TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6837:2001 (ISO 11868 : 1997) VỀ SỮA XỬ LÝ NHIỆT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO DO OA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 6837:2001

SỮA XỬ LÝ NHIỆT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Heat-treated milk – Determination of lactulose content – Method using high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 6837 : 2001 hoàn toàn tương đương với ISO 11868 : 1997;

TCVN 6837 : 2001 do Ban Kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn – Đo lường – Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng lactuloza trong sữa, sữa gầy, sữa đã tách một phần chất béo hoặc sữa nguyên chất đã xử lý nhiệt, bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân biệt sữa tiệt trùng bằng xử lý siêu nhiệt (UHT) với sữa tiệt trùng đã được bao gói.

Phương pháp này đã được thử nghiệm trên dải hàm lượng lactuloza từ 200 mg/l đến 1 500 mg/l và có thể áp dụng cho tất cả các loại sữa xử lý nhiệt.

Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp có tranh chấp.

2. Định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng định nghĩa sau đây:

Hàm lượng lactuloza của sữa gầy, sữa đã tách một phần chất béo hoặc sữa nguyên chất: Khối lượng của các chất xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

Chú thích – Hàm lượng lactuloza được biểu thị bằng miligam trên lít mẫu.

3. Nguyên tắc

Lọc để loại bỏ chất béo và protein. Xác định lactuloza trong dịch lọc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đánh giá kết quả thu được bằng cách đối chứng với các mẫu tiêu chuẩn bao gồm sữa gầy không chứa lactuloza với lượng lactuloza biết trước được bổ sung.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hai lần hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

4.1. Lactoza ngậm một phân tử nước.

4.2. Lactuloza, có độ tinh khiết tối thiểu 99%.

4.3. Dung dịch xử lý sơ bộ mẫu

Hòa tan trong nước 91.0 g kẽm axetat ngậm 2 nước [Zn(CH₃COOH)₂.2H₂0]: 54,6 g axit phosphotungstic ngậm 24 nước H₃[P(W₂O₁₀)₄].24H₂O và 58,1 ml axit axetic băng trong bình định mức 1 000 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.

4.4. Chất rửa giải

Lọc nước thuộc loại dùng cho HPLC qua màng lọc có đường kính lỗ 0,45 μm và đun sôi để loại bỏ không khí hòa tan trước khi dùng.

Chú thích – Để loại bỏ không khí hòa tan, có thể sử dụng các phương pháp khác thay cho việc đun sôi nước nhưng cũng cho kết quả tương tự (thí dụ: sục khí heli). Các phương pháp thay thế thường tốn kém hơn

4.5. Mẫu tiêu chuẩn

4.5.1. Dung tịch lactuloza tiêu chuẩn

Cân khoảng 75 mg lactuloza (4.2), chính xác đến 0,1 mg cho vào bình định mức một vạch 100 ml (5.6). Hòa tan trong nước và thêm nước cho đến vạch 100 ml.

4.5.2. Sữa gầy thanh trùng, không chứa lactuloza xác định được theo phương pháp quy định dưới đây.

Sử dụng các mẫu sữa gầy thanh trùng giống hết nhau chứa khoảng 250 mg, 500 mg, 750 mg và 1000mg lactuloza trên lít, thu được bằng cách cho 5 ml, 10 ml, 15 ml và 20 ml dung dịch lactuloza tiêu chuẩn (như mô tả trong 8.2) tương ứng vào sữa gầy thanh trùng.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường và đặc biệt như sau:

5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.2. Phễu thủy tinh, đường kính khoảng 7 cm.

5.3. Bộ lọc.

5.3.1. Giấy lọc, loại trung bình, đường kính khoảng 12,5 cm.

5.3.2. Màng lọc xelulo axetat, đường kính lỗ 0,45 μm.

5.4. Ống đong, dung tích 25 ml.

