehyt để tạo thành NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM. Xác định và định lượng các chất dẫn xuất này bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS.

3. Thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này, chỉ sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết, phân tích và nước cất hai lần đã loại ion.

3.1. Chuẩn 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ), 99,0 %;

3.2. Chuẩn 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ), 99,0 %;

3.3. Chuẩn 1-amino-hydantoin hydroclorit (AHD), 99,0 %;

3.4. Chuẩn Semicarbazit (SEM) hydroclorit;

3.5. Chuẩn nội 1-amino-hydantoin-d₂ hydroclorid (AHD-d₂);

3.6. Chuẩn nội Semicarbazit-¹³C¹⁴N₂ (SEM-¹³C¹⁴N₂);

3.7. Chuẩn nội 3-amino-2- oxazolidinon-d₄ hydroclorit (AOZ-d₄);

3.8. Chuẩn nội 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d₅ (AMOZ-d₅);

3.9. Axit HCI 37%, loại dùng cho phân tích;

3.10. 2-nitrobenzaldehyt (C₇H₅NO₃), loại dùng cho HPLC;

3.11. K₂HPO₄, loại dùng cho phân tích;

3.12. NaOH, loại dùng cho phân tích;

3.13. Ethyl acetate, loại dùng cho HPLC;

3.14. Amonium acetat (NH₄CH₃COO), loại dùng cho phân tích;

3.15. Dimethyl sulfoxit, loại dùng cho HPLC;

3.16. Khí N₂, 99.9%

3.17. N-hexan, loại dùng cho HPLC;

3.18. Ammonium formate;

3.19. Nước tinh khiết, loại dùng cho LC/MS;

3.20. Methanol loại dùng cho LC/MS;

3.21. Dung dịch HCI 1 N trong nước:

Hòa tan 83,4 ml a xít HCI 37 % (3.9) với nước cất hai lần đã loại ion, định mức trong bình định mức 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 6 tháng.

3.22. Dung dịch NaOH 2N trong nước:

Cân 8 g NaOH khan (3.12) vào cốc có mỏ, hòa tan bằng nước cất hai lần đã loại ion và chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất hai lần đã loại ion đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 02 tháng.

3.23. 2-nitrobenzaldehyt 10 mM trong dimethylsulfoxit:

Hòa tan 0,0322 g 2-nitrobenzaldehyt (3.10) vào 20 ml dimethylsulfoxit (3.15). Dung dịch này chuẩn bị hàng ngày.

3.24. Dung dịch amonium acetate 4% trong nước:

Cân 4 g amonium acetate (3.14) vào cốc có mỏ, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 ml bằng nước cất hai lần đã loại ion. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 1 tháng.

3.25. Dung dịch K₂HPO₄ 1N trong nước:

Cân 1,78 g K₂HPO₄ (3.11) vào cốc có mỏ, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần đã loại ion. Chỉnh pH tới 7,4 và chuyển vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước cất hai lần đã loại ion cho tới vạch. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 01 tháng.

3.26. Dung dịch chuẩn gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, AOZ-d₄, AMOZ-d₅, SEM-¹³C¹⁴N₂, AHD- d₂ 1000 mg / ml trong methanol:

Cân 50 mg mỗi loại chuẩn vào các bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (4.8). Hòa tan và định mức đến vạch bằng methanol (3.20) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg / ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20 °C trong 6 tháng.

Hòa tan mỗi loại chuẩn nội đóng trong ampul bằng một thể tích methanol thích hợp để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg / ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20 °C trong 6 tháng.

LƯU Ý:

– Lượng chuẩn mỗi loại phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 mg / ml sau khi tính toán và hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.

– Thể tích methanol thích hợp phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn nội gốc 1000 mg / ml tùy theo quy cách đóng gói của nhà sản xuất.

3.27. Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian AOZ, AMOZ, AHD, SEM 1 mg / l trong methanol:

Lấy 100 mL từ mỗi dung dịch gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM (3.26) cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch với methanol (3.20). Dung dịch này bền ở -20 °C  3 tháng.

