TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8140:2009 (ISO 13493 :1998) VỀ THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CLORAMPHENICOL – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8140 : 2009

ISO 13493 :1998

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CLORAMPHENICOL – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG  HIỆU NĂNG CAO

Meat and meat products – Determination of chloramphenicol content – Method using liquid chromatography

Lởi nói đầu

TCVN 8140 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 13493 : 1998;

TCVN 8140 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Thịt và sản phẩm thịt – Xác định hàm lượng cloramphenicol – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Meat and meat products – Determination of chloramphenicol content – Method using liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol trong mô của cơ thịt, kể cả thịt gia cầm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng cloramphenicol lớn hơn 6,5 /kg.

Mẫu thử đã bị giảm chất lượng không thể phân tích được bằng phương pháp này.

CHÚ THÍCH Tiêu chuẩn này có thể dùng để xác định hàm lượng cloramphenicol trong tất cả các loại thịt và sản phẩm thịt. Tuy nhiên, các cơ thịt không đề cập trong phép thử cộng tác của phương pháp

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696 : 1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thử nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ, định nghĩa sau đây:

Hàm lượng cloramphenicol trong thịt và sản phẩm thịt (chloramphenicol content of meat and meat products): Phần khối lượng của cloramphenicol còn lại xác định được theo qui trình quy định trong tiêu chuẩn này

CHÚ THÍCH Hàm lượng cloramphenicol được biểu thị theo microgam trên kilogam.

4. Nguyên tắc

Phần mẫu thử được chiết bằng nước. Lọc và chiết pha rắn để tách thành phần chất béo ra khỏi dung dịch lỏng. Cloramphenicol được rửa giải ra khỏi cột bằng diclorometan. Pha hữu cơ được làm bay hơi và được tinh sạch bằng cách chiết pha lỏng-lỏng với nước và toluen. Cloramphenicol được đo bằng sắc ký pha đảo có detector UV.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ khi có qui định khác.

5.1. Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696 : 1987). Nước không chứa các hợp chất hữu cơ.

5.2. Nitơ, thích hợp để làm bay hơi dung môi.

5.3. Diclometan.

5.4. Toluen.

5.5. Dung dịch đệm axetat, c(CH₃CO₂Na) = 0,01 mol/l, pH = 4,3.

Hoà tan 0,82 g natri axetat khan trong khoảng 970 ml nước. Chỉnh pH đến 4,3 bằng axit axetic (CH₃CO₂H) loãng 50 % (khối lượng) bằng máy đo pH (6.1). Chuyển dung dịch vào bình định mức một vạch 1 000 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều.

5.6. Axetonitril, thích hợp cho đo phổ UV.

5.7. Pha động.

Thêm 750 ml dung dịch đệm axetat (5.5) vào 250 ml axetonitril (5.6) và trộn kỹ.

Trước khi sử dụng, lọc dịch rửa giải qua bộ lọc cỡ lỗ 0,22  (6.2) và khử khí.

5.8. Dung dịch gốc cloramphenicol, 100 .

Cân 10 mg cloramphenicol, chính xác đến 0,1 mg và chuyển vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng metanol đến vạch và trộn.

Dung dịch gốc bền trong 1 tháng khi được bảo quản ở nơi tối.

5.9. Dung dịch chuẩn cloramphenicol.

Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch gốc (5.8) cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

Chuẩn bị bốn dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml và 15,0 ml dung dịch này bằng nước để thu được các dung dịch có hàm lượng cloramphenicol 0,05 , 0,10 , 0,25 và 0,75 tương ứng.

Các dung dịch chuẩn này bền trong 1 tuần khi được bảo quản ở nơi tối.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau

6.1. Máy đo pH.

6.2. Bộ lọc màng, thể tích chết thấp và cỡ lỗ 0,22 .

6.3. Thiết bị đồng hoá bằng cơ hoặc bằng điện có khả năng đồng hoá mẫu phòng thử nghiệm.

Thiết bị này bao gồm: máy cắt quay tốc độ cao, hoặc máy xay có gắn tấm đục lỗ, đường kính lỗ không quá 4,0 mm.

6.4. Máy trộn phòng thử nghiệm (ví dụ bộ trộn nhu động1) hoặc máy Vortex).

6.5. Giấy lọc, loại định lượng, lọc tốc độ nhanh, đường kính khoảng 15 cm.

CHÚ THÍCH Ví dụ, Whatman số 41 đã được chứng minh là phù hợp ¹⁾

6.6. Ống chiết, có dung tích 20 ml, chứa điatomit, chiết được các thành phần ưa béo ra khỏi dung dịch nước

CHÚ THÍCH Extrelu® do Merck Darmstadt. Đức (Số 11737) sản xuất, đã được chứng minh là phù hợp ¹⁾

6.7. Nồi cách thuỷ hoặc bếp gia nhiệt, có thể duy trì được ở (40 ± 1) ^oC, có bộ phận sấy khô dùng nitơ (5.2); hoặc máy cô quay chân không.

