TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8972-2:2011 ( EN 12823-2 : 2000) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN A BẮNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – PHẦN 2: XÁC ĐỊNH Β-CAROTEN

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8972-2 : 2011

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN A BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – PHẦN 2: XÁC ĐỊNH -CAROTEN

Foodstuffs – Determination of vitamin A by high-performance liquid chromatography – Part 2: Measurement of b-carotene

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng b caroten tổng số trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 2625 (ISO 5555), Dầu mỡ động vật và thực vật – Lấy mẫu.

TCVN 8972-1 : 2011 (EN 12823-1 : 2000), Thực phẩm –  Xác định vitamin A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao – Phần 1: Xác định 13-cis-retinol và tất cả các đồng phân trans-retinol.

3. Nguyên tắc

Xác định tổng của các đồng phân b-caroten trong dung dịch mẫu bằng HPLC và đo phổ trong dải nhìn thấy được. Dịch chiết thu được sau khi xà phòng hóa như quy định trong TCVN 8972-1 (EN 12823-1) có thể được dùng để định lượng. Việc nhận biết dựa vào thời gian lưu và xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn sử dụng diện tích pic hoặc chiều cao pic, xem [3] đến [7].

Có thể sử dụng phương pháp nội chuẩn nếu các phép thử về độ thu hồi tương ứng được chứng minh là phù hợp

4. Thuốc thử

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng ít nhất là loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác.

4.1. Metanol

4.2. Etanol tuyệt đối, j (C₂H₅OH) = 100 % thể tích.

4.3. Etanol, j (C₂H₅OH) = 96 %.

4.4. Natri sulfat, khan.

4.5. Dung dịch KOH dùng để xà phòng hóa, có các nồng độ khối lượng thích hợp, ví dụ r (KOH) = 50 g/100 ml hoặc 60 g/100 ml, hoặc dung dịch ancol,ví dụ 28 g KOH trong 100 ml hỗn hợp etanol/nước (9 + 1) (tính theo thể tích).

4.6. Chất chống oxy hóa, ví dụ axit ascorbic (AA), natri ascorbat, natri sulfit (Na­₂S), hydroxytoluen đã butyl hóa (BHT), pyrogallol hoặc hydroquinon.

4.7. Dung môi và dung môi chiết, ví dụ: axetonitril, dietyl ete(không chứa peroxit), di-isopropylete, dầu nhẹ (dải sôi từ 40 °C đến 60 °C), n-hexan, diclometan, tetrahydrofuran, toluen hoặc các hỗn hợp thích hợp của chúng.

4.8. Dung dịch amoni axetat trong metanol, ví dụ c(CH₃CO₂NH₄) = 0,05 mol/l.

4.9. Trietylamin

4.10. Pha động HPLC, ví dụ axetonitril (4.7) + dung dịch amoni axetat trong metanol (4.8) + diclometan (4.7) (75 + 20 + 5) (thể tích) chứa hydroxy toluen đã butyl hóa (4.6) 0,1% khối lượng và trietylamin 0,05% khối lượng (4.9). Đối với pha động của hệ thống HPLC thay thế, xem Phụ lục C.

4.11. Chất chuẩn

4.11.1. Yêu cầu chung

b – caroten và α – caroten có thể có được từ các nhà cung cấp khác nhau, ví dụ Sigma [1]. Độ tinh khiết của các chất chuẩn có thể dao động từ 90% đến 100%. Vì vậy cần xác định nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn bằng đo phổ (xem phép thử độ tinh khiết và xác định nồng độ [4.12.2]).

4.11.2. b-caroten , M (C₄₀H₅₆) = 536,85 g/mol, có hàm lượng đã biết ít nhất là 95%.

4.11.3. α-caroten, M (C₄₀H₅₆) = 536,85 g/mol, dùng để định tính.

