TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8099-2:2009 (ISO 8968-2 : 2001) VỀ SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN HỦY KÍN (PHƯƠNG PHÁP MACRO)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8099-2 : 2009

ISO 8968-2 : 2001

SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN HỦY KÍN (PHƯƠNG PHÁP MACRO)

Milk – Determination of nitrogen content – Part 2: Block digestion method (Macro method)

Lời nói đầu

TCVN 8099-2 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 8968-2 : 2001

TCVN 8099-2 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8099 (ISO 8968), Sữa – Xác định hàm lượng nitơ, gồm các phần sau đây:

– TCVN 8099-1 : 2009 (ISO 8968-1 : 2001), Sữa – Xác định hàm lượng nitơ – Phần 1: Phương pháp Kjeldahl;

– TCVN 8099-2 : 2009 (ISO 8968-2 : 2001), Sữa – Xác định hàm lượng nitơ – Phần 2: Phương pháp phân hủy kín (Phương pháp Macro);

– TCVN 8099-3 : 2009 (ISO 8968-3 : 2004), Sữa – Xác định hàm lượng nitơ – Phần 3: Phương pháp phân hủy kín (Phương pháp thông dụng nhanh Semi-macro);

– TCVN 8099-4 : 2009 (ISO 8968-3 : 2001), Sữa – Xác định hàm lượng nitơ – Phần 4: Phương pháp xác định hàm lượng nitơ phi protein;

– TCVN 8099-5 : 2009 (ISO 8968-3 : 2001), Sữa – Xác định hàm lượng nitơ – Phần 5: Phương pháp xác định hàm lượng nitơ protein.

SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN HỦY KÍN (PHƯƠNG PHÁP MACRO)

Milk – Determination of nitrogen content – Part 2: Block digestion method (Macro method)

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng nitơ trong sữa nguyên chất hoặc sữa gầy dạng lỏng bằng phương pháp phân hủy kín.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 7149-1 (ISO 385-1), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Buret – Phần 1: Yêu cầu chung.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Hàm lượng nitơ (nitrogen content)

Phần khối lượng của nitơ xác định được bằng phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Hàm lượng nitơ được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.

4. Nguyên tắc

Phần mẫu thử được phân hủy bằng thiết bị phân hủy kín với hỗn hợp của axit sulfuric đậm đặc và kali sulfat, dùng đồng (II) sulfat làm chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ có mặt về amoni sulfat. Kali sulfat là để tăng điểm sôi của axit sulfuric và tạo môi trường oxi hóa mạnh. Bổ sung một lượng dư của natri hydroxit vào dịch phân hủy đã nguội để giải phóng amoniac. Lượng amoniac giải phóng được chưng cất bằng hơi nước, sử dụng thiết bị chưng cất bán tự động hoặc chưng cất thủ công vào trong dung dịch axit boric dư và sau đó chuẩn độ bằng axit clohydric. Hàm lượng nitơ tính được từ lượng amoniac tạo thành.

5. Thuốc thử và vật liệu

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có qui định khác.

5.1. Kali sulfat (K₂SO₄), không chứa nitơ.

5.2. Dung dịch đồng (II) sulfat, c(CuSO₄) = 5,0 g/100 ml.

Hòa tan 5,0 g đồng (II) sulfat ngậm năm phân tử nước (CuSO₄.5H₂O) trong nước đựng trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

5.3. Axit sulfuric (H₂SO₄), ít nhất là 95% đến 98% phần khối lượng, không chứa nitơ (r₂₀=1,84 g/ml).

5.4. Dung dịch natri hydroxit (NaOH), không chứa nitơ, chứa 50 g natri hydroxit trên 100 g dung dịch.

Có thể sử dụng dung dịch natri hydroxit 40% thay cho dung dịch 50%, nếu bị nghẽn hệ thống dòng chảy trong thiết bị chưng cất tự động.

5.5. Dung dịch chất chỉ thị

Hòa tan 0,1 g đỏ metyl trong etanol 95% (thể tích). Pha loãng đến 50 ml bằng etanol. Hòa tan 0,5 g xanh bromocresol trong etanol 95% (thể tích). Pha loãng đến 250 ml bằng etanol. Trộn một phần dung dịch đỏ metyl với năm phần dung dịch xanh bromocresol hoặc gộp và trộn tất cả các phần của cả hai dung dịch.

