TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9523:2012 (EN 15890:2010) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH PATULIN TRONG NƯỚC QUẢ VÀ PUREE QUẢ DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH PHÂN ĐOẠN LỎNG/LỎNG, CHIẾT PHA RẮN VÀ DETECTOR UV

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9523:2012

EN 15890:2010

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH PATULIN TRONG NƯỚC QUẢ VÀ PUREE QUẢ DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH PHÂN ĐOẠN LỎNG/LỎNG, CHIẾT PHA RẮN VÀ DETECTOR UV

Foodstuffs – Determination of patulin in fruit juice and fruit based puree for infants and young children – HPLC method with liquid/liquid partition cleanup and solid phase extraction and UV detection

Lời nói đầu

TCVN 9523:2012 hoàn toàn tương đương với EN 15890:2010;

TCVN 9523:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH PATULIN TRONG NƯỚC QUẢ VÀ PUREE QUẢ DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH PHÂN ĐOẠN LỎNG/LỎNG, CHIẾT PHA RẮN VÀ DETECTOR UV

Foodstuffs – Determination of patulin in fruit juice and fruit based puree for infants and young children – HPLC method with liquid/liquid partition cleanup and solid phase extraction and UV detection

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định patulin trong nước quả và puree quả, ví dụ puree trong thực phẩm dành cho trẻ nhỏ, sử dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao có detector UV (HPLC-UV). Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trên các mẫu nhiễm tự nhiên và các mẫu thêm chuẩn để xác định patulin trong nước táo ở các mức từ 3,0 mg/kg đến 15,5 mg/kg và trong puree quả dành cho trẻ nhỏ ở các mức từ 3,4 mg/kg đến 17,9 mg/kg.

Puree quả dành cho trẻ nhỏ được sử dụng trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm này được bán sẵn trên thị trường Châu Âu có chứa hỗn hợp các thành phần sau đây: quả việt quất, táo, chuối, chanh, bánh quy, xirô lúa mì, sữa bột nguyên chất và dầu thực vật. Danh mục chi tiết, bao gồm các thành phần cụ thể của từng sản phẩm được sử dụng trong nghiên cứu này được nêu trong Tài liệu tham khảo [1].

Thông tin thêm về việc đánh giá xác nhận, xem Điều 9 và Phụ lục B.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Patulin được chiết ra khỏi nước táo, hoặc puree quả, bằng hỗn hợp etyl-axetat và hexan khi có mặt của natri sulfat và natri hydro cacbonat. Phần dịch chiết được tính sạch bằng chiết pha rắn rồi cho bay hơi. Cặn được hòa tan lại trong nước có pH = 4, patulin được tách bằng HPLC pha đảo [(RP)-HPLC] và hàm lượng patulin được xác định bằng detector UV.

4. Thuốc thử

4.1 Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đáp ứng yêu cầu loại 1 quy định trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) trừ khi có các quy định khác. Các dung môi phải đạt chất lượng để phân tích HPLC, trừ khi có các quy định khác. Có thể sử dụng các loại dung dịch bán sẵn có các đặc tính tương tự với thuốc thử được liệt kê dưới đây.

4.2 Axit percloric, w(HClO₄) ≥ 60% khối lượng trong nước.

4.3 Cát, cỡ hạt 50 mesh đến 70 mesh.

4.4 Cột chiết pha rắn bằng silicagel (SPE) (500 mg SiO₂).

4.5 Natri sulfat khan, Na₂SO₄

4.6 Natri hydro cacbonat, NaHCO₃

4.7 Axit axetic băng, w(CH₃COOH) ≈ 98% trong nước.

4.8 Nước có pH = 4

Chỉnh pH của nước về 4 bằng axit axetic băng (4.7).

4.9 Etanol tuyệt đối, w(CH₃CH₂OH) ≥ 99,7% trong nước.

4.10 Axetonitril

CẢNH BÁO: Axetonitril là chất độc và khi trộn mẫu phải dùng máy nghiền trộn chống nổ đặt trong tủ hút. Sau khi trộn, mẫu phải được lọc bên trong tủ hút.