6.8. Ống ly tâm, dung tích 25 ml.

6.9. Máy trộn Vortex, vận hành ở tốc độ quay khoảng 700 min^-1

6.10. Máy ly tâm, vận hành ở gia tốc quay khoảng 1 000 g.

6.11. Micropipet, dung tích 300 .

¹⁾ Đây là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin đưa ra để thuận lợi cho ngưởi sử dụng tiêu chuẩn và ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.

6.12. Máy Sắc ký lỏng, gồm:

– bơm có dòng cố định;

– bơm;

– cột C₈ hoặc C₁₈ pha đảo có đường kính trong 3 mm, dài 20 cm, cỡ hạt 5  hoặc cột có chất lượng tương đương;

– detector UV/VIS phù hợp cho phép đo ở bước sóng 285 nm; detector DAD (dùng để khẳng định), nếu sẵn có.

– máy ghi có dải đo thay đổi hoặc máy tích phân.

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo (ISO 3100 : 1991)2) [1].

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Lấy ít nhất 200 g mẫu đại diện. Bảo quản mẫu sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và không bị thay đổi thành phần.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Để mẫu đạt đến nhiệt độ phòng. Loại bỏ chất béo thừa và những phần không ăn được.

Đồng hoá mẫu phòng thử nghiệm bằng dụng cụ thích hợp (6.3). Chú ý để nhiệt độ của mẫu nguyên liệu không tăng quá 25 ^oC. Nếu sử dụng máy xay thịt, thì xay mẫu ít nhất hai lần.

Cho đầy mẫu đã chuẩn bị vào vật chứa có nắp đậy kín khí. Đậy nắp vật chứa và bảo quản sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và không bị thay đổi thành phần.

Bảo quản mẫu ở nhiệt độ dưới âm 18 ^oC, nếu cần.

Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, chỉ trong vòng 24 h sau khi đồng hóa.

9. Cách tiến hành

CHÚ THÍCH Nếu phải kiểm tra về giới hạn lặp lại (xem 11.2), thì tiến hành hai lần xác định đơn lẻ theo 9.1 đến 9.6

9.1. Yêu cầu chung

Phân tích dung dịch thử (hoặc dãy các dung dịch thử) đồng thời với phân tích mẫu trắng đã bổ sung hàm lượng cloramphenicol 10 /kg và một mẫu trắng.

9.2. Phần mẫu thử

Cân 10 g (m) mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 8), chính xác đến 0,1 g cho vào bình nón 100 ml.

9.3. Chuẩn bị dịch chiết

Thêm 40,0 ml nước và trộn kỹ trong 3 min bằng máy trộn phòng thử nghiệm (6.4).

Thể tích (V₁) của pha nước thu được là 40,0 ml cộng với thể tích nước trong phần mẫu thử (thường khoảng 7,5 ml nước trong 10 g mẫu).

Lọc mẫu qua giấy Iọc (6.5).

9.4. Chiết pha rắn

Chuyển 20,0 ml (V₂) dịch lọc vào ống chiết (6.6).

Sau (15 ± 0,2) min, rửa giải cloramphenicol bằng 70 ml diclometan (5.3). Cho bay hơi pha hữu cơ dưới dòng khí nitơ (5.2) nhẹ trong nồi cách thuỷ (6.7) hoặc dùng máy cô quay chân không (6.7) đến thể tích còn khoảng 1 ml.

Dùng khoảng 10 ml diclometan (5.3) chuyển phần còn lại sang ống ly tâm (6.8).

Làm bay hơi cẩn thận cho đến khô hoàn toàn.

9.5. Chiết pha lỏng-lỏng

Cho 400 µl (V₃) nước và 2,0 ml toluen (5.4) vào cặn và trộn nhẹ trong 1 min bằng máy trộn Vortex (6.9) ở tốc độ quay khoảng 700 min^-1

Ly tâm 5 min ở gia tốc quay 1000 g trong máy ly tâm (6.10).

Dùng pipet loại bỏ pha hữu cơ càng triệt để càng tốt.

Thêm 1,5 ml toluen và trộn nhẹ trong 1 min ở tốc độ quay khoảng 700 min ^-1 trên máy trộn Vortex (6.9).

