TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11476:2016

NƯỚC QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NARINGIN VÀ NEOHESPERIDIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Fruit juice – Determination of naringin and neohesperidin content – Liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 11476:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 999.05 Naringin and neohesperidin in orange juice. Liquid chromatography method;

TCVN 11476:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F9 Đồ uống biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

NƯỚC QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NARINGIN VÀ NEOHESPERIDIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Fruit juices – Determination of naringin and neohesperidin content – Liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng naringin và neohesperidin trong nước quả.

Phương pháp này đã được thử nghiệm liên phòng trên các sản phẩm nước cam và nước nho chứa hàm lượng mỗi chất naringin và neohesperidin từ 5 μg/g đến 50 μg/g.

2  Nguyên tắc

Lọc mẫu nước quả để loại bỏ bã rồi bơm mẫu lên cột C18 để tách naringin và neohesperidin. Sử dụng detector UV ở bước sóng 280 nm để xác định hàm lượng naringin và neohesperidin.

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước đã khử ion hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Axetonitril (C₂H₃N), loại dùng cho LC.

3.2  Hỗn hợp axetonitril trong nước, 40 % (thể tích).

3.3  Axit axetic (CH₃COOH) băng, loại dùng cho LC.

3.4  Dimetylformamid, loại dùng cho LC.

3.5  Dimetylsulfoxid, loại dùng cho LC.

3.6  Pha động (dung dịch axit axetic-axetonitril, 81 + 19)

Cho từ 1 ml đến 10 ml axit axetic băng (3.3) vào nước để có tổng thể tích 2 lít. Axit axetic có thể giảm thiểu pic kéo dài và tăng hiệu quả cột. Lượng axit axetic cần thiết phụ thuộc vào các cột được sử dụng và việc thêm axit axetic vào pha động làm tăng khả năng nhiễu từ natri benzoat và kali sorbat cho các pic quan tâm. Trộn 1 620 ml nước hoặc dung dịch axit axetic với 380 ml axetonitril (3.1).

3.7  Dung dịch chuẩn gốc A: naringin, hesperidin và neohesperidin, 500 μg/g

Cân 0,05 g naringin, 0,05 g hesperidin và 0,05 g neohesperidin, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml (4.5). Thêm 10 ml dimetylforamid (3.4) hoặc dimetylsulfoxid (3.5), trộn cho đến khi hòa tan và thêm pha động (3.6) đến vạch.

3.8  Dung dịch chuẩn gốc B: natri benzoat và kali sorbat, 500 μg/g

Cân 0,05 g kali sorbat và 0,05 g natri benzoat, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml (4.5) và thêm pha động (3.6) đến vạch.

3.9  Dung dịch chuẩn làm việc

Chuẩn bị năm dung dịch pha loãng (1 : 5, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 50, 1 : 100) của dung dịch chuẩn gốc A (3.7) trong pha động (3.6) để thu được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 100 μg/g, 50 μg/g, 25 μg/g, 10 μg/g và 5 μg/g. Cho 10 ml dung dịch chuẩn gốc A (3.7) và 10 ml dung dịch chuẩn gốc B (3.8) vào bình định mức 100 ml (4.5) để thu được một dung dịch chuẩn dùng để kiểm tra sự phù hợp của pha động và cột. Thêm pha động (3.6) đến vạch.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Máy sắc ký lỏng, gồm có bơm, bộ bơm mẫu tự động hoặc thủ công, detector UV, bộ tích phân hoặc hệ thống thu thập dữ liệu và lò cột.

4.2  Cột

Vật liệu nhồi silica có độ tinh khiết cao có tạp chất kim loại với hàm lượng rất thấp liên kết với pha C18. Các cột mới cần đáp ứng các yêu cầu sau đây để dùng cho phép nội suy:

– Số đĩa lý thuyết (N) đối với naringin là 2 000. Giá trị N được tính theo Công thức (1):

N= 5,545 (t_r/W_h)²  (1)

Trong đó:

t_r  là thời gian lưu của pic, tính bằng giây (s);

W_h là chiều rộng pic tại nửa chiều cao pic, tính bằng giây (s).