5.6. Dung dịch axit boric, c(H₃BO₃) = 40,0 g/l

Hòa tan 40,0 g axit boric trong 1 l nước nóng đựng trong bình định mức một vạch 1000 ml. Để bình đựng dung dịch này nguội đến 20^oC. Pha loãng bằng nước đến vạch, thêm 3 ml dung dịch chất chỉ thị (5.5) và trộn. Bảo quản dung dịch trong chai thủy tinh borosilicat, dung dịch này sẽ có màu cam. Trong quá trình bảo quản dung dịch cần tránh ánh sáng và các nguồn khói amoniac.

Nếu việc chuẩn độ có dùng máy đo pH điện tử thì có thể không cần phải bổ sung dung dịch chất chỉ thị vào dung dịch axit boric. Mặt khác, sự đổi màu cũng có thể được dùng để kiểm tra các qui trình chuẩn độ đúng.

5.7. Dung dịch axit clohydric thể tích chuẩn, c(HCl) = (0,1 ± 0,0005) mol/l

Khuyến cáo rằng vật lệu có bán sẵn này cần được nhà sản xuất chuẩn hóa trước để đáp ứng được bằng hoặc cao hơn yêu cầu trên đây.

CHÚ THÍCH: Thông thường các sai số hệ thống (mà có thể tránh được) do người phân tích gây ra khi pha loãng dung dịch axit gốc đậm đặc rồi xác định độ mol, có thể giảm độ tái lập của phương pháp. Người phân tích không nên sử dụng dung dịch để chuẩn độ có nồng độ cao hơn 0,1 mol/l, vì sẽ làm giảm tổng thể tích chuẩn độ trên mẫu và tăng độ không chính xác khi đọc buret. Điều này sẽ ảnh hưởng xấu đến độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp. Khi dùng một axit khác (ví dụ như axit sulfuric) thay thế cho axit clohydric sẽ phát sinh sai số. Do đó, không khuyến cáo sử dụng các chất thay thế đó.

5.8. Amoni sulfat, [(NH₄)₂SO₄], tối thiểu 99,9 % (khối lượng) theo chất khô

Ngay trước khi sử dụng, sấy khô amoni sulfat ở 102^oC ± 2^oC không ít hơn 2 h. Để nguội trong tủ hút ẩm cho đến nhiệt độ phòng.

5.9. Trytophan (C₁₁H₁₂N₂O₂) hoặc lysin hydro clorua (C₆H₁₅CIN₂O₂), tối thiểu 99% (khối lượng)

Không sấy khô thuốc thử này trong tủ sấy trước khi sử dụng.

5.10. Sacaroza, có chứa hàm lượng nitơ không quá 0,002% (khối lượng).

Không sấy khô sacaroza trong tủ sấy trước khi sử dụng.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Nồi cách thủy, có thể duy trì ở 38^oC ± 2^oC.

6.2. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

6.3. Thiết bị phân hủy kín, buồng hợp kim nhôm hoặc tương đương, có gắn bộ phận điều chỉnh nhiệt độ và dụng cụ để đo nhiệt độ của buồng kín.

6.4. Ống phân hủy, dung tích 250 ml, thích hợp cho việc sử dụng trong thiết bị phân hủy (6.3).

6.5. Ống thoát khí, thích hợp để sử dụng với các ống phân hủy (6.4).

6.6. Tháp rửa khí ly tâm hoặc bơm lọc hoặc máy hút, được chế tạo bằng vật liệu bền với axit, để sử dụng với đường ống cung cấp nước.

6.7. Buret hoặc pipet tự động, có thể phân phối các lượng 1,0 ml dung dịch đồng sulfat (5.2)

6.8. Ống đong chia độ, dung tích 25 ml, 50 ml và 100 ml.

6.9. Thiết bị chưng cất, có thể chưng cất hơi nước, thủ công hoặc bán tự động, phù hợp với các ống phân hủy 250 ml (6.4) và các bình nón 500 ml (6.10).

6.10. Bình nón, dung tích 500 ml, được chia vạch ở các mức 200 ml.

6.11. Buret, dung tích 50 ml, được chia vạch ít nhất là 0,01 ml, phù hợp với yêu cầu của cấp A của TCVN 7149-1 (ISO 385-1).