4.11 Etyl axetat.

4.12 n-Hexan.

4.13 Dung môi chiết

Cho 60 ml etyl axetat (4.11) vào 40 ml n-hexan (4.12).

4.14 Hỗn hợp axit axetic băng và etyl axetat

Cho 3 ml axit axetic băng (4.7) vào 97 ml etyl axetat (4.11).

4.15 Pha động HPLC

Trộn 990 phần thể tích nước với mười phần thể tích axetonitril (4.10) và một phần thể tích axit percloric (4.2). Hàm lượng axetonitril phụ thuộc vào loại mẫu được phân tích và dạng gây nhiễu đặc trưng của chúng sau khi làm sạch (xem Phụ lục A về sắc đồ điển hình) và cột HPLC được chọn để phân tích. Khử khi dung dịch này trước khi sử dụng.

CHÚ THÍCH: Pha động gồm 990 phần thể tích nước với một phần thể tích axit percloric cho thấy đủ để tách patulin ra khỏi các chất gây nhiễu khác [cụ thể khi sử dụng 5-hydroxymetylfurfural kết hợp với cột Synergy® 1) dài 250 mm và đường kính 4,6 mm cỡ hạt 4 mm và độ xốp 8 nm (xem 5.13.4)]

4.16 Patulin

CẢNH BÁO – Patulin bị nghi ngờ là chất gây đột biến và đã được ghi nhận là có các đặc trưng về gây độc miễn dịch và gây độc cho hệ thần kinh. Luôn phải mang găng tay, kính bảo vệ và tất cả các bước chuẩn bị mẫu, chuẩn bị chất chuẩn phải được thực hiện trong tủ hút.

4.17 Dung dịch gốc patulin

Hòa tan 5 mg patulin hoặc lượng chứa trong 1 ống (nếu patulin ở dạng màng) trong etyl axetat (4.11). Chuyển dung dịch này sang bình định mức 25 ml và pha loãng bằng etyl axetat đến vạch để thu được dung dịch có chứa khoảng 200 mg/ml patulin.

Bảo quản dung dịch này trong tủ đông ở khoảng -18⁰C. Khi đã bảo quản quá sáu tuần thì khẳng định nồng độ khối lượng của dung dịch. Trước khi sử dụng, đưa các dung dịch này về nhiệt độ phòng để tránh nước bị lẫn vào do ngưng tụ.

4.18 Dung dịch chuẩn patulin

Cho bay hơi 1 000 ml dung dịch gốc (4.17) đến khô dưới dòng khí nitơ rồi hòa tan ngay trong 20 ml etanol (4.9) để thu được nồng độ khối lượng khoảng 10 mg/ml patulin.

Để xác định chính xác nồng độ khối lượng, ghi lại phổ hấp thụ ở bước sóng từ 250 nm đến 350 nm trong cuvet thạch anh 1 cm có etanol làm chất đối chứng. Xác định bước sóng có độ hấp thụ cực đại. Tính nồng độ khối lượng của patulin, ρ_pat, bằng microgam trên mililit, theo công thức (1):

                                       (1)

Trong đó

A_max      là độ hấp thụ xác định được tại điểm hấp thụ cực đại trên phổ hấp thụ (trong trường hợp này: khoảng 276 nm);

M         là khối lượng mol của patulin (M = 154 g/mol), tính bằng gam trên mol (g/mol);

ε           là hệ số hấp thụ mol của patulin trong etanol, tính bằng mét vuông trên mol (m²/mol), (trong trường hợp này: 1 460 m²/mol, xem [2]);

b          là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).

Bảo quản dung dịch này trong tủ đông ở khoảng -18⁰C. Dung dịch được bảo quản theo cách này bền được trong vài tháng. Trước khi sử dụng, đưa các dung dịch này về nhiệt độ phòng để tránh bị lẫn vào do ngưng tụ. Khi dung dịch đã bảo quản quá sáu tuần thì khẳng định lại nồng độ của dung dịch.

