TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9656:2013 (ISO 8432 : 1987) VỀ TINH DẦU – PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – PHƯƠNG PHÁP CHUNG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9656 : 2013

ISO 8432 : 1987

TINH DẦU – PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – PHƯƠNG PHÁP CHUNG

Essential oils – Analysis by high performance liquid chromatography – General method

Lời nói đầu

TCVN 9656:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 8432:1987;

TCVN 9656:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TINH DẦU – PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – PHƯƠNG PHÁP CHUNG

Essential oils – Analysis by high performance liquid chromatography – General method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chung để xác định hàm lượng của hợp chất đặc trưng và/hoặc nghiên cứu các đặc tính của tinh dầu bằng phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8443 (ISO 356), Tinh dầu – Chuẩn bị mẫu thử.

3. Nguyên tắc

Sắc ký lỏng là phương pháp tách dựa trên nguyên tắc hấp thụ, phân bố, trao đổi và/hoặc lọc ion. Phương pháp này cho phép phân tích một lượng nhỏ tinh dầu thơm hoặc nguyên liệu thô khác, dùng trong công nghiệp sản xuất nước hoa, trên cột sắc ký được nhồi thích hợp và trong các điều kiện thích hợp, có thể nhận biết các thành phần khác nhau và định lượng các hợp chất đặc trưng bằng cách đo diện tích hoặc chiều cao pic của chúng.

4. Thuốc thử và vật liệu thử

4.1. Chất chuẩn, tương ứng với hợp chất cần xác định hoặc cần phát hiện. Chất chuẩn được quy định trong từng tiêu chuẩn cụ thể. Chất chuẩn phải mới được tinh sạch.

4.2. Chất chuẩn nội hoặc chất chuẩn ngoại

Chất chuẩn nội hoặc chất chuẩn ngoại được quy định trong từng tiêu chuẩn tương ứng; chúng cần được rửa giải càng gần với thành phần cần xác định càng tốt và pic của chúng không được chồng lên pic của bất kỳ thành phần nào của tinh dầu, có thể phát hiện được bằng hệ thống detector được sử dụng.

4.3. Pha động

Thành phần của pha động có thể ổn định trong quá trình vận hành (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi phù hợp với chương trình đã quy định (rửa giải gradient). Pha động được quy định trong từng tiêu chuẩn tương ứng.

4.4. Dung môi rửa giải

Bản chất và chất lượng của dung môi được chọn theo mẫu cần phân tích và theo bản chất của cột và detector được sử dụng. Dung dịch không được có phần tử rắn nhỏ hơn 0,5 mm.

4.5. Khí

Nếu hệ thống bơm yêu cầu sử dụng khí thì khí đó phải là khí trơ. Có thể sử dụng khí heli, nitơ hoặc agon.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Hệ thống tách

5.1.1. Máy sắc ký.

5.1.2. Hệ thống bơm hoặc hệ thống bất kỳ khác, cho phép duy trì tốc độ dòng không đổi hoặc theo chương trình đã được cài đặt trước.

5.1.3. Hệ thống cấp dung môi.

5.1.4. Hệ thống khử khí dung môi.

5.1.5. Hệ thống detector thích hợp, có thể xác định được các hợp chất có mặt trong mẫu.

5.2. Bộ ghi và bộ tích phân (tùy chọn), tính năng của chúng phải tương thích với các bộ phận khác của thiết bị.

5.3. Cột, được làm bằng vật liệu trơ (ví dụ: thủy tinh, thép không gỉ) có các đặc tính cơ học có thể chịu được áp lực.

Bản chất và kích cỡ hạt của pha tĩnh được quy định trong từng tiêu chuẩn tương ứng.

Nhiệt độ cột phải được ổn định hoặc được cài đặt chương trình trước.

6. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử xem TCVN 8443 (ISO 356).

Nếu mẫu thử được bơm cần chuẩn bị đặc biệt thì phải chỉ rõ trong tiêu chuẩn tương ứng.

7. Điều kiện vận hành

7.1. Nhiệt độ

Nếu nhiệt độ khác với nhiệt độ môi trường thì phải quy định trong từng tiêu chuẩn tương ứng.