Cách khác, có thể sử dụng buret tự động nếu đáp ứng được các yêu cầu.

6.12. Bộ chuẩn độ tự động có gắn máy đo pH

Máy đo pH cần được hiệu chuẩn chính xác trong dải pH từ 4 đến 7 theo các qui trình hiệu chuẩn pH của phòng thử nghiệm thông thường.

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Làm ấm mẫu thử trên nồi cách thủy (6.1) để ở 38^oC. Trộn kỹ mẫu thử một cách nhẹ nhàng bằng cách đảo chiều chai đựng mẫu mà không tạo bọt. Làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng ngay trước khi cân phần mẫu thử (9.1).

CHÚ THÍCH: Trong Phụ lục A của TCVN 8099-1 : 2009 (ISO 8968-1 : 2001) có đưa ra cỡ mẫu đối với các sản phẩm khác của sữa khi áp dụng phương pháp này.

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử và xử lý sơ bộ

Cho vào một ống phân hủy sạch và khô (6.4) 12,0 g kali sulfat (5.1) 1,0 ml dung dịch đồng (II) sulfat (5.2), khoảng 5 ml ± 0,1 ml mẫu thử đã chuẩn bị, được cân chính xác đến 0,1 mg và 20 ml axit sulfuric (5.3). Dùng axit sulfuric để rửa đồng (II) sulfat, kali sulfat hoặc mẫu thử còn lại trên thành trên của ống phân hủy cho trôi hết xuống bình. Trộn nhẹ lượng chứa trong ống.

CHÚ Ý – Người sử dụng thiết bị phân hủy kín cần lưu ý rằng lượng axit sulfuric đủ còn lại tại cuối giai đoạn phân hủy cần được người phân tích chú ý nhiều hơn so với các hệ thống cổ truyền. Trong hệ thống phân hủy kín thì thất thoát xảy ra nhiều axit qua việc hút khói so với hệ thống cổ truyền.

CHÚ THÍCH 1: Lượng axit được sử dụng trong phân hủy kín ít hơn so với lượng axit được dùng trong hệ thống cổ truyền qui định trong TCVN 8099-1 : 2009 (ISO 8968-1). Trong nghiên cứu cộng tác (xem [6]) xác định rằng các thể tích axit lớn hơn 20 ml trong các hệ thống phân hủy kín nảy sinh vấn đề tạo bọt trong quá trình phân hủy và cho các giá trị biến động.

CHÚ THÍCH 2: Trong Phụ lục A của TCVN 8099-1: 2009 (ISO 8968-1: 2001) có đưa ra cỡ mẫu đối với các sản phẩm khác của sữa khi áp dụng phương pháp này.

9.2. Tiến hành xác định

9.2.1. Phân hủy

Các đặt bộ phận hủy kín (6.3) ở nhiệt độ ban đầu thấp để hạn chế việc tạo bọt (ở khoảng 180^oC đến 203^oC). Chuyển ống phân hủy sang bộ phân hủy kín và đặt ống thoát khí (6.5), ống này được nối với tháp rửa khí ly tâm của dụng cụ tương tự (6.6) trên đỉnh ống phân hủy. Tốc độ hút của tháp rửa khí ly tâm hoặc dụng cụ tương tự phải vừa đủ để loại bỏ khói. Thiết bị phân hủy hoàn chỉnh cần được đặt trong tủ hút khói.

Phân hủy phần mẫu thử trong 30 min hoặc cho đến khi có khói trắng. Sau đó tăng nhiệt độ của buồng phân hủy kín đến khoảng từ 410^oC đến 430^oC. Tiếp tục phân hủy phần mẫu thử cho đến khi dịch phân hủy trong.

Cũng có thể phải tăng từ từ nhiệt độ trong khoảng 20 min để hạn chế tạo bọt. Trong mọi trường hợp, không để bọt dâng lên quá 4 cm đến 5 cm cách bề mặt của tháp rửa khí được đặt trên đỉnh ống phân hủy.