4.19 Dung dịch thêm chuẩn

Đối với phép thực nghiệm thêm chuẩn patulin vào mẫu ở các mức 10 ng/ml  và 25 ng/ml, chuẩn bị dung dịch thêm chuẩn patulin trong nước có pH = 4 (4.8) ở nồng độ khối lượng 200 ng/ml và 500 ng/ml, tương ứng.

Các dung dịch này có thể thu được bằng cách cho bay hơi đến khô các dung dịch chứa 100 ml và 250 ml dung dịch gốc tương ứng (4.17) bằng dòng khí nitơ trong bình định mức 100 ml, rồi hòa tan ngay trong nước có pH = 4 (4.8) để thu được dung dịch có nồng độ khối lượng patulin khoảng 200 ng/ml và 500 ng/ml tương ứng, tùy thuộc vào nồng độ khối lượng chính xác của patulin trong dung dịch gốc. Đảm bảo rằng patulin được hòa tan hết trong nước có pH = 4 trước khi thêm nước đầy đến vạch.

Trong trường hợp dung dịch chuẩn patulin (4.18) có nồng độ khối lượng khác với 10 mg/ml, thì chỉnh các dung dịch thêm chuẩn bằng cách tính các phần dịch lỏng chính xác, có tính đến nồng độ khối lượng thực của dung dịch chuẩn xác định được trong 4.18.

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở 4⁰C. Dung dịch được bảo quản bằng cách này bền được ít nhất tám tuần.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1 Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.2 Pipet phân phối, ví dụ dung tích 5 ml, 1 ml, 200 ml và 50 ml với các đầu tip thích hợp.

5.3 Cân phân tích, có thể cân đến 0,1 mg.

5.4 Máy đo phổ UV, hai chùm tia và ghi được ở bước sóng 250 nm đến 350 nm.

5.5 Cuvet thạch anh, có chiều dài đường quang 1 cm.

5.6 Máy ly tâm, có khả năng hoạt động ở 400 g.

5.7 Ống ly tâm, dung tích 25 ml có nắp vặn.

5.8 Máy lắc cơ học.

5.9 Thiết bị làm bay hơi, có khả năng duy trì ở nhiệt độ 40⁰C, có nguồn cấp nitơ

5.10 Lọ thủy tinh, dung tích 6 ml có nắp vặn.

5.11 Xyranh, kín khí có pittông bằng polytetrafloroetylen (PTFE), thể tích 3 ml đến 5 ml.

5.12 Bộ lọc dạng xyranh dùng một lần, cỡ lỗ 0,2 mm (tùy chọn).

Thử nghiệm từng mẻ sản phẩm trước khi sử dụng, để đảm bảo rằng patulin không bị hấp phụ lên bộ lọc.

5.13 Thiết bị HPLC, gồm có các bộ phận sau:

5.13.1 Hệ thống bơm, hệ thống bơm van có vòng bơm 200 ml.

5.13.2 Bơm đẳng dòng, không xung, có khả năng duy trì tốc độ dòng 1 ml/min.

5.13.3 Detector UV, được gắn với cuvet dòng chảy dùng cho phân tích và được cài đặt ở bước sóng 276 nm.

5.13.4 Cột tách HPLC pha đảo, có khả năng chạy dùng 100 % nước làm pha động, ví dụ pha alkyl phân cực (ví dụ các cột của loại Synergy^® 2), Atlantis^{® 2)} hoặc Luna^{® 2)} hoặc loại tương tự).

Kích thước cột có thể thay đổi tùy theo việc tách pic patulin thu được ra khỏi các pic gây nhiễu như 5-hydroxymetylfurfural (5-HMF). Chiều cao tối đa các vai pic chồng nhau phải nhỏ hơn 10 % của chiều cao pic tối đa. Cần thiết phải điều chỉnh pha động để có được sự phân giải đường nền tốt. Nên sử dụng tiền cột thích hợp.

