TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8180-1:2009 (ISO 9233-1 : 2007) VỀ PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ ĐỐI VỚI CÙI PHOMAT

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8180-1 : 2009

ISO 9233-1 : 2007

PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ ĐỐI VỚI CÙI PHOMAT

Cheese, cheese rind and processed cheese – Determination of natamycin content – Part 1 : Molecular absorption spectrometric method for cheese rind

Lời nói đầu

TCVN 8180-1 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 9233-1 : 2007;

TCVN 8180-1 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8180 (ISO 9233) gồm các tiêu chuẩn sau:

– TCVN 8180-1 : 2009 (ISO 9233-1 : 2007) Phomat, cùi phomat và phomat chế biến – Xác định hàm lượng natamyxin – Phần 1 : Phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử đối với cùi phomat;

– TCVN 8180-2 : 2009 (ISO 9233-2 : 2007) Phomat, cùi phomat và phomat chế biến – Xác định hàm lượng natamyxin – Phần 2 : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đối với phomat, cùi phomat và phomat chế biến.

PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN

PHẦN 1 : PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ ĐỐI VỚI CÙI PHOMAT

Cheese, cheese rind and processed cheese – Determination of natamycin content – Part 1: Molecular absorption spectrometric method for cheese rind

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng natamyxin cao hơn 0,5 mg/kg trong cùi phomat và hàm lượng natamyxin cao hơn 0,03 mg/dm² liên quan đến diện tích bề mặt.

CHÚ THÍCH  Phương pháp này có thể dùng để phát hiện natamyxin có trong phomat.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1

Hàm lượng natamyxin (natamycin content)

Phần khối lượng của các chất xác định được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH  Hàm lượng natamyxin được tính bằng miligam trên kilogram.

2.2

Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt trong cùi phomat (surface-area-related natamycin mass in cheese rind)

Phần khối lượng của các chất liên quan đến diện tích bề mặt xác định được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH   Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt được tính bằng miligam natamyxin trên decimet vuông cùi phomat

2.3. Cùi phomat

Lớp ngoài của phomat có bề dày 5 mm, ngoại trừ lớp bao phủ, nếu có.

3. Nguyên tắc

Phần mẫu thử đã biết được chiết bằng metanol. Dịch chiết được pha loãng bằng nước rồi được làm lạnh đến khoảng từ âm 15 ^oC đến âm 20 ^oC để làm kết tủa hết tất cả chất béo, rồi lọc. Hàm lượng natamyxin hoặc lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt được xác định trong dịch lọc (sau khi cô đặc, nếu cần) bằng phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1. Metanol (CH₃OH).

4.2. Metanol, dung dịch trong nước

Trộn 2 thể tích metanol (4.1) với 1 thể tích nước.

4.3. Dung dịch chuẩn natamyxin

4.3.1. Dung dịch chuẩn gốc natamyxin, nồng độ 500 mg/l

Ngay trước khi sử dụng, hòa tan trong metanol (4.1) một lượng chế phẩm natamyxin đã biết trước hàm lượng natamyxin, tương ứng với 50mg natamyxin tinh khiết (C₃₃H_47­NO₁₃) trong bình định mức một vạch 100 ml (5.1). Thêm nước đến vạch và trộn.

4.3.2. Dung dịch chuẩn làm việc natamyxin, nồng độ 5 mg/l

Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc natamyxin (4.3.1) cho vào bình định mức một vạch 50 ml (5.1). Pha loãng bằng dung dịch metanol trong nước (4.2) đến vạch và trộn.

Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch đã pha loãng này cho vào bình định mức một vạch 50 ml (5.1). Pha loãng bằng dung dịch metanol trong nước (4.2) đến vạch và trộn. Nồng độ natamyxin của dung dịch chuẩn làm việc này là 5 µg/ml.