4.11.4. Lycopen, M (C₄₀H₅₆) = 536,85 g/mol, dùng để định tính.

4.12. Dung dịch gốc và dung dịch chuẩn

4.12.1. Dung dịch gốc b – caroten

Hòa tan khoảng 3 mg chất chuẩn b-caroten (4.11.2) trong 20 ml diclometan, tetrahydrofuran hoặc toluen (4.7), đặt bình định mức vào bể siêu âm (5.6) trong khoảng 30 s. Pha loãng dung dịch này bằng n-hexan đến 100 ml, sau đó pha loãng 10,0 ml dung dịch thu được bằng n-hexan đến 100 ml. 1 ml dung dịch này chứa khoảng 3 µg b-caroten trong n-hexan/diclometan (98+2) (tính theo thể tích), n-hexan/tetrahydrofuran (98+2) (tính theo thể tích); hoặc n-hexan/toluen (98+2) (tính theo thể tích).

Bảo quản dung dịch tránh ánh sáng, nhiệt độ nhỏ hơn 4°C.

4.12.2. Phép thử độ tinh khiết và xác định nồng độ.

Đo độ hấp thụ của dung dịch gốc b-caroten (4.12.1) ở bước sóng cực đại khoảng 453 nm, dùng máy đo phổ (5.1). Tính nồng độ khối lượng, r, bằng microgam trên mililit, theo công thức (1):
(1)

Trong đó

A₄₅₃ là giá trị hấp thụ của dung dịch gốc ở bước sóng cực đại khoảng 453 nm;

2592 là giá trị  của b-caroten trong n-hexan. Giá trị này có thể thay đổi đáng kể theo thành phần của dung môi [8].

Tỷ số của A₄₅₅/A₃₄₀ phải lớn hơn 15 và tỷ số A₄₅₅/A₄₈₃ phải trong dải từ 1,14 đến 1,18 đối với độ tinh khiết của all-trans-b-caroten [8].

4.12.8. Dung dịch chuẩn b-caroten

Dùng pipet lấy 20ml dung dịch gốc b-caroten (4.12.1) cho vào bình cầu đáy tròn và loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm (5.2) ở nhiệt độ không quá 50 °C. Hòa tan cặn trong 20 ml dung môi phù hợp với HPLC pha đảo.

Dung dịch chuẩn phải được bảo quản tránh ánh sáng, ở nhiệt độ dưới 4 °C và thường bền đến 1 tuần.

4.12.4. Dung dịch chuẩn của α-caroten và lycopen2)

Để định lượng, hòa tan sơ bộ khoảng 0,3 mg α-caroten (4.11.3) hoặc lycopen (4.11.4) trong khoảng 10 ml tetrahydrofuran (4.7) và pha loãng đến vạch 100 ml bằng etanol (4.3) hoặc dung môi khác phù hợp với hệ thống HPLC.

Dung dịch chuẩn phải được bảo quản tránh ánh sáng, ở nhiệt độ dưới 4°C và thường bền đến 1 tuần.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1. Máy đo phổ UV-VIS, có khả năng đo độ hấp thụ ở các bước sóng xác định, với các cuvet thạch anh thích hợp, ví dụ: chiều dài đường quang 1 cm.

5.2. Máy công quay, có nồi cách thủy và bộ phận chân không.

CHÚ THÍCH: Nên sử dụng nitơ để giải phóng chân không.

5.3. Hệ thống HPLC, gồm có bơm, bộ bơm mẫu, detector UV-VIS và hệ thống đánh giá kết quả như máy tích phân/hoặc máy ghi.

5.4. Cột HPLC

Cột pha đảo phân tích, ví dụ cột pha đảo C₁₈, cỡ hạt 5 µm, đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài 250 mm.

Có thể sử dụng các loại cột và cỡ hạt khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các điều kiện sắc ký có thể phải được điều chỉnh cho phù hợp với các nguyên liệu để đảm bảo cho kết quả tương đương.

Tiêu chí đối với các cột phân tích phù hợp là hệ số phân giải đối với all-trans-α-caroten và all-trans-b-caroten phải lớn hơn 1.