Cột có chiều dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm và cỡ hạt khoảng 4 mm, có độ xốp 8 nm cho thấy đáp ứng được các yêu cầu khi sử dụng kết hợp với pha động nêu trong Chú thích của 4.15.

5.13.5 Hệ thống phân tích dữ liệu

5.13.6 Van chuyển mạch hoặc bơm HPLC thứ cấp, tùy chọn, để rửa cột phân tích giữa các lần bơm.

6. Cách tiến hành

6.1 Chiết

Cho 2 g cát (4.3), 15 g natri sulfat (4.5), 2 g natri hydro cacbonat (4.6) vào ống ly tâm sạch (5.7) và lắc. Thêm 10 ml (V₁) dung môi chiết (4.13) vào ống đã chuẩn bị và đậy kín. Với cách này, có thể chuẩn bị các ống ly tâm trước khi phân tích.

Cân 10 g mẫu, chính xác đến 0,1 g, chuyển vào ống ly tâm đã chuẩn bị và lắc mạnh bằng tay trong vài giây rồi lắc bằng máy lắc cơ học (5.8) trong 5 min đến 6 min. Sau đó, ly tâm hỗn hợp chiết ở tốc độ thấp (khoảng 50 g đến 100 g tùy thuộc vào kiểu loại và độ bền của ống ly tâm được sử dụng) trong 30s để tách lớp.

Patulin không bền trong dung dịch kiềm (ví dụ natri hydro cacbonat), vì vậy ở giai đoạn này cần tiến hành càng nhanh càng tốt để tránh sự thất thoát.

6.2 Làm sạch bằng chiết pha rắn

Bước này để loại bỏ các hợp chất có tính axit gây nhiễu có trong mẫu. Cho 50 ml hỗn hợp của axit axetic và etyl axetat (4.14) vào lọ thủy tinh có nắp vặn dung tích 6 ml (5.10) và đặt dưới cột SPE silicagel chưa được ổn định (4.4). Chuyển ngay chính xác 2,50 ml (V₂) dịch chiết đã ly tâm lên cột SPE chưa ổn định (4.4). Thu lấy dịch rửa giải vào lọ thủy tinh (5.10) ở tốc độ một giọt trên giây (ví dụ, bằng trọng lực hoặc nén nhẹ không khí). Rửa ngay cột SPE bằng 3ml dung môi chiết (4.13) để rửa giải hết patulin ra khỏi cột. Khi gần như tất cả dịch rửa giải đã chảy qua hết, thì dùng xyranh chứa đầy không khí đẩy dung môi còn lại ra khỏi cột vào trong lọ.

Cho bay hơi dịch rửa giải thu được ở nhiệt độ tối đa 40⁰C vừa đến khô dưới dòng nitơ nhẹ, dùng thiết bị làm bay hơi (5.9). Quá trình này không nên kéo dài quá 10 min. Không kéo dài quá trình bay hơi sau khi đã khô, để tránh làm thất thoát patulin. Thêm 1 ml (V₃) nước có pH = 4 (4.8) vào lọ (5.10) và vặn chặt nắp. Lắc (hoặc lắc xoáy) lọ ít nhất 3 min để đảm bảo rằng patulin được hòa tan lại hoàn toàn. Nếu dung dịch trong, thì chuyển trực tiếp vào lọ bơm thích hợp (ví dụ dung tích nhỏ hơn hoặc bằng 2 ml) và bơm hoặc khi dung dịch bị đục, thì lọc bằng bộ lọc dạng xylanh thích hợp (5.12) trước khi bơm vào HPLC.

6.3 Quy trình thêm chuẩn

6.3.1 Nước quả

Cân 19 g nước quả, chính xác đến 0,1 g, cho vào cốc có mỏ 50 ml. Thêm chính xác 1,00 ml dung dịch  thêm chuẩn nồng độ 200 ng/ml hoặc 500 ng/ml (4.19) để thu được các mức thêm chuẩn 10 mg/kg hoặc 25 mg/kg tương ứng. Khuấy trộn đều dung dịch. Từ dung dịch thêm chuẩn 20,0 g này, dùng chính xác 10,0 g để phân tích theo 6.1 và 6.2.