7.2. Tốc độ dòng của dung môi rửa giải

Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho tách được các thành phần cần xác định.

8. Tính năng của cột

8.1. Phép thử độ trơ hóa học

Đảm bảo rằng các sản phẩm cần xác định không bị hư hỏng.

8.2. Hiệu quả của cột

Xác định số đĩa lý thuyết (N), từ pic chuẩn nội được quy định trong tiêu chuẩn tương ứng và việc sử dụng dung môi cũng được quy định ở nhiệt độ đẳng nhiệt và trong các điều kiện đẳng dòng theo công thức sau:

N = 5,54

Trong đó:

d_r là khoảng cách đo được trên đường nền từ điểm bơm mẫu đến điểm uốn của pic cần xác định, tính bằng milimet (mm);

b_0,5­ là độ rộng tại nửa chiều cao pic, tính bằng milimet (mm).

8.3. Độ phân giải

Tính hệ số phân giải, R, của hai pic gần nhau I và II, theo công thức sau:

R = 

Trong đó:

d_r(I) là khoảng thời gian lưu của pic I;

d_r(II) là khoảng thời gian lưu của pic II;

b_0,5(I)_­ là độ rộng ở nửa chiều cao pic I;

b_0,5(II)_­ là độ rộng ở nửa chiều cao pic II.

(Xem Hình 1).

Hình 1 – Phép tính hệ số phân giải

9. Phương pháp xác định

9.1. Điều kiện chung

Ghi lại sắc đồ theo quy định trong tiêu chuẩn có liên quan.

Đối với phép xác định các thành phần đặc trưng cụ thể thì trong tiêu chuẩn tương ứng có thể quy định việc vận hành trong điều kiện đẳng dòng hoặc vận hành theo rửa giải gradient.

Trong trường hợp đó, tốc độ dòng phải được điều chỉnh sao cho việc tách thu được như quy định trong tiêu chuẩn tương ứng.

Sau khi ổn định các điều kiện vận hành, bơm một lượng thích hợp của phần mẫu thử.

Từ đó, thu được sắc đồ “A”.

9.2. Phương pháp nội chuẩn

Ghi lại sắc đồ của tinh dầu và sắc đồ của chất chuẩn nội (4.2), trong cùng các điều kiện thao tác.

Kiểm tra trên sắc đồ để chắc chắn rằng các mẫu cần xác định đã tách khỏi các thành phần của tinh dầu, và chất chuẩn nội không gây nhiễu cho bất kỳ thành phần nào khác của tinh dầu.

9.2.1. Xác định hệ số đáp ứng

Nếu để định lượng thì hệ số đáp ứng của thành phần tương ứng với chất chuẩn nội cần được xác định, cân một lượng thích hợp chất chuẩn nội (4.2) và chất chuẩn (4.1) sao cho thu được diện tích pic tương ứng xấp xỉ nhau.

Dung môi cần sử dụng để pha loãng được quy định trong tiêu chuẩn tương ứng.

Sau khi ổn định toàn bộ hệ thống, bơm một lượng thích hợp của hỗn hợp này và tiến hành phân tích dưới các điều kiện quy định nêu trong 9.1. Thu được sắc đồ “B”.

Tính hệ số đáp ứng, K, theo công thức sau:

K = 

Trong đó:

A_R là diện tích pic tương ứng với chất chuẩn có hệ số đáp ứng cần tính, tính bằng đơn vị tích phân;

A_E là diện tích pic tương ứng với chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị tích phân;

m_R là khối lượng của chất chuẩn, tính bằng miligam (mg);

m_E là khối lượng của chất chuẩn nội, tính bằng miligam (mg);

9.2.2. Xác định

Nếu trong tiêu chuẩn tương ứng, có quy định việc sử dụng chất chuẩn nội, thì chuẩn bị hỗn hợp bằng cách cân các lượng thích hợp tinh dầu và chất chuẩn nội, chính xác đến 0,1 mg. Chọn lượng chất chuẩn nội sao cho diện tích pic của hợp chất cần xác định và diện tích của chất chuẩn nội là xấp xỉ nhau.