Sau khi dịch phân hủy đã trong (có màu lục lam sáng), tiếp tục phân hủy ở nhiệt độ từ 410^oC đến 430^oC trong ít nhất 1 h. Trong suốt quá trình này axit sufuric phải sôi. Nếu không nhìn thấy chất lỏng trong suốt sôi vì hình thành các bọt bóng trên bề mặt chất lỏng bao quanh vành đai ống thì có thể nhiệt độ của buồng phân hủy quá thấp. Tổng thời gian phân hủy phải nằm trong khoảng từ 1,75 h đến 2,5 h.

Để xác định thời gian sôi đặc trưng yêu cầu đối với các điều kiện phân tích trong từng phòng thử nghiệm, sử dụng một bộ dụng cụ cụ thể, thì chọn mẫu sữa có hàm lượng protein cao, chất béo cao và xác định hàm lượng protein dùng các khoảng thời gian sôi khác nhau (1 h đến 1,5 h) sau khi làm trong. Kết quả trung bình của protein tăng theo thời gian sôi và giảm khi thời gian sôi quá dài. Chọn thời gian sôi để thu được protein tối đa.

Tại thời điểm kết thúc phân hủy, dịch phân hủy phải trong và không chứa vật liệu chưa phân hủy. Lấy ống phân hủy cùng với tháp rửa khí ra khỏi buồng phân hủy kín.

Để dịch phân hủy nguội đến nhiệt độ phòng trong khoảng 25 min. Dịch phân hủy phải ở dạng lỏng hoặc dạng lỏng có một ít kết tủa trên đáy ống phân hủy. Không để qua đêm dịch phân hủy chưa pha loãng trong bình cầu. Dịch phân hủy chưa pha loãng có thể kết tinh trong giai đoạn này và sẽ khó để đưa các kết tinh này trở lại trạng thái lỏng.

CHÚ THÍCH: Việc kết tinh quá nhiều sau 25 min là do thất thoát axit quá mức trong quá trình phân hủy và có thể cho kết quả thử nghiệm thấp. Việc thất thoát axit quá mức là do hút khói quá mạnh hoặc do thời gian phân hủy quá dài ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối đa của phép phân tích. Để giảm việc thất thoát axit, thì giảm tốc độ hút khói.

Sau khi dịch phân hủy nguội đến nhiệt độ phòng trong khoảng 25 min, tháo tháp rửa khí ra và cẩn thận thêm 85 ml nước vào mỗi ống. Xoay để trộn trong khi đảm bảo các tinh thể tách ra được hòa tan. Để nguội lượng chứa trong ống trở lại nhiệt độ phòng.

9.2.2. Chưng cất

Bật bộ ngưng tụ nước của thiết bị chưng cất. Nối ống phân hủy có chứa dịch phân hủy đã pha loãng vào thiết bị chưng cất (6.9). Đặt bình nón (6.10) có chứa 50 ml dung dịch axit boric (5.6) dưới đầu ra của bộ ngưng tụ, sao cho đầu ra của ống thấp hơn bề mặt của dung dịch axit boric. Điều chỉnh thiết bị chưng cất để phân phối 55 ml dung dịch natri hydroxit (5.4).

Khi sử dụng dung dịch natri hydroxit 40%, thì lượng phân phối phải là 65 ml. Nếu việc phân phối tự động dung dịch natri hydroxit là dao động nhiều do tắc cục bộ của đường ống phân phối dung dịch natri hydroxit, thì sẽ cho sai khác lớn trong các kết quả lặp lại.

Cho vận hành thiết bị chưng cất theo chỉ dẫn của nhà sản xuất để chưng cất amoniac đã giải phóng bằng cách bổ sung dung dịch natri hydroxit, thu dịch cất trong dung dịch axit boric. Tiếp tục quá trình chưng cất cho đến khi thu được khoảng 150 ml dịch cất. Tháo bình nón ra khỏi thiết bị chưng cất và làm ráo đầu típ chưng cất. Tráng rửa bên trong và bên ngoài đầu tip bằng nước, thu lấy nước rửa cho vào bình nón. Sau mỗi mẫu, đầu tip luôn luôn được tráng rửa bằng nước. Bình ngưng phải giữ được nhiệt độ của dung dịch trong bình nón không vượt quá 35^oC trong quá trình chưng cất khi sử dụng phương pháp so màu điểm kết thúc.