6.3.2 Puree quả

Cân 19 g puree, chính xác đến 0,1 g, cho vào cốc có mỏ 50 ml. Thêm chính xác 1,00 ml dung dịch thêm chuẩn nồng độ 200 ng/ml hoặc 500 ng/ml (4.19) để thu các mức chuẩn 10 mg/kg hoặc 25 mg/kg tương ứng. Trộn đều bằng thìa trong ít nhất 3 min và vét hết puree trên thành cốc cho vào trộn. Sau khi khuấy trộn sơ bộ bằng thìa, dùng xyranh bằng chất dẻo và trộn puree thêm chuẩn này bằng cách lặp lại việc hút và nhả nhanh. Đảm bảo rằng tất cả đã được trộn đều. Từ 20,0 g puree thêm chuẩn này, dùng chính xác 10,0 g để phân tích theo 6.1 và 6.2.

6.3.3 Tính các mẫu thêm chuẩn

Đối với các phép thực nghiệm thêm chuẩn, dùng 10 g nước quả và puree quả để tính.

7. Phân tích bằng HPLC

7.1 Các điều kiện vận hành HPLC

Khi sử dụng cột quy định trong 5.13.4 và pha động quy định trong 4.15, thì việc cài đặt thích hợp như sau, xem thêm Hình A.1 và Hình A.2:

– Tốc độ dòng pha động (cột):                           0,6 ml/min đến 1,0 ml/min;

– Bước sóng detector UV:                                 276 nm;

– Thể tích bơm:                                                  100 ml đến 200 ml

7.2 Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn dùng cho HPLC

Dùng pipet, ví dụ lấy các lượng 60 ml, 120 ml, 180 ml, 240 ml, 300 ml, 360 ml và 420 ml dung dịch chuẩn patulin (4.18) cho vào bình định mức dung tích 50 ml khác nhau. Thêm nước có pH = 4 (4.8) đến vạch và lắc. Các dung dịch patulin này có nồng độ khối lượng 12 ng/ml, 24 ng/ml, 36 ng/ml, 48 ng/ml, 60 ng/ml, 72 ng/ml và 84 ng/ml tương ứng. Các nồng độ khối lượng này phản ánh các mức nhiễm patulin trong mẫu là 4,8 mg/kg, 9,6 mg/kg, 14,4 mg/kg, 19,2 mg/kg, 24,0 mg/kg, 28,8 mg/kg và 33,6 mg/kg dựa vào giả định dung dịch chuẩn patulin 10 mg/ml (4.18) được dùng để chuẩn bị và chúng có thể dùng trực tiếp để bơm vào hệ thống HPLC.

Trong trường hợp dung dịch chuẩn patulin (4.18) có nồng độ khác với 10 mg/ml, thì chỉnh các dung dịch hiệu chuẩn bằng cách tính chính xác phần dịch lỏng có tính đến nồng độ khối lượng thực của dung dịch chuẩn được xác định trong 4.18.

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở 4⁰C. Các dung dịch được bảo quản bằng cách này bền ít nhất tám tuần.

7.3 Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách bơm 100 ml của các dung dịch hiệu chuẩn (7.2) bắt đầu trong ngày phân tích.

Dựng đường chuẩn theo diện tích pic theo khối lượng patulin được bơm và kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn.

Trong trường hợp hàm lượng patulin của mẫu nằm ngoài đường chuẩn, thì chuẩn bị đường chuẩn khác có dải thích hợp bao trùm nồng độ khối lượng của mẫu. Cách khác, đối với đường chuẩn đã thiết lập, thì dung dịch bơm để phân tích HPLC có thể được pha loãng đến hàm lượng patulin thích hợp.