Sau khi ổn định toàn bộ hệ thống, bơm một lượng thích hợp của hỗn hợp và tiến hành phân tích dưới các điều kiện quy định nêu trong 9.1. Thu được sắc đồ “C”.

9.3. Phương pháp thêm chuẩn

Nếu không thể sử dụng phương pháp chuẩn nội để xác định thì sử dụng phương pháp thêm chuẩn.

Trong trường hợp này, bơm một lượng thích hợp tinh dầu trong đó X là hợp chất cần xác định và Y là hợp chất cho pic gần với pic trên sắc đồ “D” thu được.

Sau đó chuẩn bị bằng cách cân hỗn hợp của m gam mẫu thử và m_x gam chất chuẩn (4.1) tương ứng với hợp chất X cần xác định, chính xác đến 0,1 mg.

Bơm một lượng thích hợp hỗn hợp này. Thu được sắc đồ “E”.

9.4. Phương pháp ngoại chuẩn

Nếu không thể sử dụng được các phương pháp quy định trong 9.2 và 9.3 thì sử dụng phương pháp ngoại chuẩn.

Phương pháp này chỉ có thể áp dụng nếu thiết bị có hệ thống bơm có các thể tích bơm bằng nhau (ví dụ: van bơm).

Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ chất chuẩn tăng dần. Bơm lần lượt cùng một lượng của từng dung dịch khác nhau này. Vẽ đồ thị diện tích pic theo nồng độ chất chuẩn của các dung dịch khác nhau. Đồ thị thu được cho thấy diện tích pic của chất chuẩn tương ứng với nồng độ của các dung dịch khác nhau.

Bơm cùng một lượng tinh dầu trong đó “Z” là hợp chất cần xác định. Đo diện tích pic theo “Z”. Từ diện tích đã cho theo “Z”, ghi lại nồng độ “Z” từ đồ thị.

10. Biểu thị kết quả

10.1. Phương pháp nội chuẩn

Tính hàm lượng của hợp chất cần xác định, c_x, bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau:

x 100

Trong đó:

A_X là diện tích pic tương ứng với hợp chất cần xác định, tính bằng đơn vị tích phân;

A_E là diện tích pic tương ứng với chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị tích phân;

m_X là khối lượng của tinh dầu, tính bằng miligam (mg);

m_E là khối lượng của chất chuẩn nội, tính bằng miligam (mg);

K là hệ số đáp ứng đối với hợp chất cần xác định tương ứng với chất chuẩn nội.

10.2. Phương pháp thêm chuẩn

Tính hàm lượng của hợp chất cần xác định, c_x, tính theo phần trăm khối lượng, theo công thức:

x 100 (r’ > r)

Trong đó:

m_R là khối lượng của chất chuẩn (4.1), tính bằng gam (g);

m là khối lượng của tinh dầu, tính bằng gam (g);

và

r = 

Trong đó:

A_X là diện tích pic tương ứng với hợp chất X trên sắc đồ “D”;

A_Y là diện tích pic tương ứng với hợp chất Y gần với X trên sắc đồ “D”;

và

r’ = 

Trong đó:

A’_X là diện tích pic tương ứng với hợp chất X trên sắc đồ “E”;

A’_Y là diện tích pic tương ứng với hợp chất Y gần với X trên sắc đồ “E”.

10.3. Kết quả và độ lặp lại

Lấy các kết quả đối với hệ số đáp ứng K và hàm lượng c_x của hợp chất cần xác định, là giá trị trung bình của vài phép xác định (ít nhất là ba phép xác định) được tiến hành trên cùng mẫu thử. Các giá trị khác nhau này không được khác với giá trị trung bình của chúng bằng một tỷ lệ phần trăm nhất định. Giá trị phần trăm này và số phép xác định được quy định trong tiêu chuẩn tương ứng.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải gồm các thông tin sau:

a) hệ thống thiết bị;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) các đặc tính của cột (vật liệu, kích thước, chất nhồi, pha tĩnh);

d) các đặc tính của detector (tùy chọn) và các điều kiện vận hành;

e) các đặc tính của pha động (tốc độ và bản chất);

f) nhận biết mẫu thử (lượng được bơm và dung dịch pha loãng cuối cùng);

g) kết quả thu được.