3.28. Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian AOZ, AMOZ, AHD, SEM, 100 mg / l trong methanol:

Từ dung dịch chuẩn (3.27) có nồng độ 1 mg / l, lấy 1000 mL cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với methanol (3.20). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở 4 °C trong 1 tuần.

3.29. Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, 10 mg / l trong methanol:

Từ dung dịch chuẩn (3.28) có nồng độ 100 mg / l, lấy 1000mL cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với methanol (3.20). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở 4 °C trong 1 tuần.

3.30. Dung dịch chuẩn nội hỗn hợp trung gian AOZ-d₄, AMOZ-d₅, SEM-¹³C¹⁴N₂, AHD- d₂ 1 mg / I trong methanol:

Từ dung dịch chuẩn nội gốc (3.26) có nồng độ 1000 mg / ml, lấy 100mL từ mỗi dung dịch gốc cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch với methanol (3.20). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20 °C trong 3 tháng.

3.31. Dung dịch chuẩn nội hỗn hợp làm việc AOZ-d₄, AMOZ-d₅, SEM-¹³C¹⁴N₂, AHD- d₂ 100 mg / l trong methanol:

Hút 1000 mL dung dịch chuẩn nội hỗn hợp trung gian AOZ-d₄, AMOZ-d₅, SEM-¹³C¹⁴N₂, AHD- d₂, 1 mg / I (3.30) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng methanol (3.20).

Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở 4 °C trong 1 tuần.

3.32. Dung dịch pha động:

Dung dịch pha động A:

Methanol LC/MS (3.20).

Dung dịch pha động B:

Cân 0,0315 g ammonium formate (3.18) vào cốc có mỏ, hòa tan và chuyển vào bình định mức 1000 ml bằng nước (3.19). Dung dịch này chuẩn bị hàng ngày.

3.33. Dung dịch hòa tan mẫu:

Hòa tan dung dịch pha động B và methanol (3.20) theo tỉ lệ 1:1.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

– Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng;

– Detector MS / MS;

– Máy tính và phần mềm phân tích;

– Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 mm, độ dài của cột là 50 mm;

4.2. Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 r/min;

4.3. Máy lắc ngang, tốc độ 300 r/min;

4.4. Máy lắc vortex, tốc độ 400 r/min;

4.5. Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg;

4.6. Micropipet, dung tích 100 ml, 1000 ml, 5000 ml,

4.7. Ống nghiệm thủy tinh, 10 ml;

4.8. Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml;

4.9. Tủ ấm, có điều chỉnh nhiệt độ;

4.10. Bộ bay hơi Nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ;

4.11. Ống ly tâm, dung tích 15 ml;

4.12. Bộ chiết pha rắn;

4.13. Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.

4.14. Cột chiết pha rắn SPE C18, 200 mg.

5. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này nhưng mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6. Chuẩn bị mẫu

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cân 2.0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm (4.11). Cho vào mỗi ống 20 ml hỗn hợp nội chuẩn nitrofuran 100 mg/1(3.31).

6.2. Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu thịt tươi đã được xác định không nhiễm chất chuyển hóa của nitrofuran. Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử.

6.3. Chuẩn bị mẫu kiểm soát

Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng như mẫu thử nhưng sau khi cân có bổ sung 30 ml hỗn hợp chuẩn nitrofuran 100 mg / l (3.28) vào mẫu. Lắc trong 30 giây (4.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

6.4. Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn

Mẫu thêm chuẩn được chuẩn bị từ mẫu trắng. Cân 2,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 15 ml (4.11); cho dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrofuran 100 mg / I (3.28) hoặc dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrofuran 10 mg / l (3.29) và hỗn hợp chuẩn nội nitrofuran 100 mg / l (3.31) vào các ống nghiệm có chứa mẫu trắng theo bảng 1.

Tiến hành lắc trong 15 giây (4.4), sau đó để yên 15 min trước khi thực hiện các bước tiếp theo.

Bảng 1 – Xây dựng đường chuẩn

7. Tiến hành thử nghiệm

7.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm 4 ml nước (3.19) và 0,5 ml HCI 1N (3.21), 100 ml 2-nitrobenzaldehyt (3.23) vào từng lọ mẫu. Lắc trong 1 min (4.4), ủ 60 °C trong 3h (4.9) hoặc ở 37 °C trong 16 h.