7.4 Xác định patulin trong các dung dịch mẫu thử

Bơm các phần dịch lỏng của dung dịch mẫu thử đã được chuẩn bị như mô tả trong 6.1 và 6.2 vào máy sắc kí, áp dụng cùng một điều kiện như để chuẩn bị đường chuẩn.

8. Tính kết quả

Phép định lượng được tiến hành bằng cách tích phân chiều cao pic hoặc diện tích pic thu được. Xác định phần khối lượng, w_pat, của patulin trong mẫu thử, tính bằng microgam trên kilogam, trực tiếp từ đường chuẩn (7.3) hoặc tính từ nồng độ khối lượng của dung dịch được bơm, dùng Công thức (2):

                                        (2)

Trong đó

      là nồng độ khối lượng của patulin trong dung dịch mẫu thử được bơm, tính được từ hồi quy tuyến tính, biểu thị bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V₁         là thể tích của dung môi được lấy để chiết, tính bằng mililit (ml) (trong trường hợp này: 10 ml);

V₂         là thể tích phần dịch lỏng của dịch chiết mẫu được dùng để làm sạch SPE, tính bằng mililit (ml) (trong trường hợp này: 2,5 ml);

V₃         là thể tích của nước có pH = 4 (4.8) được dùng để hoà tan lại, tính bằng mililit (ml) (trong trường hợp này: 10 ml);

m_s        là khối lượng của vật liệu mẫu được lấy để phân tích, tính bằng gam (g) (trong trường hợp này: 10 g).

Báo cáo kết quả đến ba chữ số có nghĩa.

9. Độ chụm

9.1 Yêu cầu chung

Các chi tiết của phép thử liên phòng thừ nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục B.

9.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, trên vật liệu giống thử hệt nhau, do một người thử nghiệm, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn lặp lại, r.

Các giá trị đối với nước táo là:

 = 7,4 mg/kg                           r = 0,73 mg/kg

 = 15,5mg/kg                          r = 5,07 mg/kg

 = 3,0 mg/kg                           r = 1,01 mg/kg

 = 6,0 mg/kg                           r = 2,40 mg/kg

 = 10,7 mg/kg                         r = 3,61 mg/kg

Các giá trị đối với puree quả trong thực phẩm dành cho trẻ nhỏ là:

 = 7,4 mg/kg                           r = 0,73 mg/kg

 = 17,9mg/kg                          r = 2,91 mg/kg

 = 3,4 mg/kg                           r = 0,90 mg/kg

 = 7,1 mg/kg                           r = 1,06 mg/kg

 = 10,1 mg/kg                         r = 2,13 mg/kg

9.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong hai phòng thử nghiệm, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với nước táo là:

 = 7,4 mg/kg                           r = 6,54 mg/kg

 = 15,5mg/kg                          r = 12,29 mg/kg

 = 3,0 mg/kg                           r = 3,28 mg/kg

 = 6,0 mg/kg                           r = 3,30 mg/kg

 = 10,7 mg/kg                         r = 7,28 mg/kg

Các giá trị đối với puree quả trong thực phẩm dành cho trẻ nhỏ là:

 = 7,4 mg/kg                           r = 3,05 mg/kg

 = 17,9mg/kg                          r = 6,30 mg/kg

 = 3,4 mg/kg                           r = 3,39 mg/kg

 = 7,1 mg/kg                           r = 3,61 mg/kg

 = 10,1 mg/kg                         r = 5,54 mg/kg

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên gọi);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và hình thức tiến hành lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả thử nghiệm và đơn vị biểu thị kết quả;

g) các điểm đặc biệt quan sát được trong khi thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Sắc đồ điển hình

CHÚ DẪN:

x  thời gian, tính bằng phút

y  tín hiệu, tính bằng milivolt

1  patulin

Hình A.1 – Sắc đồ điển hình của nước táo có patulin ở khoảng 13 mg/kg

CHÚ DẪN:

x  thời gian, tính bằng phút

y  tín hiệu, tính bằng milivolt

1  patulin

Hình A.2 – Sắc đồ điển hình của nước táo có patulin ở khoảng 15 mg/kg

Phụ lục B

(Tham khảo)

Dữ liệu và độ chụm

Dữ liệu nêu trong Bảng B.1 và B.2 thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm [1] theo thủ tục của IUPAC về các nghiên cứu hiệu năng của phương pháp [3].