– Độ phân giải (R) giữa naringin và hesperidin phải ≥ 1,5.

  (2)

Trong đó:

t_r(naringin)  là thời gian lưu của pic naringin, tính bằng giây (s);

t_{r(hesperidin)}  là thời gian lưu của pic hesperidin, tính bằng giây (s);

W_h(naringin)  là chiều rộng pic tại nửa chiều cao pic, tính bằng giây (s);

W_{h(hesperidin)}  là chiều rộng pic tại nửa chiều cao pic, tính bằng giây (s).

Hệ số đối xứng pic (S) là từ 0,9 đến 1,4 đối với hesperidin.

S = A_0,1h/B_0,1h  (3)

Trong đó:

A_0,1h  là chiều rộng pic ở góc vuông bên trái tại 10 % chiều cao pic, của đường thẳng từ đỉnh pic đến đường nền và vuông góc với đường nền, tính bằng giây (s);

B_0,1h  là chiều rộng pic ở góc vuông bên phải tại 10 % chiều cao pic, tính bằng giây (s).

– Hệ số dung lượng cột (k’) < 10 đối với neohesperidin.

k’ = (t_r – t_d)/t_d                 (4)

Trong đó:

t_r  được giải thích như trong Công thức (1);

t_d  là thời gian lưu của mẫu thêm chuẩn bơm vào (thời gian cần để dung môi chảy qua cột), tính bằng giây (s).

Các cột sau đây 1)đáp ứng các yêu cầu mà không cần thêm axit axetic vào pha động:

Cột Kromasil C18 cỡ hạt 5 μm, kích thước 15 mm x 4,6 mm, tốc độ dòng 1 ml/min;

Cột Prodigy C18 cỡ hạt 5 μm, kích thước 150 mm x 3 mm, tốc độ dòng 0,5 ml/min;

Cột Inertsil ODS-2 cỡ hạt 5 μm, kích thước 150 mm x 4 mm, tốc độ dòng từ 0,8 ml/min đến 1,0 ml/min.

Có thể sử dụng các loại cột C18 khác nhưng cần bổ sung axit axetic vào pha động để thu được các giá trị đối xứng và số lượng đĩa chấp nhận được.

4.3  Tiền cột, có chất lượng cao, được nhồi C18 liên kết với silica có chứa một ít các tạp chất kim loại.

4.4  Bộ lọc màng, nếu mẫu được pha loãng với dung dịch axetonitril 40 % theo tỷ lệ 1:1 thì sử dụng bộ lọc nylon có bộ lọc sơ cấp sợi thủy tinh, kích thước 25 mm x 0,45 μm hoặc nếu không pha loãng mẫu thì sử dụng bộ lọc Anotop Plus kích thước 25 mm x 0,2 μm hoặc cellulose axetat để lọc các hạt.

4.5  Bình định mức, dung tích 100 ml.

4.6  Máy ly tâm, có thể vận hành ở gia tốc hướng tâm 10 000 g.

4.7  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Các bên liên quan tự thỏa thuận về việc lấy mẫu.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Ly tâm từ 10 ml đến 20 ml mẫu thử ở gia tốc 10 000 g ở 25 °C trong 10 min. Lọc qua bộ lọc màng (4.4).

Nếu không có sẵn máy ly tâm thì trộn kỹ mẫu thử rồi pha loãng với hỗn hợp axetonitril trong nước (3.2) theo tỷ lệ thể tích 1:1. Lọc mẫu thử qua bộ lọc nylon (4.4). Sự hấp phụ các flavonoid bởi nylon trong các dung dịch mẫu thử được khắc phục bằng axetonitril. Không sử dụng bộ lọc có màng lọc cellulose axetat, versapor hoặc polysulfon vì chúng không bền với axetonitril. Không sử dụng các bộ lọc có màng lọc PVDF hoặc PTFE vì các vật liệu này hấp thụ flavonoid từ nền mẫu.