9.2.3. Chuẩn độ

Dùng buret (6.11) chuẩn độ lượng chứa trong bình nón (9.2.2) bằng axit clohydric (5.7). Điểm kết thúc đạt được khi dung dịch có vết màu hồng. Đọc buret chính xác đến 0,05 ml. Khi sử dụng máy khuấy từ nên được rọi sáng có thể giúp cho việc nhìn thấy điểm kết thúc.

Cách khác, chuẩn độ lượng chứa trong bình nón (9.2.2) bằng axit clohydric (5.7) sử dụng máy chuẩn độ tự động đã hiệu chuẩn đúng có gắn máy đo pH (6.12). Điểm pH kết thúc của chuẩn độ đạt được là 4,6 điểm uốn nhất trong đường chuẩn độ (điểm uốn). Đọc thêm máy chuẩn độ tự động lượng chất chuẩn độ đã sử dụng.

CHÚ THÍCH 1: Đối với hệ thống chất chỉ thị và dung dịch axit boric 4% qui định trong phương pháp này thì vết hồng đầu tiên quan sát được giữa pH 4,3 và 4,6. Thực tế, tốc độ thay đổi pH phụ thuộc vào HCl 0,1 mol/l đã thêm vào là rất nhanh trong dải pH này. Trong hệ thống này thì khoảng 0,05 ml dung dịch HCl 0,1 mol/l sẽ thay đổi 0,3 đơn vị pH trong dải pH từ 4,3 đến 4,6.

CHÚ THÍCH 2: Các thống kê thực hiện trong phòng thử nghiệm và giữa các phòng thử nghiệm đối với phương pháp này đã được xác định sử dụng điểm kết thúc chuẩn độ màu. So sánh các kết quả thử nghiệm cuối cùng, kể cả các kết quả của phép thử trắng thu được với điểm kết thúc pH 4,6 với điểm kết thúc chuẩn độ màu cho thấy rằng không có sự chênh lệch đáng kể.

9.3. Phép thử trắng

Luôn luôn chuẩn độ mẫu trắng bằng axit clohydric (5.7) và dùng buret (6.11) hoặc máy chuẩn độ tự động có gắn máy đo pH (6.12) như đã sử dụng đối với các phần mẫu thử. Tiến hành phép thử trắng theo qui trình trong 9.1 đến 9.2.3. Thay phần mẫu thử bằng 5 ml nước và khoảng 0,85 g sacaroza (5.10).

Ghi lại các giá trị thử trắng. Nếu các giá trị của phép thử trắng thay đổi thì phải tìm nguyên nhân.

CHÚ THÍCH 1: Mục đích của việc sử dụng sacaroza trong phép thử trắng hoặc chuẩn thu hồi để đóng vai trò của chất hữu cơ để tiêu thụ một lượng axit sulfuric trong quá trình phân hủy tương đương với phần mẫu thử. Nếu lượng axit sulfuric tự do sót lại tại điểm kết thúc phân hủy quá thấp thì độ thu hồi nitơ trong cả hai phép thử độ thu hồi trong 9.4.2 và 9.4.3 sẽ thấp. Tuy nhiên, nếu lượng axit còn lại có mặt trong giai đoạn cuối phân hủy là đủ để giữ tất cả nitơ, nhưng các điều kiện nhiệt độ và thời gian trong quá trình phân hủy là không đủ để giải phóng tất cả nitơ ra khỏi mẫu, thì độ thu hồi nitơ trong 9.4.2 sẽ có thể chấp nhận được và độ thu hồi nitơ trong 9.4.3 sẽ thấp.

Lượng chất chuẩn độ được sử dụng trong phép thử trắng phải luôn luôn lớn hơn 0. Các giá trị mẫu trắng điển hình bằng hoặc thấp hơn 0,2 ml.

CHÚ THÍCH 2: Các phép thử trắng thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm luôn phải ổn định. Nếu mẫu trắng đã có màu hồng trước khi bắt đầu chuẩn độ thì đã có sai sót gì đó. Thông thường trong những trường hợp đó thì các bình nón đã không sạch hoặc nước từ không khí ẩm có thể ngưng tụ trên mặt ngoài của dụng cụ ngưng đã chảy vào bình ngưng gây nhiễm bẩn.