5.5. Pipet chia độ, dung tích 10 ml, được chia độ 0,1 ml.

5.6. Bình định mức một vạch, dung tích 50 ml, 100 ml và 1 000 ml.

5.7. Pipet một vạch, có thể phân phối được 5 ml, 10 ml, 15 ml và 20 ml.

5.8. Dụng cụ lọc bằng thủy tinh, đường kính lỗ lọc 0,45 μm.

5.9. Bình thủy tinh có khóa, dung tích 20 ml.

5.10. Nồi cách thủy siêu âm (ultrasonic).

5.11. Bơm nước chân không.

5.12. Thiết bị HPLC, như sau:

5.12.1. Máy khuấy từ và bếp hâm nóng, để giữ chất rửa giải ở nhiệt độ 90⁰C ± 2⁰C.

5.12.2. Bơm, có thể cho tốc độ dòng từ 0,3 ml/min đến 0,6 ml/min với xung áp suất nhỏ hơn 1% trên khắp cột (1,5 MPa đến 4 MPa).

5.12.3. Cột HPX-87 P (Bio-Rad, 30 cm x 0,78 cm)[1]⁾, hoặc cột tương đương được nhồi chất trao đổi ion sunfonic ở dạng cần thiết, dựa trên polime polystyren liên kết ngang với divinylbenzen 8%. Tiền cột (pre-column) gồm hệ khử tro Bio-Rad (một đoạn cột 3 cm x 0,46 cm được nhồi resin trao đổi cation dưới dạng hidro và một đoạn cột 3 cm x 0,46 cm được nhồi resin trao đổi anion dưới dạng cacbonat) hoặc một hệ thống có hiệu quả tương đương.

Chú thích – Các tiền cột tăng cả hạn dùng và cả chiều dài của cột phân tích, giảm tối đa các vấn đề gặp phải khi tách và giảm cơ bản các sai số định lượng. Khi hệ thống HPLC bắt đầu giảm độ phân giải, thì thay tiền cột đã hết tác dụng trước khi chúng nhiễm bẩn sang cột chính.

5.12.4. Buồng cột đẳng nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ ở 75⁰C ± 1⁰C.

Chú thích – Nên đặt các tiền cột bên ngoài buồng. Ống dẫn vào cột chính nên có phần dài khoảng 10 cm đến 15 cm nằm trong lò để làm cân bằng chất rửa giải đến 75⁰C, nếu không thì pic có thể bị biến dạng.

5.12.5. Detector chỉ số khúc xạ, có độ nhạy cao, có mức ồn nhỏ hơn 5 x 10⁹ đơn vị chỉ số khúc xạ (RIU), đo được trong nước. Bộ điều chỉnh nhiệt bên trong nên đặt ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng, đủ để thu được đường nền ổn định. Trong phần lớn các trường hợp nên để ở nhiệt độ 35⁰C đến 40⁰C.

Chú thích – Việc duy trì độ nhạy cao của chỉ số khúc xạ bị cản trở bởi đường nền bị sai lệch do thay đổi nhiệt độ. Để giảm thiểu sai lệch đường nền, thì nên đặt thiết bị HPLC trong phòng điều hòa để tránh nhiệt độ bị thay đổi.

5.12.6. Bộ tích phân, đo được chiều cao pic.

Nên chọn cẩn thận các thông số kiểm tra tích phân (thí dụ: độ rộng pic, độ dốc nghiêng, ngưỡng pic…), Bộ tích phân phải vẽ được đường vuông góc giữa các pic lactoza và pic lactuloza (việc gạn bỏ kem trong sữa sẽ làm mất độ chính xác do các lượng glucoza trong sữa luôn giao động). Bộ tích phân phải hạn chế được việc cản trở phát hiện đường nền giữa hai pic lactoza và lactuloza, trừ khi với mọi nồng độ lactuloza thì chỗ thấp nhất giữa hai pic đều chạm tới đường nền.

