TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8108:2009 (ISO 11285 : 2004) VỀ SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA – PHƯƠNG PHÁP ENZYM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8108 : 2009

ISO 11285 : 2004

SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA – PHƯƠNG PHÁP ENZYM

Milk – Determination of lactulose content – Enzymatic method

Lời nói đầu

TCVN 8108 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 11285 : 2004;

TCVN 8108 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA – PHƯƠNG PHÁP ENZYM

Milk – Determination of lactulose content – Enzymatic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactuloza trong sữa.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1.

Hàm lượng lactuloza (lactulose content)

Khối lượng của các chất xác định được theo quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Hàm lượng lactuloza được biểu thị theo số miligam trên kilogam.

3. Nguyên tắc

Chất béo và protein được kết tủa bằng cách bổ sung dung dịch kẽm sulfat và dung dịch kali hexaxyanoferat (II), sau đó lọc bỏ kết tủa. Lactoza và lactuloza lần lượt được thủy phân thành galactoza và glucoza hoặc galactoza và fructoza, khi có mặt enzym b-D-galactosidaza (b–gal). Từ lượng fructoza được giải phóng tính được lượng lactuloza.

lactoza + H₂O   galactoza + glucoza                           (1)

lactoza + H₂O   galactoza + fructoza                           (2)

Lượng lactoza có trong sữa cao hơn nhiều so với lactuloza. Vì vậy, glucoza sinh ra sau khi thủy phân sẽ gây nhiễu việc xác định fructoza. Do đó, hầu hết glucoza được oxy hóa thành axit gluconic bởi glucoza oxidaza (GOD) với sự có mặt của oxy:

glucoza + H₂O + O₂  axit gluconic + H₂O₂                      (3)

Bằng phương pháp này có thể xác định những lượng nhỏ lactuloza khi có mặt một lượng vượt trội lactoza. Hydro peroxit sinh ra trong phản ứng (3) được phân hủy bởi catalaza. Phản ứng này được sử dụng để cung cấp khí oxy cho phản ứng oxy hóa glucoza:

2 H₂O₂   2 H₂O + O₂                                                  (4)

Lượng glucoza chưa bị oxy hóa còn lại và lượng fructoza sinh ra từ phản ứng thủy phân lactuloza được phosphoryl hóa bằng cách sử dụng adenozin triphosphat (ATP) với sự có mặt của hexokinaza (HK) để tạo ra glucoza-6-phosphat và fructoza-6-phosphat tương ứng.

glucoza + ATP  glucoza-6-phosphat + ADP                   (5)

fructoza + ATP  fructoza-6-phosphat + ADP                  (6)

Glucoza-6-phosphat được oxy hóa bằng cách sử dụng NADP⁺ với sự có mặt của glucoza-6-phosphat dehydrogenaza, sản phẩm của phản ứng là 6-phosphogluconat và NADPH. Sau khi kết thúc phản ứng NADPH tạo thành được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm.

glucoza-6-phosphat + NADP⁺  6-phosphogluconat + NADPH + H⁺                                    (7)

Fructoza-6-phosphat được đồng phân hóa thành glucoza-6-phosphat với sự có mặt của enzym phosphoglucoza-izomeraza (PGI). Glucoza-6-phosphat được oxy hóa theo phản ứng (7). Lượng NADPH tăng lên được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, lượng NADPH này tương ứng với hàm lượng fructoza và lactuloza.

fructoza-6-phosphat  glucoza-6-phosphat                     (8)

Để xác định fructoza tự do có thể có trong mẫu ban đầu, tiến hành xác định với một mẫu trắng mà không thêm b-galactosidaza. Giá trị đối chứng này được trừ đi vào công thức cuối cùng xác định hàm lượng lactuloza của mẫu thử.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích.

Các thuốc thử dùng để xác định fructoza (4.15 đến 4.18) là các hợp chất thử nghiệm có bán sẵn. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1. Nước sử dụng để chuẩn bị các dung dịch enzym và các dung dịch đệm là nước mới được chưng cất hai lần bằng dụng cụ thủy tinh. Nước sử dụng cho các mục đích khác là nước cất bằng dụng cụ thủy tinh hoặc ít nhất có độ tinh khiết tương đương.

4.2. Dung dịch kẽm sulfat, r (ZnSO₄) = 300 g/l.

Hòa tan 30,0 g kẽm sulfat ngậm bảy phân tử nước (ZnSO₄.7H₂0) bằng nước đựng trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (5.2). Thêm nước đến vạch và trộn.