 Ly tâm 5 min ở gia tốc quay 1 000 g trong máy ly tâm (6.10).

Dùng pipet loại bỏ pha hữu cơ càng triệt để càng tốt.

Dùng micropipet (6.11) chuyển 300   pha nước vào vật chứa thích hợp.

9.6. Phân tích sắc ký

9.6.1 Điều kiện sắc ký

Thông số	Cài đặt
Bước sóng	285 nm
Dải detector	độ hấp thụ 0,005 đến 0,01 trên toàn bộ thang ghi
Dải ghi	10 mV
Tốc độ chạy của giấy	1,0 cm/min
Tốc độ dòng của pha động (5.7)	0,6 ml/min
Thể tích bơm	100

CHÚ THÍCH Thể tích bơm và tốc độ dòng phụ thuộc vào kích thước cột.

9.6.2. Quy trình đo sắc ký

Chờ cho đến khi hệ thống sắc ký lỏng (6.12) đã ổn định. Bơm một mẫu trắng, một mẫu trắng đã bổ sung cloramphenicol, bốn dung dịch chuẩn cloramphenicol (5.9), dung dịch thử thu được trong 9.5 và bơm lại dung dịch chuẩn cloramphenicol (5.9).

Kiểm tra tín hiệu cloramphenicol trong sắc ký mẫu tại thời gian lưu cloramphenicol.

9.6.3. Phương pháp đo

Đo chiều cao pic cloramphenicol hoặc diện tích pic của dung dịch thử và các dung dịch chuẩn cloramphenicol.

Các kết quả thu được đối với các dung dịch chuẩn cloramphenicol phải tuyến tính với các hàm lượng cloramphenicol của các dung dịch này.

CHÚ THÍCH Việc khẳng định có thể tiến hành bằng detector DAD (diode orray detector) đối với hàm lượng cloramphenicol vượt quá 10 /kg

10. Tính toán

Tính hàm lượng cloramphenicol của mẫu thử theo công thức:

W = 

trong đó

w là hàm lượng cloramphenicol của mẫu thử, tính bằng microgam trên kilogam (/kg);

h là chiều cao pic hoặc diện tích pic tìm được trong dung dịch thử, tính bằng đơn vị đ6ộ dài hoặc đơn vị diện tích;

h_s là chiều cao pic hoặc diện tích pic tìm thấy được trong một dung dịch chuẩn (5.9), tính bằng đơn vị độ dài hoặc đơn vị diện tích;

p là hàm lượng cloramphenicol của dung dịch chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (/ml),

m là khối lượng của phần mẫu thử (9.2), tính bằng gam (g);

V₁ là thể tích của pha nước thu được sau khi trộn trong 9.3 (V₁ = 40 ml + thể tích nước trong dung dịch thử), tính bằng mililit (ml);

V₂ là thể tích của dịch lọc đã chuyển vào ống chiết trong 9.4 (V₂ = 20 ml), tinh bằng mililit (ml);

V₃ là thể tích của nước thêm vào cặn trong 9.5 (V₃ = 400  ), tính bằng mililit (ml).

Kết quả được làm tròn đến 0,1 /kg.

Kết quả về độ thu hồi không được hiệu chỉnh. Độ thu hồi phải được nêu trong báo cáo thử nghiệm (Điều 12).

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo ISO 5725 [2]3)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm này đã được công bố (xem tài liệu tham khảo [5]). Các giá trị nhận được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

Các kết quả của một phép thử liên phòng thử nghiệm khác, tiến hành theo ISO 5725, cho thấy độ thu hồi đối với thịt, sản phẩm thịt và gia cầm có thể lặp lại và xấp xỉ 55 %.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác, sử dụng cùng một loại thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % trường hợp lớn hơn 2,1 / kg đối với hàm lượng cloramphenicol 10 / kg.

 11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thao tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn 4,9 / kg đối với hàm lượng cloramphenicol 10 / kg .

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

– kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu hai kết quả thử nghiệm thu được;

– độ thu hồi.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 3100-1 : 1991, Thịt và sản phẩm thịt –Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử – Phần 1: Lấy mẫu

[2] ISO 5725 : 1986, precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for standard test method by inter-laboratory test.

[3] TCVN 6910-1 : 2001 (ISO 5725-1 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[4] TCVN 6910-2 : 1994 ISO 5725-2 :1994). Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[5] Aerts M.L. , Keukens H.J. , Werdmuller G.A. Liquid Chromatographic Determination of Chloramphenicol Residues in Meat: Interlaboratory Study, J.AOAC, 72, (4), 1989. pp. 570-576.