Sử dụng vật liệu nhồi cột pha đảo thích hợp, ví dụ: Vydac® 201TP543), Vydac® 218TP54³⁾, Eurospher® 100-C₁₈³⁾, Ultraspher® ODS³⁾, Spherisorb® ODS2³⁾, Zorbax® ODS2³⁾ và LiChrospher® RP 18³⁾. Các cột có thể cũng được sử dụng trong dãy phân tích. Nên dùng cột bảo vệ để tăng thời hạn sử dụng của cột phân tích.

5.5. Dụng cụ lọc

Các dụng cụ lọc loại lớn, nhỏ để lọc pha động HPLC và các dung dịch mẫu tương ứng, ví dụ có cỡ lỗ 0,45 µm là thích hợp.

CHÚ THÍCH Việc lọc pha động cũng như dung dịch mẫu thử qua bộ lọc màng trước khi sử dụng hoặc bơm có thể tăng thời gian sử dụng của cột.

5.6. Bể siêu âm

5.7. Bộ lọc tách pha (tùy chọn).

6. Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 2625 (ISO 5555), nếu thích hợp.

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu thử. Nghiền mẫu bằng dụng cụ nghiền thích hợp và trộn kỹ lại. Làm lạnh sơ bộ để mẫu không tiếp xúc với nhiệt độ cao trong khoảng thời gian dài. b-caroten nhạy với bức xạ UV và ánh sáng.

7.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

7.2.1. Xà phòng hóa

Xà phòng hóa từ 2 g đến 10 g mẫu thử bằng cách cho đối lưu, tốt nhất dưới dòng nitơ, dùng các lượng thích hợp của metanol (4.1) hoặc etanol (4.3), nước, chất chống oxi hóa (4.6) và dung dịch kali hydroxit (4.5). Cho chất chống oxy hóa và mẫu trước khi bổ sung kali hydroxit. Natri sulfit (4.6) có thể cũng được bổ sung để phòng ngừa ảnh hưởng của các kim loại dạng vết.

Các ví dụ về tỷ lệ các thuốc thử phù hợp được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1- Tỷ lệ thích hợp của các thuốc thử

Thời gian xà phòng hóa thường từ 15 min đến 45 min ở nhiệt độ từ 80 °C đến 100 °C (đối lưu).

Nếu sau khi xà phòng hóa và làm nguội, vẫn còn chất béo hoặc dầu thực vật trên bề mặt hỗn hợp xà phòng hóa, thì bổ sung kali hydroxit trong etanol và kéo dài thời gian xà phòng hóa.

CHÚ THÍCH Thực tế cho thấy rằng các mẫu có hàm lượng chất béo thấp như quả hoặc rau có thể chiết được trực tiếp bằng các dung môi thích hợp bằng phương pháp tương ứng, ví dụ như quy định trong [9] đến [11]. Tuy nhiên, cũng nên kiểm tra để chắc chắn rằng việc tách sắc ký có đáp ứng được các tiêu chí xác định ở trên (vấn đề gây nhiễu).

7.2.2. Chiết

Để tránh tạo nhũ, nên bổ sung một lượng nước vào dung dịch mẫu đã xà phòng hóa sao cho tỷ lệ của ancol với nước có trong dung dịch tạo thành 1:1.

Chiết b-caroten ra khỏi dung dịch mẫu đã xà phòng hóa bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp (4.7). Lặp lại quy trình chiết từ 3 đến 4 lần dùng các lượng từ 50 ml đến 150 ml. Rửa hỗn hợp các dịch chiết bằng nước (thường từ 2 đến 4 lần, mỗi lần dùng từ 50 ml đến 150 ml) đến trung tính.

7.2.3. Làm bay hơi

Làm bay hơi dịch chiết bằng máy cô quay (5.2) dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 50°C. Loại bỏ hết nước bằng cách dùng natri sulfat (4.4) hoặc chưng cất đồng sôi với etanol tuyệt đối (4.2) hoặc toluen (4.6). Có thể dùng các kỹ thuật tương đương khác như dùng giấy lọc tách pha (5.7) để loại nước, với điều kiện chúng đã được chứng minh không ảnh hưởng đến kết quả.

