TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7140:2002 (ISO 13496 : 2000) VỀ THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – PHÁT HIỆN PHẨM CẦU – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỚP MỎNG DO BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 7140:2002

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – PHÁT HIỆN PHẨM MÀU – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
Meat and meat products – Detection of colouring agents – Method using thin-layer chromatography

Lời nói đầu

TCVN 7140 : 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 13496 : 2000;

TCVN 7140 : 2002 do Ban Kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F 8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lớp mỏng để phát hiện các phẩm màu tổng hợp tan trong nước có trong thịt và sản phẩm thịt.

Phương pháp này có thể phát hiện các phẩm màu sau đây:

Tartrazin                                                Patent Blue V

Quinolin Yellow                                     Indigotin

Sunset Yellow FCF                                Brilliant Black PN

Amaranth                                              Black 7984

Ponceau 4R                                          Fast Green FCF

Erythrosin                                             Blue VRS

Các từ đồng nghĩa và các số nhận biết của các phẩm màu này được liệt kê trong phụ lục A.

Các phẩm màu thực vật và các chiết xuất từ thực vật được quan sát cho thấy không cản trở đến phương pháp này được liệt kê trong bảng B.1. Các phẩm màu tự nhiên trong một số trường hợp cho thấy gây cản trở đến phương pháp này được liệt kê trong bảng B.2.

2. Tiêu chuẩn viện dẫn

TCVN 4851 – 89 (ISO 3639 : 1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

AOAC 46.1.08 : 1995 Official Methods of Analysis (Các phương pháp phân tích chính thức (AOAC quốc tế).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau:

3.1. Phát hiện các phẩm màu (Detection of colouring agents): Việc phát hiện sự có mặt hay không có mặt các phẩm màu theo phương pháp được quy định trong tiêu chuẩn này.

4. Nguyên tắc

Chiết các phẩm màu ra khỏi phần mẫu thử bằng nước nóng và hấp phụ vào bột polyamit. Làm sạch các phẩm màu đã chiết bằng sắc ký cột và rửa giải các chất màu ra khỏi cột. Nhận biết các phẩm màu bằng sắc ký lớp mỏng.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

5.1. Nước, đạt ít nhất là nước loại 3 của TCVN 4851 – 89 (ISO 3639).

5.2. Ete dầu hỏa, có dải nhiệt độ sôi từ 40⁰C đến 60⁰C.

5.3. Metanol.

5.4. Amoniac, dung dịch 25%, r₂₀ = 0,910 g/ml.

5.5. Axit axetic, 100% phần khối lượng, r₂₀ = 1,050 g/ml.

5.6. Trinatri xitrat ngậm 2 phân tử nước.

5.7. Propan-1-ol.

5.8. Etyl axetat.

5.9. 2-Metyl-2-propanol.

5.10. Axit propionic.

5.11. Dung dịch rửa giải dùng cho sắc ký cột.

Trộn 95 thể tích metanol (5.3) với 5 thể tích dung dịch amoniac (5.4).

5.12. Axit axetic, dung dịch 50% trong metanol.

Trộn 1 thể tích axit axetic (5.5) với 1 thể tích metanol (5.3).

5.13. Bột polyamit, có cỡ hạt từ 0,05 mm đến 0,16 mm.

5.14. Cát, hạt mịn, được rửa bằng axit clohidric, trung hòa và được nung khô.

5.15. Chất màu đối chứng tiêu chuẩn

Độ tinh khiết của các chất màu tiêu chuẩn có thể thay đổi, vì vậy cần phải biết được độ tinh khiết của các chất màu được sử dụng làm chất chuẩn. Độ tinh khiết được xác định bằng phương pháp AOAC 46.1.08.

Chú thích – Có thể sử dụng các chất màu thực phẩm đã được chứng nhận làm các chất chuẩn.

5.16. Dung dịch đối chứng tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lớp mỏng

Tạo riêng rẽ các dung dịch trong nước của từng chất màu đối chứng tiêu chuẩn (5.15) có hàm lượng chất màu tiêu chuẩn khoảng 1 g/l.

Chuẩn bị các dung dịch indigotin trong ngày sử dụng. Các dung dịch khác giữ được ít nhất 3 tháng (các dung dịch của erytroxin thì 1 tháng) khi bảo quản nơi tối.