4.3. Dung dịch kali hexaxyanoferat (II), r (K₄[Fe(CN)₆]) = 150 g/l.

Hòa tan 15,0 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (K₄[Fe(CN)₆].3H₂O) bằng nước đựng trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (5.2). Thêm nước đến vạch và trộn.

4.4. Dung dịch đệm A, pH = 7.5

Hòa tan 4,80 g dinatri hydrophosphat (Na₂HPO₄), 0,86 g natri dihydrophosphat ngậm một phân tử nước (NaH₂PO₄.H₂O) và 0,10 g magiê sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄.7H₂O) vào 80 ml nước (4.1). Chỉnh pH đến 7,5 ± 0,1 ở nhiệt độ 20 °C bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/l (4.10), nếu cần. Thêm nước đến 100 ml và trộn (đủ cho khoảng 15 lần phân tích).

4.5. Dung dịch đệm B, pH = 7,6

Hòa tan 14,00 g trietanolamin hydroclorua [N(CH₂CH₂OH)₃.HCl] và 0,25 g magiê sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄.7H₂O) vào 80 ml nước (4.1).

Chỉnh pH đến 7,6 ± 0,1 ở nhiệt độ 20 °C bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/l (4.10), nếu cần. Thêm nước đến 100 ml và trộn (đủ cho khoảng 60 lần phân tích).

4.6. Dung dịch đệm C

Pha loãng 40,0 ml dung dịch đệm B (4.5) bằng nước đến 100 ml và trộn (cho khoảng 50 lần phân tích).

4.7. Natri hydro cacbonat (NaHCO₃).

4.8. Hydro peroxit (H₂O₂), 30% (khối lượng).

4.9. Octan-1-ol (C₈H₁₈O).

4.10. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,33 mol/l và 1 mol/l.

4.11. b-D-galactosidaza (b-gal), có nguồn gốc từ E. coli (b-gal EC 3.2.1.23), huyền phù 5 mg/ml trong dung dịch amoni sulfat [(NH₄)₂SO₄] 3,2 mol/l, chứa 30 đơn vị trên miligam (ở 25 °C với cơ chất lactoza) và 300 đơn vị trên miligam [ở 37 °C với cơ chất 2-nitrophenyl-b-D-galactozid (o-nitrophenyl-b-D-galactopyranosid)], tương ứng.

4.12. Glucoza oxydaza (GOD, có nguồn gốc từ Aspergillus niger (EC 1.1.3.4), độ tinh khiết cấp II, dạng đông khô, chứa 200 đơn vị trên miligam (ở 25 °C với cơ chất glucoza) hoặc 230 đơn vị trên miligam (ở 37 °C với cơ chất glucoza).

4.13. Dung dịch oxy hóa

Hòa tan 20 mg glucoza oxidaza (4.12) trong 1 ml nước. Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng.

4.14. Catalaza, từ gan bò (EC 1.11.1.6), huyền phù 20 mg/ml trong nước (đã ổn định), chứa 65 000 đơn vị trên miligam (ở độ 25 °C với cơ chất H₂O₂).

4.15. Hexokinaza/glucoza-6-phosphat-dehydrogenaza (HK/G6P-DH) hỗn hợp của các enzym từ nấm men (EC 2.7.1.1 và EC 1.1.1.49), huyền phù trong dung dịch amoni sulfat ([NH₄]₂SO₄) 3,2 mol/l, HK và G6P-DH:

– HK: 2 mg/ml; 140 đơn vị trên miligam (ở 25 °C với cơ chất glucoza và ATP);

– G6P-DH: 1 mg/ml; 140 đơn vị trên miligam (ở 25 °C với cơ chất glucoza-6-phosphat).

4.16. Phosphoglucoza izomeraza (PGI), từ nấm men (EC 5.3.1.9).

Huyền phù trong dung dịch amoni sulfat ([NH₄]₂SO₄) 3,2 mol/l;

– PGI: 2 mg/ml; 350 đơn vị trên miligam (ở nhiệt độ 25 °C với cơ chất fructoza-6-phosphat).

CHÚ THÍCH 1  Các số EC trong 4.11, 4.12, 4.14 đến 4.16 đề cập đến số Phân loại enzym do Ủy ban Danh pháp của Hội Hóa sinh quốc tế quy định.