Nồng độ này phải gần bằng nồng độ của dung dịch thử đo được trong 8.3.3. Chỉnh dung dịch chuẩn làm việc này bằng cách dùng pipet và pha loãng một lượng khác, nếu cần.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1. Bình định mức một vạch, dung tích 50 ml và 100 ml.

5.2. Máy thái hoặc dụng cụ tương tự, có thể cắt các phần phomat dày 5 mm và rộng khoảng 30 mm (xem ví dụ ở Hình A.1)

5.3. Máy cắt, có thể cắt mỏng các lát phomat dày 1 mm (xem ví dụ ở Hình A.2).

5.4. Máy nghiền hoặc máy trộn.

5.5. Dao sắc, có thể cắt được các lát phomat thành các miếng nhỏ.

5.6. Máy khuấy từ hoặc máy lắc.

5.7. Bình nón, dung tích 100 ml và 200 ml , bằng thủy tinh màu và được đậy bằng nút thủy tinh mài.

5.8. Xyranh, dung tích 10 ml, loại dùng một lần.

5.9. Màng lọc micro, cỡ lỗ 0,20 µm đến 0,45 µm, bền với các dung dịch cồn.

5.10. Giấy lọc gấp nếp, tốc độ nhanh, đường kính 150 mm (ví dụ: S và S số 595 1/2)1)

5.11. Phễu chiết, đường kính khoảng 70 mm.

5.12. Tủ đông lạnh, có thể làm đông lạnh ở khoảng từ âm 15 ^oC đến âm 20 ^oC.

5.13. Cột chiết, để cô đặc dịch lọc, nếu cần [ví dụ: Sep-pac C18¹⁾ hoặc Waters số

51910¹⁾].

5.14. Máy đo phổ, thích hợp để ghi phổ UV ở bước song từ 300 nm đến 340 nm, có các cuvet 10 mm và máy ghi.

5.15. Bình đựng mẫu, có dung tích thích hợp.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Mẫu phòng thử nghiệm phải là phomat nguyên hoặc phần phomat đại diện cho cả khối phomat.

7. Chuẩn bị mẫu thử

7.1. Cùi phomat

Cắt mẫu thử thành các phần hoặc các phần nhỏ sao cho chiều rộng của cùi phomat không lớn hơn 30 mm, nếu cần. Dùng máy thái (5.2) loại ra toàn bộ cùi từ tất cả các phần thu được bằng cách cắt miếng có bề dày tối đa 5 mm.

Từ phần cùi thu được, cắt bằng dao sắc (5.5), cắt các lát hình chữ nhật có diện tích từ 2 dm² đến 4 dm². Xác định diện tích bề mặt, tính theo decimet vuông và khồi lượng của nó tính theo kilogram.

Dùng máy nghiền (5.4) cẩn thận nghiền toàn bộ cùi, cả các miếng đã cân và đã đo rồi trộn kỹ. Chuyển ngay phần mẫu thử đã chuẩn bị này sang bình đựng mẫu (5.15).

Sau khi chuẩn bị xong mẫu thử, rửa sạch tất cả các dụng cụ đã tiếp xúc với mẫu bằng nước nóng rồi sau đó bằng metanol (4.1). Làm khô các dụng cụ đã rửa, ví dụ: dùng luồng không khí nén.

7.2. Lõi phomat

Sau khi đã loại bỏ cùi (7.1), dùng máy cắt (5.3) loại bỏ một lớp tối đa 1 mm từ phần đã cắt bỏ cùi của mẫu phomat.

Cắt tất cả các lát phomat thành các miếng nhỏ khoảng 50 mm² và trộn kỹ. Chuyển ngay phần mẫu thử đã chuẩn bị này sang bình đựng mẫu (5.15).

Sau khi chuẩn bị xong mẫu thử, rửa sạch tất cả các dụng cụ đã tiếp xúc với mẫu bằng nước nóng rồi sau đó bằng metanol (4.1). Làm khô các dụng cụ đã rửa, ví dụ: dùng luồng không khí nén.