9.4. Các phép thử về độ thu hồi

9.4.1. Độ đúng của qui trình cần được kiểm tra thường xuyên bằng các phép thử về độ thu hồi sau đây, tiến hành theo 9.1 đến 9.2.3.

9.4.2. Kiểm tra để chắc chắn rằng nitơ không bị thất thoát bằng cách sử dụng phần mẫu thử 0,12 g amoni sulfat (5.8) cùng với 0,85 g sacaroza (5.10).

CHÚ THÍCH 1: Kiểm tra độ thu hồi amoni sulfat không cho thông tin về khả năng phân hủy để giải phóng nitơ liên kết trong các cấu trúc của protein.

Phần trăm nitơ thu hồi phải ở khoảng 99,0% và 100% đối với tất cả các bộ phận trên thiết bị phân hủy. Đối với độ thu hồi nhỏ hơn 99,0% thì nồng độ của chất chuẩn độ cao hơn giá trị đã nêu hoặc có thể thất thoát nitơ trong quá trình phân hủy hoặc chưng cất. Có thể sử dụng hỗn hợp của amoni sulfat và một lượng nhỏ axit sulfuric (lượng còn lại ở cuối giai đoạn phân hủy) trong bình. Pha loãng tiếp bằng nước và thêm một lượng natri hydroxit rồi chưng cất. Nếu độ thu hồi nitơ vẫn còn thấp như vậy thì việc thất thoát nitơ là do thiết bị chưng cất và không phải trong quá trình phân hủy. Khả năng có thể là do ống nối trong hệ thống cổ truyền bị hở hoặc trong khi chưng cất đầu típ của bộ ngưng không được ngập trong axit boric. Cần kiểm tra thiết bị bằng qui trình trong 9.4.3 trước khi kiểm tra độ thu hồi.

CHÚ THÍCH 2: Trong các hệ thống chưng cất bằng hơi nước trước đây, cho thấy có sự ăn mòn các phần thủy tinh bên trong hệ thống chưng cất của thiết bị do dung dịch natri hydroxit nóng, có thể làm rò rỉ lỗ kim châm hoặc rạn thủy tinh và sẽ làm thất thoát amoniac qua các rò rỉ này. Điều này rất khó phát hiện, nhưng đã được ghi lại vì đó là nguyên nhân dẫn đến độ thu hồi thấp của một số phòng thử nghiệm sử dụng thiết bị chưng cất hơi nước đời cũ.

Khi độ thu hồi nitơ vượt quá 100% thì không có việc thất thoát nitơ, mà có thể có một số nguyên nhân như sau:

a) Amoni sulfat bị nhiễm bẩn;

b) Nồng độ thực của chất chuẩn độ thấp hơn so với giá trị đã nêu;

c) Có sai sót trong việc hiệu chuẩn buret để chuẩn độ;

d) Nhiệt độ của chất chuẩn độ quá cao so với nhiệt độ hiệu chuẩn buret;

e) Tốc độ chuẩn độ của buret vượt quá tốc độ tối đa của buret đã hiệu chuẩn.

9.4.3. Kiểm tra hiệu quả của qui trình phân hủy bằng cách sử dụng 0,16 g lysin hydro clorua hoặc 0,18 g trytophan (5.9) cùng với 0,67 g sacaroza (5.10).

Ít nhất là 98,0% nitơ phải được thu hồi. Nếu độ thu hồi thấp hơn 98,0%, sau khi thu hồi được từ 99,0% đến 100,0% amoni sulfat, thì do nhiệt độ hoặc thời gian phân hủy là chưa đủ (thực hiện qui trình trong 9.2.1 đoạn 1 và chú thích) hoặc có vật liệu chưa phân hủy hết (nghĩa là hóa than) trong bình. Đánh giá cuối cùng về tính năng thực hiện tốt nhất bằng cách tham gia vào chương trình thử nghiệm thành thạo, ở đó các thông số thống kê trong một phòng thử nghiệm và giữa các phòng thử nghiệm được tính toán dựa trên phân tích các mẫu sữa.

9.4.4. Các kết quả thấp hơn trong các phép thử về độ thu hồi (9.4.2 và 9.4.3) cho thấy có sai sót trong qui trình và/hoặc nồng độ của dung dịch axit clohydric (5.7) không đúng.