CHÚ THÍCH 2  Đơn vị được đề cập trong 4.11, 4.12, 4.14 đến 4.16 [thường được gọi là Đơn vị quốc tế (International Unit) hay Đơn vị chuẩn (Standard Unit) được xác định theo lượng enzym xúc tác để chuyển hóa 1 mmol cơ chất trong một phút ở các điều kiện chuẩn.

4.17. Dung dịch ATP

Hòa tan 50 mg muối dinatri adenozin-5-triphosphat (5-ATP-Na₂) và 50 mg natri hydrocacbonat (NaHCO₃) trong 1 ml nước.

4.18. Dung dịch NADP

Hòa tan 10 mg muối dinatri b-nicotinamid adenin dinucleotits phosphat (b-NADP-Na₂) trong 1 ml nước.

5. Thiết bị dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g.

5.2. Bình định mức một vạch, dung tích 10 ml, 20 ml và 100 ml.

5.3. Bình nón, có nút thủy tinh mài, dung tích 50 ml.

5.4. Phễu, đường kính 50 mm.

5.5. Giấy lọc gấp nếp, tốc độ dòng trung bình, đường kính 125 mm và 70 mm.

5.6. Nồi cách thủy hoặc tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ 40 °C ± 2 °C.

5.7. Máy đo phổ, thích hợp để đo ở bước sóng 340 nm.

Có thể sử dụng máy đo quang có bộ lọc đường phổ thích hợp để đo ở bước sóng 365 nm và 334 nm (đèn thủy ngân). Hệ số hấp thụ phân tử của NADPH (xem 9.1) là 3,4 (ở bước sóng 365 nm) hoặc 6,18 (ở bước sóng 334 nm) (l.mmol^-1.cm^-1).

5.8. Cuvet, làm bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo, có chiều dài đường quang 10,0 mm.

Trong trường hợp sử dụng cuvet bằng chất dẻo thì cần kiểm tra chiều dài đường quang.

5.9. Pipet, dung tích 20 ml, 50 ml, 100 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml và 10 ml, thích hợp để phân tích enzym.

5.10. Pipet chia độ, dung tích 2 ml và 10 ml.

5.11. Que khuấy, dùng để trộn dung dịch cuvet.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hay bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

7. Chuẩn bị mẫu thử

Trộn kỹ mẫu thử để thu được mẫu đại diện.

Chuẩn bị mẫu thử cho phép thử trắng, xem 8.6.

8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị dung dịch thử

Cân khoảng 50g mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 7), chính xác đến 0,001 g, vào bình định mức một vạch dung tích 100 ml (5.2). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

8.2. Làm sạch

Dùng pipet (5.10), thêm 10,0 ml dung dịch thử (8.1) vào bình nón 50 ml (5.3). Lần lượt thêm các dung dịch sau, mỗi lần dùng một pipet khác nhau: 1,75 ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (4.3), 1,75 ml dung dịch kẽm sulfat (4.2) và 6,5 ml dung dịch đệm A (4.4), xoay bình sau mỗi lần thêm. Lọc dung dịch thu được qua giấy lọc gấp nếp (5.5) đường kính 125 mm. Loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên.

B.3. Thủy phân lactoza lactuloza

Dùng pipet lấy 5,0 ml dịch lọc thu được (8.2) cho vào bình định mức một vạch dung tích 10 ml (5.2). Dùng pipet (5.9), thêm 50 ml b-D-galactosidaza (4.11). Đậy nắp bình và trộn. Ủ bình định mức trên nồi cách thủy hoặc trong tủ sấy (5.6) ở nhiệt độ 40 °C trong ít nhất 10h (để qua đêm).

8.4. Oxy hóa glucoza

Dùng pipet quy định (5.9), thêm vào dung dịch thủy phân (8.3) lần lượt: 2,0 ml dung dịch đệm C (4.6), 100 ml dung dịch oxy hóa (4.13), 1 giọt chất chống tạo bọt octan-1-ol (4.9), 0,5 ml dung dịch natri hydroxit 0,33 mol/l (4.10) để trung hòa axit gluconic mới sinh ra, 50 ml hydro peroxit (4.8) và 0,1 ml catalaza (4.14), trộn sau mỗi lần thêm. Ủ hỗn hợp thu được trên nồi cách thủy hoặc trong tủ sấy (5.6) ở nhiệt độ 40 °C trong hơn 3h.

8.5. Lọc

Sau khi ủ (8.4), pha loãng hỗn hợp bằng nước đến 10 ml và trộn. Lọc qua giấy lọc gấp nếp đường kính 70 mm (5.5). Loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên.