5.17. Chất rửa giải dùng cho sắc ký lớp mỏng: dung dịch I

Cần 25 g trinatri xitrat ngậm 2 phân tử nước (5.6), chính xác đến 0,1g, cho vào bình định mức một vạch 1 000 ml. Hòa tan trong nước, pha loãng bằng nước đến vạch và lắc đều.

Trộn 80 thể tích dung dịch xitrat này với 20 thể tích dung dịch amoniac (5.4) và 12 thể tích metanol (5.3).

Để tránh nhiễu hoặc khử nhiễu do saflo hoặc safran, nên sử dụng dung dịch sắc ký II (5.18).

5.18. Chất rửa giải dùng cho sắc ký lớp mỏng: dung dịch II

Trộn 6 thể tích propan-1-ol (5.7) với 1 thể tích etyl axetat (5.8) và 3 thể tích nước.

5.19. Chất rửa giải dùng cho sắc ký lớp mỏng: dung dịch III

Trộn 50 thể tích 2-metyl-2-propanol (5.9) với 12 thể tích axit propionic (5.10) và 38 thể tích nước.

6. Thiết bị và dụng cụ 

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và đặc biệt là các dụng cụ sau:

6.1. Thiết bị đồng hóa bằng cơ hoặc bằng điện, có thể đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm

Dùng máy cắt quay tốc độ cao hoặc máy xay gắn một tấm đục lỗ với đường kính lỗ không quá 4,0 mm.

6.2 Ống ly tâm, bằng thủy tinh, dung tích 75 ml.

6.3. Bình đáy phẳng, có nút thủy tinh mài, dung tích 250 ml.

6.4. Bình đáy tròn, có khớp nối bằng thủy tinh, dung tích 100 ml.

6.5. Máy ly tâm, hoạt động ở gia tốc quay khoảng 2 000 g_n.

6.6. Bộ cô quay chân không.

6.7. Cột sắc ký, bằng thủy tinh gắn bộ lọc và có vòi, dài khoảng 20 cm, đường kính khoảng 30 mm, cỡ lỗ của bộ lọc từ 40 mm đến 100 mm (độ xốp P 100 theo ISO 4793 [2]).

Cho một vài sợi len thủy tinh vào cột và thêm khoảng 1 g đến 2 g cát (5.14).

6.8. Bình chứa bằng chất dẻo, dung tích khoảng 10 ml, có nắp đậy.

6.9. Tấm lớp mỏng, được phủ một lớp bột xenluloza dày 0,10 mm hoặc tương đương.

Sử dụng các tấm bán sẵn thích hợp.

6.10. Micropipet, dung tích khoảng 5 ml.

6.11. pH-met, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH.

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo quy định trong TCVN 4833-1 : 2002 (ISO 8100-1) [1].

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Tiến hành từ mẫu đại diện ít nhất là 200 g. Bảo quản mẫu sao để tránh giảm chất lượng và biến đổi thành phần.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm bằng thiết bị thích hợp (6.1). Chú ý sao cho nhiệt độ vật liệu thử không tăng quá 25⁰C. Nếu sử dụng máy xay thì cho xay mẫu ít nhất hai lần.

Cho đầy mẫu đã chuẩn bị vào vật chứa kín khí. Đậy vật chứa lại và bảo quản sao cho tránh được sự giảm chất lượng và thay đổi thành phần của mẫu. Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, nhưng phải trong 24h sau khi mẫu đã đồng hóa.

9. Cách tiến hành

Cảnh báo – Nếu mẫu chứa indigonin, thì trong suốt quá trình phân tích nhiệt độ không được vượt quá 35⁰C. Indigotin trong dung dịch sắc ký I bị phân hủy từng phần, do đó nên sử dụng dung dịch sắc ký II.

Erytroxin rất nhạy với ánh sáng. Khi phải tạm dừng phân tích, các dung dịch và các tấm sắc ký phải được bảo quản nơi tối. Cũng tương tự đối với indigotin.

9.1. Phần mẫu thử

Cân 5 g mẫu thử đã chuẩn bị (xem điều 8), chính xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm (6.2).

Đối với các mẫu có chất béo thì tiến hành theo 9.2.

Đối với các mẫu không có chất béo thì tiến hành theo 9.3.

9.2. Mẫu có chất béo  

Cho khoảng 20 ml ete dầu hỏa (5.2) vào ống ly tâm và trộn đều bằng đũa thủy tinh. Gạn bỏ ete dầu hỏa.

Lặp lại thao tác này ba lần.

9.3. Mẫu không có chất béo

Cho 25 ml nước sôi (xem cảnh báo ở trên) và trộn. Thêm 25 ml dung dịch chất rửa giải (5.11).