7.2.4. Pha loãng

Hòa tan lại cặn trong cùng một loại hỗn hợp dung môi trong đó các dung dịch chuẩn (4.12.3 và 4.12.4) đã được chuẩn bị, tốt nhất là pha động hoặc dung môi phù hợp với HPLC khác sao cho để thu được nồng độ b-caroten lên đến 5 µg/ml. Đây là dung dịch mẫu thử.

7.3. Nhận biết

Nhận biết b-caroten bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic đơn lẻ trong các sắc đồ thu được bằng dung dịch mẫu thử (xem 7.2.4) với thời gian lưu của các pic của dung dịch chuẩn (4.12.3 và 4.12.4). Việc nhận biết pic có thể cũng được thực hiện bằng các bổ sung các lượng nhỏ dung dịch chuẩn thích hợp vào dung dịch mẫu thử.

CHÚ THÍCH 1: Việc tách và định lượng cho thấy thỏa mãn nếu tuân thủ các điều kiện sắc ký sau đây (xem thêm Hình Α.1).

7.4. Xác định

Bơm các thể tích thích hợp (ví dụ 20 µl) của dung dịch chuẩn (4.12.3) cũng như dung dịch mẫu thử (xem 7.2.4) vào hệ thống HPLC (5.3). Tiến hành định lượng  bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic thu được đối với dung dịch mẫu thử và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với chất chuẩn có thời gian lưu tương tự, hoặc dựng đường chuẩn.

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và của các dung dịch chuẩn (4.12.3 và 4.12.4) hoặc bù bằng hệ số tương ứng trong phép tính kết quả. Kiểm tra độ tuyến tính của hàm hiệu chuẩn, dùng tối thiểu ba mức pha loãng của dung dịch gốc b-caroten (4.12.1).

7.5. Số lần xác định:

Tiến hành ít nhất hai lần xác định độc lập.

8. Tính kết quả

Dựa vào đường chuẩn, hoặc dùng các chương trình tương ứng của máy tích phân, dùng quy trình đã đơn giản hóa sau đây:

Tính nồng độ khối lượng của b-caroten tổng số, r, bằng mililit trên 100g mẫu (mg/100g), theo Công thức (2):

  (2)

Trong đó

9. Độ chụm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp phù hợp với TCVN 6910 (ISO 5725) [12] được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng để phân tích các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu trong Phụ lục B.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với b–caroten tổng số là:

Margarin		mg/100g	r = 0,032	mg/100g
Đồ uống có vitamin		mg/100g	r = 0,19	mg/100g
Bột bánh pudding		mg/100g	r = 0,24	mg/100g
Rau trộn		mg/100g	r = 2,0	mg/100g

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi tiến hành thử trên vật liệu giống nhau, do hai phòng thử nghiệm thực hiện, không quá 5% các trường hợp lớn giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với b-caroten tổng số là:

Margarin		mg/100 g	R = 0,069	mg/100 g
Đồ uống có vitamin		mg/100 g	R = 0,41	mg/100 g
Bột bánh pudding		mg/100 g	R = 0,40	mg/100 g
Rau trộn		mg/100 g	R = 7,6	mg/100 g

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm thông tin sau đây:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

– các kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

– ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

– ngày nhận mẫu;

– ngày thử nghiệm;

– các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

– mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC VÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ HPLC

a) Độ hấp thụ;

b) Thời gian;

Pha tĩnh: Spherisorb®5) ODS2, dài 5m, ống cartridge 100 mm x 4,6 mm được kết hợp với Vydac®⁵⁾ 201TP54, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm;

Pha động: axetonitril + dung dịch nhôm axetat trong metanol + diclometan (75 + 20 +5) (thể tích) chứa 0,1% khối lượng hydroxytoluen đã butyl hóa và 0,05% khối lượng trietylamin;

Tốc độ dòng:    1,5 ml/min;

Thể tích bơm:    50 µl;

Phát hiện:         450 nm

Hình Α.1 – Ví dụ về chiết α-caroten, b-caroten và lycopen trong mẫu rau trộn bằng HPLC

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Các kết quả và dữ liệu về độ chụm được nêu trong Bảng B.1 về xác định b–caroten tổng số thu được từ một phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) [12] do W.Shüep và J. Schierle [11] tổ chức.