Có nhiều bộ tích phân tự động thay đổi các thông số phân tích pic trong quá trình làm việc. Nếu có thể, loại bỏ tính năng này để thu được kết quả có độ lặp lại cao hơn.

6. Lấy mẫu

6.1. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) [1].

Điều quan trọng là phòng thí nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6.2. Bảo quản mẫu để tránh được sự biến đổi chất lượng và tránh thay đổi thành phần của mẫu.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Đưa mẫu về nhiệt độ 25⁰C ± 5⁰C và trộn cẩn thận. Nếu chất béo không phân tán đều thì hâm nóng mẫu từ từ đến 40⁰C, chỉ đảo chiều hộp đựng để trộn mẫu một cách nhẹ nhàng và làm nguội nhanh mẫu về 20⁰C ± 2⁰C.

8. Cách tiến hành

8.1. Phần mẫu thử

8.1.1. Dùng pipet lấy 15 ml mẫu thử (điều 7) cho vào bình định mức 50 ml (5.6). Dùng ống đong chia độ (5.4) để thêm 20 ml nước và xoay bình. Dùng pipet chia độ (5.5) lấy 5,5 ml dung dịch mẫu đã xử lý sơ bộ (4.3) cho vào bình và xoay bình. Pha loãng bằng nước đến vạch và lắc.

8.1.2. Sau khi để yên 1h ở 25⁰C ± 5⁰C, lọc qua bộ lọc (5.3) vào phễu thủy tinh (5.2). Loại bỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên. Thu lấy dịch lọc còn lại trong phễu thủy tinh.

8.2. Chuẩn bị các mẫu hiệu chuẩn

8.2.1. Dùng pipet cho vào bốn bình định mức 50 ml, mỗi bình 15 ml sữa gầy không chứa lactuloza (4.5.2).

8.2.2. Dung dịch tiêu chuẩn A

8.2.2.1. Dùng pipet cho vào bình định mức 50 ml thứ nhất đựng sữa gầy không chứa lactuloza (8.2.1) 5ml dung dịch lactuloza chuẩn (4.5.1) và xoay bình.

8.2.2.2. Dùng ống đong (5.4) cho thêm 15 ml nước và xoay bình.

8.2.2.3. Dùng pipet chia độ (5.5) cho thêm 5,5 ml dung dịch mẫu đã xử lý sơ bộ (4.3) và xoay bình. Pha loãng bằng nước đến vạch và lắc bình. Sau khi để yên dung dịch 1 h ở 25⁰C ± 5⁰C, lọc qua bộ lọc (5.3) vào trong phễu thủy tinh (5.2). Bỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên.

Thu lấy dịch lọc còn lại trong phễu thủy tinh.

8.2.3. Dung dịch tiêu chuẩn B

8.2.3.1. Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch lactuloza tiêu chuẩn (4.5.1) cho vào bình định mức 50 ml thứ hai đựng sữa gầy không chứa lactuloza (8.2.1) và xoay bình.

8.2.3.2 Dùng ống đong (5.4) cho thêm 10 ml nước và xoay bình.

8.2.3.3. Tiến hành tiếp theo như quy định trong 8.2.2.3.

8.2.4. Dung dịch tiêu chuẩn C

8.2.4.1. Dùng pipet lấy 15 ml dung dịch lactuloza tiêu chuẩn (4.5.1) cho vào bình định mức 50 ml thứ ba đựng sữa gầy không chứa lactuloza (8.2.1) và xoay bình.

8.2.4.2. Dùng ống đong (5.4) cho thêm 5 ml nước và xoay bình.

8.2.4.3. Tiến hành tiếp theo như quy định trong 8.2.2.3.

8.2.5. Dung dịch tiêu chuẩn D

8.2.5.1. Dùng pipet lấy 20 ml dung dịch lactuloza tiêu chuẩn (4.5.1) cho vào bình định mức 50 ml thứ tư đựng sữa gầy không chứa lactuloza (8.2.1) và xoay bình.