Kiểm tra pH là 9 ± 0,5 bằng pH-met (6.11). Nếu không, chỉnh pH bằng axit axetic (5.5) hoặc dung dịch amoniac (5.4).

Trộn đều. Làm lạnh mẫu 15 min trong tủ đông lạnh (để tránh đục).

Ly tâm (6.5) trong 10 min ở gia tốc quay khoảng 2 000 g_n.

Gạn dung dịch trong cho vào bình đáy phẳng (6.3). Trong trường hợp đối với indigotin, thì sử dụng bình đáy tròn (6.4).

Thêm 5 ml nước vào ống ly tâm chứa phần còn lại. Lắc đều và thêm 10 ml dung dịch rửa giải (5.11) Lắc đều và cho ly tâm như trên.

Lặp lại qui trình cho đến khi tất cả chất màu đã được chiết khỏi mẫu, sau đó gộp tất cả các dịch chiết.

Cho bay hơi dịch chiết hỗn hợp trên nồi cách thủy đến khoảng 25 ml để loại bỏ hết metanol. Đối với indigotin thì sử dụng bình đáy tròn (6.14) và dùng bộ cô quay chân không (6.6) ở 35⁰C.

Thêm 25 ml nước sôi (xem cảnh báo) và trộn.

9.4. Chuyển các chất màu sang bột polyamit

Dùng axit axetic (5.5) hoặc dung dịch amoniac (5.4) để chỉnh pH đến khoảng từ 4 đến 5.

Thêm 1 g bột polyamit (5.13) vào dung dịch còn ấm (xem cảnh báo). Lắc mạnh trong 1 min

Để bột lắng.

Kiểm tra để biết chắc rằng chất màu không còn trong dung dịch. Nếu dung dịch có màu, thêm một ít bột polyamit và lắc thật mạnh.

Chú thích – Một số chất màu tự nhiên (xem phụ lục B) không hấp thụ hoàn toàn lên bột polyamit, để lại dung dịch có màu ngay cả khi tất cả các chất màu tổng hợp đều hấp phụ hoàn toàn. Thông thường có thể quyết định loại mẫu cho dù có hoặc không có mặt các chất màu tự nhiên như thế.

Lắc và chuyển huyền phù còn ấm vào cột sắc ký (6.7).

Tráng bình đáy phẳng ba lần, mỗi lần bằng 10 ml nước nóng (xem cảnh báo) và cho nước tráng từng phần một sang cột. Rửa tiếp cột ba lần, mỗi lần dùng 10 ml nước nóng (xem cảnh báo) và cuối cùng rửa ba lần mỗi lần bằng 5 ml metanol (5.3). Nếu các chất màu tự nhiên được rửa giải, thì tiếp tục rửa cột bằng metanol cho đến khi metanol được rửa giải mất màu.

9.5. Rửa giải và cô chất màu đã tách

Đặt bình (6.4) dưới cột và rửa giải các chất màu ra khỏi bột polyamit bằng các phần 5 ml dung dịch rửa giải (5.11), ở tốc độ dòng thể tích rửa giải là 2 ml/min, cho đến khi polyamit mất màu.

Cho bay hơi chất rửa giải đến khó sử dụng bộ cô quay chân không (6.6) ở nhiệt độ cao nhất là 35⁰C (xem cảnh báo).

Thêm 1,0 ml hoặc 2,0 ml dung dịch rửa giải (5.11) tùy thuộc vào lượng và số lượng chất màu và hòa tan cặn. Chuyển dung dịch chất màu sang vật chứa bằng chất dẻo (6.8).

9.6. Tách bằng sắc ký lớp mỏng

9.6.1. Tấm đối chứng tiêu chuẩn

Chuẩn bị ba tấm sắc ký lớp mỏng đối chứng tiêu chuẩn. Dùng micropipet (6.10) phân phối từng dung dịch tiêu chuẩn (5.16) mỗi dung dịch một điểm chấm khoảng 5 ml (đường kính < 5 mm) một cách riêng rẽ lên từng tấm (6.9). Hiện màu từng dung dịch một cách riêng rẽ, mỗi dung dịch dùng một chất rửa giải sắc ký (5.17, 5.18 và 5.19) trong bể chưa bão hòa cho đến khi vệt màu trên sắc ký đạt đến khoảng từ 10 cm đến 12 cm so với điểm chấm sắc ký. Lấy các tấm sắc ký ra khỏi bể và làm khô trong không khí dưới tấm che. Bảo quản các tấm này nơi tối. Các điểm chấm này có thể ổn định trong vài năm, trừ trường hợp đối với indigotin.