10. Tính và biểu thị kết quả

10.1. Tính hàm lượng nitơ

10.1.1. Tính hàm lượng nitơ trong mẫu thử, w_N, theo công thức sau đây:

trong đó

w_N là hàm lượng nitơ của mẫu, tính bằng phần trăm khối lượng (%).

V_s là thể tích của dung dịch axit clohydric (5.7) đã dùng trong phép xác định (9.2.3), chính xác đến 0,05 ml, tính bằng mililít (ml).

V_b là thể tích của dung dịch axit clohydric (5.7) đã dùng trong phép thử trắng (9.3), chính xác đến 0,05 ml, tính bằng mililít (ml);

M_r là nồng độ mol/l của axit clohydric (5.7), lấy chính xác đến bốn chữ số thập phân;

m là khối lượng phần mẫu thử (9.1), cân chính xác đến 0,1 mg, tính bằng gam (g).

10.1.2. Biểu thị kết quả chính xác đến bốn chữ số thập phân, nếu cần để tính toán tiếp theo. Đối với kết quả cuối cùng, biểu thị hàm lượng nitơ đến ba chữ số thập phân và hàm lượng protein đến hai chữ số thập phân. Không làm tròn các kết quả thu được cho đến khi tính giá trị cuối cùng của phép thử.

CHÚ THÍCH: Điều này đặc biệt đúng khi các giá trị được sử dụng để tính toán tiếp. Một ví dụ là khi các giá trị thử nghiệm riêng lẻ thu được từ phép phân tích nhiều mẫu được dùng để tính toán thống kê về thực hiện của phương pháp về độ lệch trong một phòng hoặc giữa các phòng thử nghiệm. Một ví dụ khác là khi các giá trị được sử dụng làm chuẩn để hiệu chuẩn thiết bị (ví dụ: máy phân tích sữa dùng tia hồng ngoại) có các giá trị từ nhiều mẫu được sử dụng trong tính toán đơn giản hoặc hồi qui bội số. Khi đó các giá trị thu được không được làm tròn trước khi dùng để tính toán tiếp theo.

10.2. Tính hàm lượng protein thô

10.2.1. Tính hàm lượng protein thô của mẫu thử, w_p, sử dụng công thức sau đây:

w_p= w_N x 6,38

trong đó

w_p là hàm lượng protein thô tính bằng phần trăm khối lượng (%).

w_N là hàm lượng nitơ của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng được lấy đến bốn chữ số thập phân (10.1) (%).

6,38 là hệ số để chuyển đổi nitơ thành protein thô.

10.2.2. Báo cáo kết quả thu được đối với protein thô đến ba chữ số thập phân, nếu cần để tính toán tiếp. Đối với kết quả cuối cùng (xem 10.1) thì biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân.

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập thu được từ kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 57251. Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong [6], [7]. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các giá trị đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp vượt quá 0,006% đối với hàm lượng nitơ (0,038% đối với hàm lượng protein thô).

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những  người khác nhau thực hiện, sử dụng cùng thiết bị khác nhau, không quá 5% các trường hợp vượt quá 0,0077% đối với hàm lượng nitơ (0,049% đối với hàm lượng protein thô).

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– Phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– Mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

– Kết quả thử nghiệm thu được;

– nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được;

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] ISO 5725 : 1986 Precision of test method – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter – Laboratory tests (đã hủy).

[3] TCVN 6910-1: 2001 (ISO 5725-1 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Các định nghĩa và nguyên tắc chung.

[4] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2: 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản để xác định độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[5] TCVN 8099-1: 2009 (ISO 8968-1/IDF 20-1 : 2001), Sữa – Xác định hàm lượng nitơ – Phần 1: Phương pháp Kjedahl (Milk – Determination of nitrogen content – Part 1: Kjedahl method)

[6] BANO, D.M, CLARK, J.L., C.E and FLEMING, J.R. Kjedahl method for determination of total nitrogen content of milk; Collaborative study. J.Assoc. Off. Anal. Chem 73, 1990, pp 849-859.

[7] LYNCH, J.M, BARBANO, D.M and FLEMING, J.R. Performance evaluation of direct forced-air total solids and Kjeldahl total nitrogen method: 1990 through 1995. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 80, 1997, pp. 1038-1043.