Bảng B.1 – Kết quả thử nghiệm

Các dữ liệu được kiểm tra xác nhận nêu trong Bảng B.2 đã xác định được trong nghiên cứu so sánh do chương trình Tiêu chuẩn, Đo lường và Thử nghiệm của Ủy ban Châu Âu do Viện nghiên cứu thực phẩm Norwich, Vương quốc Anh tổ chức thực hiện năm 1996 về việc đo all-trans-b-caroten trong mẫu rau trộn [10].

Bảng B.2 – Kết quả thử liên phòng thử nghiệm đối với all-trans-b-caroten

CHÚ THÍCH Dữ liệu thu được trong nghiên cứu so sánh quốc tế này thu được bằng phương pháp tương đương khác với quy trình thông thường trong các phòng thử nghiệm dùng hệ thống HPLC như Phụ lục C.

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

HỆ THỐNG HPLC THAY THẾ

Việc tách và định lượng retinol cho thấy thỏa mãn nếu sử dụng các điều kiện sắc ký trong Bảng C.1 [10]. Xem thêm [11].

Bảng C.16) – Các điều kiện sắc ký

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] World Health Organisation, Expert Committee on Biological Standardisation, Techn. Report No. 147, 11, WHO, Geneva, 1958 and Techn. Report 222, I O, 51-52, WHO, Geneva, 1961.

[2] Int. Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), The Vitamin A Potency of b-Carotene, Butterworths Scientific Publications, London 1959.

[3] Bushway, R.J.: Separation of Carotenoids in Fruits and Vegetables by High-Performance Liquid Chromatography, J. Liên quan. Chromatogr. 8, 1985, 1527-47.

[4] Quackenbush, F.W.: Reversed Phase HPLC Separation of Cis- and Trans-Carotenoids and its Application in Food Materials, J. Liên quan. Chromatogr. 10, 1987, 643-653.

[5] O Neil, C.A., Schwartz, S.J., Catignani, G.L: Comparision of Liquid Chromatographic Methods for Determination of Cis-Trans Isomers of b-Carotene, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74, 1991, 36-42.

[6] Saleh, H.M., Tan, B.: Separation and Identification of Cisnrans Carotenoid Isomers, J. Agric, Food Chem., 39, 1991, 1438-1443.

[7] Lumley, i. D.: in The Technology of Vitamins in Food, ed. P. B. Ottaway, Blacie Academic & Professional, Glasgow, 1993, 183-186.

[8] De Ritter, E. and Purcell, Α.E.: Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors, ed. By J. Christopher Bauernfeind, Academic Press Inc., New York, 1981,889.

[9] Hart, D.J. and Scott, K.J. , 1995. Development and evaluation of an HPLC method for the analysis of carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid content of vegetables and fruits commonly consumed in the UK. Food Chem 54, 101-1 11.

[10] Finglas, P.M., Scott, K.J., Wilthöft, C.M., van der Berg, H.8, de Froidmont – Görtz, I., 1999. The certification of the mass fractions of vitamins in four reference materials: wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophilized mixed vegetables (CRM 485) and lyophilized pig’s liver (CRM 487). EUR-Report DOC/BCR/O1/98. Commission of the European Union, Luxembourg.

[11] Schüep, W. and Schiede, J., 1997. Determination of b-Carotene in Commercial Foods: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International Vol. 80 No.5,1057-1064.

[12] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994),Độ chính xác (độ đúng và độ chụm)của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.