TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8339:2010 VỀ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8339:2010

NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Bivalve molluscs – Determination of paralytic shellfish poisons (PSP) content – Method using high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 8339 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TCVN 8339:2010

NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Bivalve molluscs – Determination of paralytic shellfish poisons (PSP) content – Method using high-performance liquid chromatography

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ – Xác định hàm lượng độc tố gây liệt cơ (PSP) – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bivalve molluscs – Determination of paralytic shellfish poisons (PSP) content – Method using high-performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt cơ (PSP) trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Phương pháp này có thể áp dụng để xác định các độc tố PSP sau:

– Saxitoxin (STX), neosaxitoxin (neoSTX), decarbamoylsaxitoxin (dcSTX);

– Các hợp chất thuộc nhóm gonyautoxin (gồm có các chất từ GTX1 đến GTX6);

– Các hợp chất thuộc nhóm N-sulforcarbamoyl-11-hydroxysulfat (gồm các chất từ C1 đến C4);

– Các hợp chất nhóm decarbamoylgonyautoxin (gồm các chất từ dcGTX1 đến dcGTX4).

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 mg/100 g.

2. Nguyên tắc

Các độc tố PSP được chiết ra khỏi mẫu thử bằng axit axetic. Đối với các hợp chất thuộc nhóm N – sulforcarbamoyl phải thực hiện thêm quá trình phân tích chiết bằng dung dịch axit clohydric nồng độ 0,1 N trước khi đưa vào hệ thống HPLC. Sau quá trình thuỷ phân, hợp chất C1 sẽ chuyển đổi thành GTX2, C2 sẽ chuyển đổi thành GTX3.

Dịch chiết chứa các độc tố PSP được bơm vào thiết bị HPLC. Tại hệ thống phản ứng sau cột, các độc tố PSP được ôxy hoá bởi axit periodic trong môi trường kiềm tạo thành dẫn xuất có tính huỳnh quang. Các dẫn xuất này được phân tích trên HPLC với detector huỳnh quang.

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

3.1 Dung dịch axit axetic, 0,03 N và 1M

3.2 Dung dịch axit clohydric, 1,0 N.

3.3 Dung dịch natri axetat (CH₃COONa), 1 N.

3.4 Dung dịch oxy hoá, chứa axit periodic nồng độ 10 mM và amoni hydroxit nồng độ 550 mM

3.5 Các dung dịch chuẩn STX, NEO, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, dcGTX2, dcGTX3, dcSTX, nồng độ từ 0,1 µg/ml đến 1 µg/ml.

3.6 Pha động HPLC

3.6.1 Pha động 1: 98,5 % dung dịch chứa muối natri octansulfonat nồng độ 11 mM, axit phosphoric nồng độ 40 mM đã được chỉnh pH về 6,9 với amoni hydroxit (NH₄OH) và 1,5 % tetrahydrofuran.

3.6.2 Pha động 2: 83,5 % dung dịch chứa muối natri octansulfonat nồng độ 11 mM, axit phosphoric nồng độ 40 mM đã được chỉnh pH về 6,9 với amoni hydroxit, 15,0 % axetonitril (3.4) và 1,5 % tetrahydrofuran.

3.6.3 Pha động 3: 98,5 % dung dịch axit phosphoric nồng độ 40 mM đã được chỉnh pH về 6,9 với amoni hydroxit và 1,5 % tetrahydrofuran.

3.7 Mẫu thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ chuẩn, đã biết hàm lượng PSP.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.2 Rây, cỡ số 5.

4.3 Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min.

4.4 Ống ly tâm, dung tích 15 ml.

4.5 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min.

4.6 Máy siêu âm.

4.7 Màng lọc mao quản, kích thước 0,45 mm.

4.8 Micropipet, có dải đo từ 10 ml đến 1 000 ml.

4.9 Hệ thống HPLC, với detector huỳnh quang có độ nhạy cao.

4.10 Cột sắc ký loại RP C8, có đường kính trong 4,6 mm, dài 150 mm, có chứa hạt silicagel.

4.11 Hệ thống phản ứng sau cột, gắn ngay sau cột sắc ký

Sơ đồ cách lắp đặt hệ thống phản ứng sau cột, xem Hình 1.

 Hình 1 – Sơ đồ lắp đặt hệ thống phản ứng sau cột.

5. Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Rửa sạch vỏ của nhuyễn thể trước khi mở để lấy thịt. Rửa nhanh thịt nhuyễn thể trong nước để loại bỏ cát sạn và các tạp chất khác. Tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể.

5.1.2 Cân khoảng 150 g thịt nhuyễn thể, chính xác đến 0,1 mg, cho lên rây cỡ số 5 (4.2), để yên trong 5 min để loại bỏ hết nước. Sau đó, mẫu được nghiền trong máy nghiền (4.3) cho đến khi đồng nhất.

5.2 Tách chiết và thủy phân độc tố từ mẫu thử

5.2.1 Tách chiết

5.2.1.1 Cân 1,0 g mẫu thịt nhuyễn thể đã được đồng nhất, chính xác đến 0,1 mg, vào một ống ly tâm dung tích 15 ml (4.4). Thêm 1,0 ml axit axetic nồng độ 0,03 N (3.1) vào ống rồi đặt vào máy siêu âm (4.6). Sau đó, ly tâm với tốc độ 5 000 r/min trong thời gian 10 min rồi lọc lấy dịch qua màng lọc mao quản (4.7).

5.2.1.2 Để kiểm tra độ thu hồi của phương pháp, sử dụng 1 g mẫu thịt nhuyễn thể chuẩn (3.10) và thực hiện qui trình giống như với mẫu thử.