8.2.5.2. Tiến hành tiếp theo như quy định trong 8.2.2.3.

8.3. Xác định bằng sắc ký khí

8.3.1. Đuổi khí trong mẫu

Dùng pipet lấy khoảng 3 ml dịch lọc từ phần mẫu thử (8.1.2) và từ các mẫu hiệu chuẩn (8.2.2.3) cho vào các bình thủy tinh riêng rẽ (5.9). Loại bỏ không khí hòa tan ra khỏi dịch lọc bằng cách nối van của bình với bơm chân không nước (5.11), hoặc đuổi khí bằng nồi cách thủy siêu âm (5.10) khoảng 30 s ở nhiệt độ phòng. Tránh tạo bọt, nếu có thể.

Chú thích – Khi để không khí lẫn vào mẫu thì có thể làm xuất hiện pic âm sau một thời gian lưu lactuloza.

8.3.2. Bơm 10 μl đến 30 μl (được đo chính xác) dịch lọc vào thiết bị HPLC (5.12) hoạt động với tốc độ dòng là 0,3 ml/min.

Khi hàm lượng lactuloza nhỏ hơn 200 mg/kg sữa, thì nên tiến hành phân tích sử dụng hai cột trong dây, tăng tốc độ dòng lên 0,6 ml/min.

Chú thích – Sắc đồ (phụ lục A) cho thấy một pic của lactoza lớn vượt ngoài thang đo với thời gian lưu khoảng 19 min và tương tự trường hợp đối với các mẫu tiêu chuẩn (8.2.2, 8.2.3, 8.2.4 và 8.2.5) và với sữa xử lý nhiệt, thì có một pic tương đối nhỏ với thời gian lưu khoảng 24 min.

Chọn cách điều chỉnh máy vẽ đồ thị để cung cấp chiều cao tối thiểu cho pic lactuloza là 5 mm đối với mẫu tiêu chuẩn A (8.2.2). Phụ thuộc vào chất lượng của cột và tiền cột đã sử dụng (5.12.3), mà thu được pic lactuloza (5.12.6) tách biệt tốt hay tách không tốt. Để xác định độ phân giải tối thiểu yêu cầu giữa lactoza và lactuloza, cần chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn chứa 0,69 g lactoza (4.1) và 3,75 mg lactuloza (4.2) trong 50 ml.

Thông số tách sau đây, R_s không được nhỏ hơn 5:

trong đó:

h₂ là chiều cao của pic lactuloza;

h_v là chiều cao chỗ lõm giữa các pic lactoza và lactuloza.

60 min là khoảng cách thời gian bơm hợp lý giữa các mẫu liên tiếp.

8.3.3. Bộ tích phân ghi lại độ cao của từng pic h₁ và h₂, trong đó h₁ là chiều cao của pic lactoza và h₂ là chiều cao của pic lactuloza.

Nên bơm lại mẫu nếu đường nền trôi quá 10% toàn bộ thang đo.

Cần thiết phải kiểm tra hình dạng của sắc đồ trước khi định lượng, để phát hiện sự bất thường do thiết bị hay do nguồn gốc và bản chất của mẫu cần phân tích.

Nếu còn nghi ngờ, lặp lại phép phân tích. Độ cao pic lactoza trong mẫu thử không nên sai lệch quá 10% so với dung dịch tiêu chuẩn. Nếu vượt quá, nên chuẩn bị các mẫu tiêu chuẩn khác.

Đối với từng dãy mẫu thử luôn có các mẫu hiệu chuẩn. Cứ 10 mẫu đến 15 mẫu thì hiệu chuẩn lại.

8.4. Độ thu hồi

Nếu cần, thử độ thu hồi bằng quy trình bổ sung chuẩn. Nếu độ thu hồi nhỏ hơn 99% trong các mẫu có hàm lượng lactuloza bằng hoặc lớn hơn 200 mg/l thì nên lặp lại phép phân tích.