Thêm 0,5 ml K₂HPO₄ 1N (3.25), 0,2 ml NaOH 2N (3.22); Lắc trong 30 giây (4.4);

Thêm 5 ml ethyl acetate (3.13); Lắc trong 1 min (4.4). Sau đó lắc 300 r / min trong 30 min bằng máy lắc ngang (4.3).

Ly tâm mẫu tại 3000 r / min trong 5 min (4.2); Hút hết lớp trên vào ống nghiệm (4.7).

Tiếp tục thêm 5ml ethylacetate (3.13); Lắc trong 1 min (4.4). Sau đó lắc 300 r / min trong 10 min bằng máy lắc ngang (4.3);

Ly tâm mẫu tại 3000 r / min trong 5 min (4.2); Hút lớp trên gộp vào ống nghiệm trên (4.7). Sau đó thổi khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 °C (4.10).

Hòa tan phần cặn bằng 1 ml n-hexan (3.17), 1 ml amonium acetate 4% (3.24); Lắc trong 30 giây (4.4); Ly tâm mẫu tại 3000 r / min trong 5 min (4.2). Hút lớp dưới, sau đó làm sạch mẫu bằng cách qua cột chiết pha rắn.

Gắn các cột làm sạch (4.14) vào bộ chiết pha rắn (4.12). Hoạt hóa cột chiết pha rắn lần lượt bằng 1 ml methanol (3.20), 1 ml nước cất (3.19). Cho dịch chiết của các mẫu qua cột, mỗi mẫu cho vào một cột.

Rửa cột bằng 1 ml nước (3.19), đợi cho nước chảy hết sau đó để khô trong 5 min bằng bơm hút chân không.

Giải hấp bằng 1 ml ethylacetate (3.13), sau đó thổi khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 °C (4.10). Hòa tan phần cặn bằng 250 mL (3.33). Lắc trong 30 giây (4.4), sau đó đưa vào lọ đựng mẫu (4.13).

7.2. Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS

7.2.1. Điều kiện HPLC

– Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 mm, độ dài của cột là 50 mm;

– Nhiệt độ cột theo nhiệt độ phòng;

– Thể tích bơm mẫu: 10 mL;

– Thời gian phân tích: 4 min;

– Tốc độ dòng toàn phần: 0,4 ml / min;

Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2.

Bảng 2 – Chương trình pha động

7.2.2. Điều kiện trên MS

Điều kiện trên MS như sau:

Kiểu ion hóa: ESI (+);

Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150 °C;

Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 °C;

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 I / h;

Tốc độ dòng khí qua khối nón: 30 I / h;

Các điều kiện phân ly MS/MS như sau:

Bảng 3 – Điều kiện phân ly MS/MS

GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định lượng;

7.3. Trình tự bơm mẫu

7.3.1. Bơm dung môi kiểm tra máy, dung dịch hòa tan mẫu (3.27);

7.3.2. Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

7.3.3. Bơm mẫu trắng;

7.3.4. Bơm mẫu kiểm soát;

7.3.5. Bơm mẫu thử.

8. Tính toán và biểu thị kết quả

8.1. Tính hệ số tín hiệu

Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình: 

Trong đó: RF: hệ số tín hiệu;

Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích;

Sp_IS: diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội tương ứng.

8.2. Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu thực được chuẩn bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đó:

– RF: Hệ số tín hiệu, tính theo mục 8.1;

– x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 6.4;

– b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

– a: hệ số góc của đường chuẩn.

Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy R²³0.99.

8.3. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu

Dư lượng chất cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 8.2. Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: là nồng độ chất phân tích có trong mẫu, tính bằng mg / kg;

C_x: là nồng độ chất phân tích đo được suy ra từ đường chuẩn, mg / l;

V: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml;

F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

a: là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

8.4. Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị mg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

– Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm.

– Độ lập lại của phương pháp;

– Kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Determination of the metabolites of nitrofuran antibacterial drugs in chicken tissue by Liquid Chromatography – Electrospray ionization Mass Spectrometry (LC-ESI-MS). Aglilent Technologies, 2003.

[2] Decision 2002/657/ CE.