8. Cách tiến hành

8.1. Phần mẫu thử

8.1.1. Cùi phomat

Cân khoảng 10,00 g mẫu thử (7.1), chính xác đến 10 mg, cho vào bình nón dung tích 200 ml (5.7)

8.1.2. Lõi phomat

Cân khoảng 5,00 g mẫu thử (7.2), chính xác đến 10 mg, cho vào bình nón dung tích 100 ml (5.7).

8.2. Chuẩn bị dung dịch thử.

8.2.1. Cùi phomat.

8.2.1.1. Bước ban đầu

Cho 100 ml metanol (4.1) vào phần mẫu thử trong bình nón (8.1.1). Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa trong bình nón trong 90 min hoặc lắc 90 min trên máy lắc (5.6)

Thêm 50 ml nước. Đặt ngay bình nón vào tủ đông lạnh (5.12) khoảng 60 min.

8.2.1.2. Lọc

Lọc dịch chiết lạnh qua giấy lọc gấp nếp (5.10) trong khi đó loại bỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên. Lọc khi huyền phù khi còn lạnh để tránh làm tan chất béo và chất béo sẽ bị đục.

Đưa dịch lọc về nhiệt độ phòng. Dùng xyranh (5.8) lấy phần dịch lọc. Lọc qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,45 µm (5.9) rồi lọc tiếp qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,20 µm (5.9).

Lượng dung dịch mẫu thử (dịch lọc) tối thiểu là 3 ml để đo trực tiếp (8.3.3) và 25 ml hoặc 50 ml để đo nồng độ cao gấp 5 hoặc 10 lần (8.3.4) tương ứng.

8.2.2. Lõi phomat

8.2.2.1. Bước ban đầu

Dùng ống đong lấy 50 ml metanol (4.1) cho vào phần mẫu thử trong bình nón (8.1.2). Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa trong bình nón trong 90 min hoặc lắc 90 min  trên máy lắc (5.6).

Dùng ống đong cho thêm 25 ml nước. Đặt ngay bình nón vào tủ đông lạnh (5.12) khoảng 60 min.

8.2.2.2. Lọc

Tiến hành lọc như trong 8.2.1.2.

8.3. Xác định

8.3.1. Xác định và giới hạn phát hiện

Phòng thử nghiệm sử dụng phương pháp sẽ thiết lập giới hạn phát hiện và xác định trong các điều kiện thiết bị của mình sử dụng phương pháp tính toán đã được công nhận để xác nhận rằng hàm lượng natamyxin cần xác định xuống đến 0,5 mg/kg và 0,03 mg/dm².

8.3.2. Độ hấp thụ UV của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin

Ghi lại phổ của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (4.3.2) trong dải từ 300 nm đến 340 nm. Đo độ hấp thụ của natamyxin tối đa ở khoảng 317 nm, tối thiểu ở khoảng 311 nm và chính xác ở 329 nm. Sử dụng metanol (4.2) làm dung dịch thử trắng.

Một ví dụ về phổ của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin được nêu trong Hình A.3

Vì natamyxin không ổn định trong dung dịch metanol, do đó cần tiến hành phép đo ngay khi có thể.

8.3.3. Dung dịch thử

Ghi lại phổ của các dung dịch thử (8.2.1.2  hoặc 8.3.4.2 và 8.2.2.2) với metanol (4.2) làm mẫu trắng trong dải từ 300 nm đến 340 nm. Ngoài ra, ghi lại phổ của dung dịch thử cùi phomat (8.2.1.2 hoặc 8.3.4.2) với dung dịch thử lõi phomat (8.2.2.2) làm mẫu trắng trong cùng dải bước sóng.

Ghi lại độ hấp thụ của dung dịch thử cùi phomat (8.2.1.2 hoặc 8.3.4.2) với dung dịch thử lõi phomat (8.2.2.2) làm mẫu trắng ở độ hấp thụ tối đa ở khoảng 317 nm và tối thiểu ở khoảng 311 nm và chính xác ở 329 nm. Các ví dụ về phổ của dung dịch thử được đưa ra trong Hình A.4.