9. Tính toán và biểu thị kết quả

9.1. Hiệu chuẩn

Sau mỗi lần bơm dung dịch tiêu chuẩn và tách bằng thiết bị HPLC, bộ tích phân ghi lại chiều cao của các pic sau:

h_2a là giá trị bằng số của chiều cao pic lactuloza của dung dịch tiêu chuẩn A;

h_2b là giá trị bằng số của chiều cao pic lactuloza của dung dịch tiêu chuẩn B;

h_2c là giá trị bằng số của chiều cao pic lactuloza của dung dịch tiêu chuẩn C;

h_2d là giá trị bằng số của chiều cao pic lactuloza của dung dịch tiêu chuẩn D;

Tính nồng độ lactuloza, c_ad, trong các dung dịch tiêu chuẩn A, B, C và D (8.2), tính bằng miligam trên 50 ml như sau:

c_a = m₁ x 5/100

c_b = m₁ x 10/100

c_c = m₁ x 15/100

c_d = m₁ x 20/100

Trong đó m₁ là giá trị khối lượng lactuloza của dung dịch tiêu chuẩn (4.5.1).

Phép phân tích hồi qui tuyến tính bình phương nhỏ nhất đối với các cặp h_2a – c_a, h_2b – c_b, h_2c – c_c và h_2d – c_d, với c_a, c_b, c_c và c_d là các biến thiên tự do, cho các hệ số hồi qui, a và b trong công thức sau:

h₂ = a + b x c_L

trong đó

h₂ là giá trị bằng số của chiều cao pic lactuloza được coi là biến thiên phụ thuộc trong hồi qui;

c_L là giá trị nồng độ của lactuloza, miligam trên 50 ml được coi là biến thiên độc lập trong hồi qui

9.2. Tính hàm lượng lactuloza

Tính hàm lượng lactuloza của mẫu thử, w_l, được biểu thị bằng miligam trên lít theo công thức sau:

Trong đó:

h_2a là giá trị số của chiều cao pic lactuloza của mẫu;

V_s là giá trị bằng số thể tích của mẫu thử, tính bằng mililít (8.1.1);

d là hệ số pha loãng, được biểu thị bằng miligam trên lít (d=10³)

10. Độ chính xác

10.1. Thử liên phòng thí nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả thử liên phòng thí nghiệm. Các chi tiết thử liên phòng thí nghiệm này về độ chính xác của phương pháp được tổng kết trong phụ lục B và được ghi trong phần tài liệu tham khảo [4].

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau trong một phòng thí nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, lớn hơn 6,0% (tính tương đối) trung bình cộng của hai kết quả không vượt quá 5% các trường hợp.

Hệ số biến thiên về độ lặp lại, biểu thị độ biến thiên các kết quả phân tích độc lập thu được trong cùng điều kiện lặp lại, không được lớn hơn 2%.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau, do các nhà phân tích khác nhau sử dụng các thiết bị khác nhau, lớn hơn 20% (tính tương đối) trung bình cộng của hai kết quả không vượt quá 5% các trường hợp.

Hệ số biến thiên về độ tái lập, biểu thị độ biến thiên các kết quả phân tích độc lập thu được trong cùng điều kiện tái lập, không được lớn hơn 7%.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

– kết quả thu được;

– nếu kiểm tra độ lặp lại, nêu kết quả thu được.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

THÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ

PHỤ LỤC B

(tham khảo)

KẾT QUẢ CỦA CÁC THỬ NGHIỆM LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC C

(tham khảo)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa – Lấy mẫu

[2] ISO 5725-1: 1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement method and results – Part 1: General principles and definitions.

[3] ISO 5725-2: 1994, Accuracy (trueness and precision) hoặc measurement method and results – Part 2: A basic method for the determination of repeatability and reproducbility of a standard measurement method.

[4] Mottar.J. Milk. Bullentin of the international Dairy Federation, No.285 (1993), pp 86-97.