6.2  Xác định

Các điều kiện vận hành sau đây được coi là thích hợp:

Tốc độ dòng: 1,0ml/min;

Thể tích bơm: 20 μl (hoặc 40 μl nếu phần mẫu thử được pha loãng);

Detector UV: ở bước sóng 280 nm, 0,05 đơn vị hấp thụ trên toàn thang đo (AUFS);

Nhiệt độ cột: được kiểm soát ở nhiệt độ khoảng từ 25 °C đến 30 °C.

Bơm dung dịch chuẩn làm việc (3.9) chứa dung dịch chuẩn gốc B (3.8) và chỉnh nồng độ dung môi sao cho độ phân giải (R) giữa naringin và hesperidin ít nhất là 1,5, cả naringin và neohesperidin được phân giải ra khỏi natri benzoat và kali sorbat (R ≥ 1,5) và k’ < 10 đối với neohesperidin. Sử dụng thể tích bơm là 20 μl, 10 μl hoặc 5 μl tùy thuộc vào đường kính trong của cột phân tích được sử dụng (tương ứng 4,6 mm, 3,0 mm hoặc 2,0 mm).

Bơm phần mẫu thử và cài đặt thời gian chạy trong 60 min. Pic nhiễu sẽ được rửa giải trong 25 min đến 60 min trên các cột dài 150 mm hoặc ngắn hơn. Đối với các cột dài hơn (từ 250 mm đến 300 mm), pic nhiễu có thể không rửa giải được trong 80 min đến 100 min. Trong thời gian bơm, một vài pic xuất hiện muộn không làm nhiễu các phép phân tích tiếp theo.

Nên kiểm soát nhiệt độ cột phân tích và sử dụng hệ thống bơm mẫu tự động. Hiệu chuẩn thiết bị, sử dụng các dung dịch chuẩn và kiểm tra độ tuyến tính của thiết bị. Nếu kết quả không tuyến tính, cần hiệu chuẩn đa điểm thiết bị đối với mỗi lần phân tích. Nếu tuyến tính thì bơm lặp lại một dung dịch chuẩn dùng để hiệu chuẩn là đủ đối với các cài đặt tiếp theo.

7  Tính kết quả

Việc nhận biết các pic được cải thiện nếu sử dụng thời gian lưu tương đối (RRT) thay vì thời gian lưu. Sử dụng tỷ lệ thời gian lưu tương đối so với thời gian lưu của hesperidin.

Thời gian lưu tương đối của thành phần thứ x, RRT_X, được tính theo Công thức (5):

  (5)

Trong đó:

RT_x  là thời gian lưu của thành phần thứ x;

RT_hesperidin là thời gian lưu của hesperidin.

Định lượng naringin và neohesperidin bằng diện tích pic.

a) Nếu đáp ứng của detector là không tuyến tính thì có thể tính kết quả thông qua bộ tích phân theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc sử dụng đường chuẩn.

Nồng độ naringin và neohesperidin trong mẫu thử, X, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (6):

                       (6)
C  là nồng độ naringin và neohesperidin trong dung dịch thử, tính được từ bộ tích phân hoặc từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên gam (μg/g);

DF  là hệ số pha loãng.

b) Nếu đáp ứng của detector là tuyến tính thì tính hệ số đáp ứng đối với từng thành phần chất chuẩn, RF_x, theo Công thức (7):

  (7)

trong đó:

S_x  là diện tích trung bình của thành phần thứ x;

C_x  là nồng của độ thành phần thứ x trong dung dịch chuẩn.

Nồng độ naringin và neohesperidin trong mẫu thử, X, biểu thị bằng microgam trên gam (μg/g), được tính theo Công thức (8):

  (8)

trong đó:

S_x  là diện tích của thành phần thứ x;

DF  là hệ số pha loãng;

RF_x  là hệ số đáp ứng của thành phần thứ x, tính theo Công thức (7).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) kết quả thử thu được;

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 – Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với phép xác định naringin

Bảng A.2 – Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với phép xác định neohesperidin