Nếu hàm lượng natamyxin của mẫu thử (7.1) rất thấp mà không thể phát hiện được hoặc gần như không thể phát hiện được (tỷ lệ tín hiệu-nhiễu nhỏ hơn 3), nhưng vẫn cần phải xác định thì tiến hành theo 8.3.4.

CHÚ THÍCH Sự có mặt của gia vị, cụ thể là hạt tiêu, trong phomat có thể gây nhiễu cho kết quả, mà có thể cho thấy méo rõ trên đường hấp thụ. Các ví dụ về phổ của các dung dịch thử khác nhau của phomat được nêu trong Hình A.4.

8.3.4. Hàm lượng natamyxin thấp

8.3.4.1. Cô đặc

Nên quyết định có cần phải cô đặc khoảng 5 lần hoặc 10 lần hay không. Dựa vào quyết định về kết quả thu được trong 8.3.3 và trên giới hạn phát hiện yêu cầu.

Sau đó dùng pipet lấy 25 ml hoặc 50 ml (đối với cô đặc 5 lần hoặc 10 lần tương ứng) của phần mẫu thử (8.2.1.2) cho vào cốc có mỏ. Thêm 50 ml hoặc 100 ml nước tương ứng, tùy thuộc vào việc cô đặc yêu cầu và trộn.

Hoạt hóa ống chiết (5.13) bằng cách dùng 3 ml đến 5 ml metanol (4.1). Rồi rửa bằng 10 ml nước.

Cho dung dịch mẫu thử đã pha loãng đi qua ống này ở tốc độ 3 ml/min đến 5 ml/min bằng xyranh (5.8). Dùng xyranh (5.8) tráng cột bằng 10 ml nước. Rửa giải natamyxin bằng 3 ml metanol (4.1), bằng xyranh (5.8).

8.3.4.2. Đo phổ

Thêm 1,5 ml nước vào dịch rửa giải (8.3.4.1) và trộn. Hút dung dịch vào xyranh (5.8). Lọc dung dịch qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,45 µm (5.9) rồi lọc tiếp qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,20 µm (5.9)

Tiến hành tiếp theo 8.3.3.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Tính hàm lượng natamyxin

Hàm lượng natamyxin của mẫu thử, w, tính bằng miligam trên kilogram, theo công thức (1) sau đây:

W =          (1)

trong đó

A_t là chênh lệch độ hấp thụ thực của dung dịch mẫu thử cùi phomat đo được dựa theo dung dịch thử của lõi phomat ở 317 nm (8.3.3);

c_n  là nồng độ natamyxin trong dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (4.3.2), tính bằng microgram trên mililit (µg/ml);

V là tổng thể tích dung dịch mẫu thử (8.2.1.2), tính bằng mililit (ml);

A_s  là giá trị độ hấp thụ thực của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin ở 317 nm (8.3.2);

m là khối lượng phần mẫu thử (8.1), tính bằng gam (g).

9.2. Tính độ hấp thụ

A_s có thể được lấy từ phổ UV của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (xem ví dụ ở Hình A.3), sử dụng đường thẳng giữa độ hấp thụ ở 311 nm và ở 329 nm là đường nền hoặc có thể tính được theo công thức (2) sau đây:

A_s = A_s1 –                    (2)

trong đó

A_s1 là độ hấp thụ tối đa của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (8.3.2) ở bước sóng 317 nm;

A_s2 là độ hấp thụ tối thiểu của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (8.3.2) ở bước sóng 311 nm;

A_s3 là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (8.3.2) ở bước sóng 329 nm;

A_t có thể được lấy từ phổ UV của dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat, sử dụng đường thẳng giữa độ hấp thụ ở 311 nm và ở 329 nm là đường nền hoặc có thể tính được theo công thức (3) sau đây:

A_t = A_t1 –               (3)

trong đó

A_t1 là độ hấp thụ tối đa của dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat ở bước sóng 317 nm (8.3.3);

A_t2 là độ hấp thụ tối thiểu của dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat ở bước sóng 311 nm (8.3.3);

A_t3 là độ hấp thụ của dung dịch thử cùi phomat dựa vào dung dịch thử lõi phomat ở bước sóng 329 nm (8.3.3);

9.3. Tính lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt

Lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt, m_A,n tính bằng miligam trên decimet vuông, theo công thức (4) sau đây:

m_A,n = W x       (4)

trong đó

W là khối lượng natamyxin của phần mẫu thử (9.1), tính bằng miligam trên kilogram (mg/kg);

m là khối lượng của phần mẫu thử đã cân (7.1), tính bằng kilogram (kg);

A là diện tích của phần mẫu thử đã cân (7.1) tính bằng decimet vuông (dm²).

9.4. Hiệu chỉnh kết quả

Nếu phần dịch lọc đã được cô đặc như trong 8.3.4, thì chỉnh các kết quả thu được đối với w (9.1) và m_A,n (9.3) như sau:

a) khi cô đặc khoảng 5 lần thì chia kết quả thu được cho 5,6 và

b) khi cô đặc khoảng 10 lần thì chia kết quả thu được cho 11,1.

Nếu cần phải xác định lặp lại hai lần và với điều kiện đáp ứng được các yêu cầu về độ lặp lại, thì lấy hàm lượng natamyxin cuối cùng của mẫu thử là trung bình kết quả của hai lần xác định theo Điều 10, làm tròn kết quả đến một chữ số thập phân.

9.5. Biểu thị kết quả

Biểu thị các kết quả thu được đến một chữ số thập phân.

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm này phù hợp với ISO 5725 : 1986)^[2] (đối với các kết quả, xem [4]).

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị nêu trong Bảng B.1

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị nêu trong Bảng B.1.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

e) kết quả thử nghiệm thu được và nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các ví dụ

Kích thước tính bằng milimet

CHÚ DẪN

1 Phomat

2 Dao

3 Cùi

4 Trục

Hình A.1 – Ví dụ về máy thái để cắt các phần mẫu thử cùi phomat có bề dày 5 mm (5.2)

Hình A.2 – Ví dụ về máy cắt để cắt các phần mẫu thử cùi phomat có bề dày 1 mm (5.3)

CHÚ DẪN

A độ hấp thụ

l bước sóng

1 mẫu

2 mẫu trắng

Hình A.3 – Ví dụ về phổ của dung dịch chuẩn natamyxin và dung dịch trắng

CHÚ DẪN

A độ hấp thụ

l bước sóng

AU đơn vị hấp thụ

Hình A.4 – Ví dụ về phổ của các dung dịch thử khác nhau

CHÚ DẪN

A độ hấp thụ

l bước sóng

Hình A.5 – Ví dụ về phổ UV của các mẫu chứa natamyxin

Phụ lục B

(Tham khảo)

Kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm

Các kết quả thử nghiệm cộng tác thu được phù hợp với ISO 5725 : 1986, do 36 phòng thử nghiệm tham gia thực hiện năm 1984 sử dụng tấm mẫu.

Các giá trị tính bằng miligam trên decimet vuông, được tính từ các giá trị tính theo miligam trên kilogram đối với cùi phomat dày 5 mm và tỷ trọng 1,3 g cm³.

Bảng B.1 – Các số liệu về độ chụm

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] ISO 5725 : 1986, Độ chính xác của phương pháp thử. Xác định độ lặp lại và độ tái lập đối với phương pháp thử chuẩn bởi các phép thử liên phòng thử nghiệm.

[3] DERUIG. WG.,VAN OoSTROM. J.J., LEENHEER, K. Spectrometry and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese rind. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987,70, pp 944-8.

[4] DERUIG, W.G. Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study. J.Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 949-54.