8.6. Phép thử trắng

Thực hiện phép thử trắng. Tiến hành như quy định trong 8.2 đến 8.5 đối với mẫu thử nhưng không thêm b-D-galactosidaza.

8.7. Xác định glucoza và fructoza

Tiến hành theo quy định trong Bảng 1.

Bảng 1 – Xác định glucoza và fructoza

Nếu độ hấp thụ của 1 ml dịch lọc tăng vượt quá 1,3 thì giảm thể tích lọc mẫu thử (8.5) và tăng thêm nước sao cho tổng thể tích của dịch lọc và nước bằng 2,00 ml. Thay thể tích của dịch lọc mẫu trắng 8.6) giống như dịch lọc mẫu thử.

Độ hấp thụ tốt nhất nên nằm trong dải từ 0,1 đơn vị đến 1,0 đơn vị, và 0,05 là giá trị nhỏ nhất có thể chấp nhận được.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Tính

9.1.1. Chênh lệch độ hấp thụ

9.1.1.1. Mẫu thử

Tính chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử, DA_s, theo công thức:

DA_s = (A₃ – A₂)

trong đó

A₂ là giá trị độ hấp thụ thu được sau khi thêm hexokinaza/glucoza-6-phosphat-dehydrogenaza (xem 8.7);

A₃ là giá trị độ hấp thụ thu được sau khi đồng phân hóa fructoza thành glucoza (xem 8.7).

9.1.1.2. Phép thử trắng

Tính chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng, DA_B, theo công thức:

DA_B = (A₃ – A₂)

9.1.1.3. Độ hấp thụ

Tính chênh lệch độ hấp thụ thực hiện liên quan đến hàm lượng lactuloza, DA_L, theo công thức:

DA_L = DA_s – DA_B

9.1.2. Hàm lượng lactuloza

Tính hàm lượng lactuloza, w, biểu thị theo số miligam lactuloza trên kilogam mẫu thử, theo công thức sau đây:

w =  x DA_L

trong đó

DA_L là giá trị độ hấp thụ tăng do sự tạo thành fructoza từ lactuloza (9.1.1.3);

M_L  là giá trị khối lượng phân tử tương đối của lactuloza (M_L = 324,3 g.mol^-1);

e là giá trị độ hấp thụ phân tử của NADPH ở bước sóng 340 nm, e = 6,3 (l.mmol^-1.cm^-1); độ hấp thụ phân tử ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm, xem 5.7;

V₁ là tổng thể tích chất lỏng trong cuvet (nghĩa là V1 = 3,240 ml) (8.7), tính bằng mililit (ml);

V₂ là thể tích của dịch lọc trong cuvet (nghĩa là V2 = 1,00 ml) (8.7), tính bằng mililit (ml);

d là độ dài đường quang của cuvet (nghĩa là d = 1,000 cm) (5.8), tính bằng centimet (cm);

m là khối lượng của phần mẫu thử (8.1), tính bằng gam (g).

9.2. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân.

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của một phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo ISO 5725 : 19861) và đã được công bố (xem [5] và [6]). Các giá trị nhận được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị trong cùng một khoảng thời gian ngắn như nhau, không quá 5% trường hợp lớn hơn các giá trị sau:

– đối với sữa UHT có hàm lượng lactuloza trung bình 278 mg/kg: r = 10,6 mg/kg; s₁ = 3,8 mg/kg;

– đối với sữa tiệt trùng có hàm lượng lactuloza trung bình 1044 mg/kg: r = 24,0 mg/kg; s₁ = 8,5 mg/kg.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thao tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5% các trường hợp lớn hơn các giá trị sau:

– đối với sữa UHT có hàm lượng lactuloza trung bình 278 mg/kg: R = 32,3 mg/kg; s_R = 11,4 mg/kg;

– đối với sữa tiệt trùng có hàm lượng lactuloza trung bình 1044 mg/kg: R = 77,2 mg/kg; s_R = 27,3 mg/kg.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được cho là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, và nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]  TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu

[2]  TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung

[3]  TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[4]  Enzyme Nomenclature Recommedations, Academic Press, New York, 1984

[5]  FEIER and GOETSCH. Milchwissenschaft, 45(7), 1990, pp. 440-441

[6]  Bundesgesundheitsblatt (BGB), April 1990, Nr.4, p. 176