9.6.2. Mẫu

Dùng micropipet (6.10) lấy một lượng dung dịch mẫu (9.5) vừa đủ để nhìn thấy cho vào tấm sắc ký mỏng (6.9). Dùng máy sấy tóc sấy khô. Trong trường hợp đối với indigotin thì làm khô trong không khí.

Cho hiện màu tấm sắc ký này trong bể chưa bão hòa cho đến khi chiều cao của cột đạt khoảng từ 10 cm đến 12 cm, sử dụng dung dịch sắc ký thích hợp (5.16, 5.17 hoặc 5.18); nghĩa là dung dịch cho tách màu tốt nhất phát hiện được trong mẫu (xem điều 1). Đôi khi cần phải chuẩn bị tấm mẫu thứ hai và cho hiện màu trong một chất rửa giải của hai chất rửa giải khác để thu được sự tách màu tốt nhất.

Lấy tấm sắc ký ra khỏi bể và làm khô trong không khí dưới tấm che.

So sánh các vết chấm mẫu với tấm đối chứng tiêu chuẩn thích hợp (9.6.1).

Khuyến cáo rằng, nên sử dụng các lượng khác nhau của các dung dịch mẫu trong trường hợp hỗn hợp các chất màu, vì các chất màu có thể có mặt với các nồng độ khác nhau trong trạng thái cô đặc.

Sự hiện màu không tốt thường do sự làm sạch không đủ. Nếu vậy, hấp phụ lại chất màu bằng chất hấp phụ, rửa bằng nước nóng và lấy chất hấp phụ ra như mô tả ở trên.

9.7. Thử khẳng định

Thử khẳng định các chất màu đã nhận biết bằng cách chạy sắc ký mẫu cô đặc (9.6.2) trong hỗn hợp các chất chuẩn dùng cho các chất màu đã được nhận biết trong sắc ký đồ ban đầu.

Nếu còn nghi ngờ, rửa giải chất màu từ tấm sắc ký bằng dung dịch trung tính (nước hoặc etanol, hoặc 0,2 g/l dung dịch amoni axetat), axit (0,1 mol/l axit clohidric) và kiềm (0,1 mol/l dung dịch natri hidroxit) và so sánh sắc phổ hấp thụ của chất màu với sắc phổ hấp thụ của chất chuẩn. Xem sắc phổ hấp thụ trong phụ lục C.

10. Báo cáo thử nghiệm.

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;

– phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

– kết quả thử nghiệm thu được.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

CÁC TỪ ĐỒNG NGHĨA VÀ SỐ NHẬN BIẾT CÁC PHẨM MÀU TỔNG HỢP TAN TRONG NƯỚC

Bảng A.1

PHỤ LỤC B

(quy định)

KHẢ NĂNG GÂY NHIỄU BỞI CÁC CHẤT MÀU

B.1. Các chất màu không gây nhiễu

Các chất màu thực vật hoặc các chiết xuất từ thực vật sau đây không gây nhiễu đến phương pháp này

B.2 Các chất màu có thể gây nhiễu

Trong một số trường hợp, các chất màu tự nhiên cho thấy có gây nhiễu đến phương pháp này. Việc sử dụng chúng trong thực phẩm và việc xác định các chất màu tổng hợp có thể bị ảnh hưởng được đưa ra trong bảng B.1.

Bảng B.1

PHỤ LỤC C

(tham khảo)

SẮC PHỔ HẤP THỤ

Hình C.1 – Sắc phổ hấp thụ của amaranth, Black 7984, Blue VRS, Erytroxin, Tartrazin và Quinolin Yellow

Hình C.2 – Sắc phổ hấp thụ của Brilliant Black PN, Fast green FCF, Indigotin, Patent Blue V, Ponceau 4R và Sunset Yellow FCF

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4833-1 : 2002 (ISO 3100-1: 1991) Thịt và sản phẩm thịt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử – Phần 1: Lấy mẫu.

[2] ISO 4793 Laboratory sintered (fritted) filters – Porosity grading, classification and disignation.

[3] Colours, syntetic, water-soluble. Semi-quantitative detemination by chromatography and spectrophotometry. Nordic Committee on Food Analysis (NMKL), No. 134, 1990.

[4] Colour Index, 3rd edition, 1971.