Bảng B.1 – Dữ liệu về độ chụm của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với nước táo

Mẫu	1	2	3	4	5
Các mức đích, mg/kg	10	25	3,6a	8,1a	12,2a
Năm tiến hành liên phòng thử nghiệm	2003	2003	2003	2003	2003
Số lượng các phòng thử nghiệm	14	14	13	13	15
Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	14	14	12	11	15
Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm)	0	0	1	2	0
Số lượng các kết quả được chấp nhận	14	14	12	11	15
Giá trị trung bình, , mg/kg	7,4	15,5	3,0	6,0	10,7
Độ lệch chuẩn lặp lại, s, mg/kg	0,57	1,81	0,36	0,86	1,29
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %	7,7	11,7	12,2	14,3	12,1
Giới hạn lặp lại r [r=2,8 x sr], mg/kg	1,60	5,07	1,01	2,40	3,61
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/kg	2,34	4,39	1,17	1,18	2,60
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %	31,6	28,3	39,5	19,8	24,3
Giới hạn tái lập R [R = 2,8 x sR], mg/kg	6,54	12,29	3,28	3,30	7,28
Độ thu hồi, %	74	62	–	–	–
Giá trị HorRat, theo [4]	0,94	0,94	1,03	0,57	0,77
Giá trị HorRat R, theo [5]	1,44	1,29	1,80	0,90	1,10
a  mẫu nhiễm tự nhiên, các giá trị đích được xác định trong khi nghiên cứu đồng hóa mẫu.

Bảng B.2 – Dữ liệu về độ chụm của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với puree trong nước quả dành cho trẻ nhỏ

Mẫu	6	7	8	9	10
Các mức đích, mg/kg	10	25	2,8a	6,5a	10,5a
Năm tiến hành liên phòng thử nghiệm	2003	2003	2003	2003	2003
Số lượng các phòng thử nghiệm	15	15	13	15	14
Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	13	13	11	14	14
Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm)	2	2	2	1	0
Số lượng các kết quả được chấp nhận	13	13	11	14	14
Giá trị trung bình, , mg/kg	7,4	17,9	3,4	7,1	10,1
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/kg	0,26	1,04	0,32	0,38	0,76
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %	3,5	5,8	9,3	5,3	7,5
Giới hạn lặp lại r [r=2,8 x sr], mg/kg	0,73	2,91	0,90	1,06	2,13
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/kg	1,09	2,25	1,21	1,29	1,98
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %	14,7	12,5	35,2	18	19,6
Giới hạn tái lập R [R = 2,8 x sR], mg/kg	3,05	6,30	3,39	3,61	5,54
Độ thu hồi, %	74	72	–	–	–
Giá trị HorRat, theo [4]	0,44	0,43	0,94	0,53	0,61
Giá trị HorRat R, theo [5]	0,67	0,57	1,60	0,82	0,89
a  mẫu nhiễm tự nhiên, các giá trị đích được xác định trong khi nghiên cứu đồng hóa mẫu.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] EUR Report 21008 EN (2004) Validation of an Analytical Method to Determine the Content of Patulin in Apple Juice Fruit Puree.

[2] AOAC Official Methods, 1995, Natural Toxins, Patulin, 49.6.01.C(d)

[3] IUPAC (1995) Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method Performance Studies, Pure & Applied Chem. 67, 331-343.

[4] Horwitz W. and Albert R, 2006, The Horwitz Ratio (HorRat): A useful index of Method Performance with Respect to Precision, Journal of AOAC International, vol. 89. 1095-1109.

[5] Thompson M., 2000, Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst, vol. 125:385-386.