5.2.2 Thủy phân các độc tố thuộc nhóm N-sulfocarbamoyl

Các độc tố thuộc nhóm C được thủy phân bằng cách đun nóng 150 ml của dung dịch chiết đã chuẩn bị theo 5.2.1 với 37 ml axit clohydric nồng độ 1,0 N (3.2) ở nhiệt độ 90 ⁰C trong 15 min. Sau khi làm nguội hỗn hợp đến nhiệt độ phòng, thêm 75 ml dung dịch muối natri axetat nồng độ 1 N (3.3) rồi đưa phân tích trên hệ thống HPLC.

5.3 Phân tích độc tố trên HPLC

5.3.1 Điều kiện phân tích

– cột sắc ký HPLC (4.10);

– chế độ gradient theo quy định trong Bảng 1;

– tốc độ dòng 1,2 ml/min;

– thể tích mỗi lần bơm là 10 ml;

– bước sóng cài đặt cho detector huỳnh quang: bước sóng kích thích 330 nm và bước sóng phát xạ 395 nm.

Bảng 1 – Chế độ gradient

5.3.2 Điều kiện trong hệ thống phản ứng sau cột

– tốc độ dòng của tác nhân oxy hoá (3.4): 0,3 ml/min;

– nhiệt độ phản ứng trong ống teflon thể tích 1 ml là 50 ⁰C;

– tốc độ dòng của tác nhân axit hoá [dung dịch axit axetic 1M (3.1)]: 0,4 ml/min.

5.3.3 Dựng đường chuẩn

Bơm các dung dịch PSP chuẩn nồng độ từ 0,1 mg/ml đến 1 mg/ml (3.6) vào HPLC. Dựng đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ nhận được. Khi đường chuẩn tuyến tính và đi qua gốc tọa độ thì trong các lần phân tích sau này, chỉ sử dụng một dung dịch chuẩn có hàm lượng PSP gần với hàm lượng có trong mẫu. Đường chuẩn lúc này được xây dựng từ độ hấp thụ của dung dịch sử dụng và gốc toạ độ.

5.3.4 Xác định độc tố PSP

Bơm các dung dịch mẫu đã chuẩn bị theo 5.2 vào HPLC. Mỗi dung dịch mẫu được bơm 2 lần. Tính độ hấp thụ trung bình cho mỗi dung dịch mẫu theo diện tích pic tương ứng.

Bơm các dung dịch chuẩn vào HPLC với tần suất 2 h bơm 1 lần.

6. Tính kết quả

6.1 Hàm lượng của từng loại độc tố PSP (ngoại trừ độc tố nhóm C)

Hàm lượng của từng loại độc tố PSP (ngoại trừ độc tố nhóm C) trong mẫu thử nhuyễn thể hai mảnh vỏ, C_PSP, được tính bằng microgam trên 100 gam (mg/100 g) theo công thức sau:

                                        (1)

trong đó

A_S là độ hấp thụ trung bình của dung dịch mẫu thử, tính theo diện tích pic;

A_C là độ hấp thụ trung bình của dung dịch PSP chuẩn (3.10) có nồng độ C_C, tính theo diện tích pic;

C_C là nồng độ của dung dịch PSP chuẩn (3.10), tính bằng microgam trên mililit (mg/ml).

w_S là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích dịch chiết thu được (xem 5.2.1.1) tương ứng với lượng mẫu thử đã lấy, tính bằng mililit (ml) (V=2 ml tương ứng với w_s= 1,0 g)

F là hệ số pha loãng của dung dịch mẫu thử trước khi đưa vào HPLC.

6.2 Hàm lượng độc tố PSP nhóm C

6.2.1 Hàm lượng độc tố C1

Hàm lượng độc tố C1 trong mẫu thử nhuyễn thể hai mảnh vỏ, C_C1, được tính bằng microgam trên 100 gam (mg/100 g) theo công thức sau:

                                                        (2)

trong đó

C₂ là hàm lượng độc tố GTX2 sau quá trình thủy phân (xem 5.2.2), tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

C₂₀ là hàm lượng độc tố GTX2 trước quá trình thủy phân, tính bằng microgam trên 100 gam (mg/100g).

6.2.2 Hàm lượng độc tố C2

Hàm lượng độc tố C2 trong mẫu thử nhuyễn thể hai mảnh vỏ, C_C2, được tính bằng microgam trên 100 gam (mg/100 g) theo công thức sau:

                                                        (3)

trong đó

C₃ là hàm lượng độc tố GTX3 sau quá trình thủy phân (xem 5.2.2), tính bằng microgam trên 100 gam (mg/100 g).

C₃₀ là hàm lượng độc tố GTX3 trước quá trình thủy phân, tính bằng microgam trên 100 gam (mg/100 g).

6.3 Hàm lượng độc tố PSP tổng số

Hàm lượng độc tố PSP tổng số trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng tổng hàm lượng của các loại độc tố đã định lượng được.

7. Độ lặp lại và độ thu hồi

7.1 Độ lặp lại

Độ lệch chuẩn lặp lại, CV_s, tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liên tiếp của cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

7.2 Độ thu hồi

Độ thu hồi, R, được xác định bằng cách đo 5 mẫu chuẩn đã biết chính xác hàm lượng độc tố PSP (3.10). Độ thu hồi thu được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Intergovernmental Oceanographic Commission, IOC Manuals & Guides No. 33, 1995, Manual on Harmful Marine Microalga, p.81-94.