TIÊU CHUẨN NGÀNH 10TCN 422:2000 VỀ NÔNG SẢN THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIZIN TRONG CÁC LOẠI HẠT – PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ DO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN NGÀNH

10TCN 422:2000

NÔNG SẢN THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIZIN TRONG CÁC LOẠI HẠT. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

10TCN 422-2000
(Ban hành theo QĐ 57/2000/QĐ/BNN-KHCN ngày 23/5/2000)

Tiêu chuẩn này áp dụng cho các loại hạt ngũ cốc (gạo, mỳ, ngô…), hạt đậu đỗ (đậu tương, đậu xanh…) và quy định phép thử xác định hàm lượng lizin bằng phương pháp quang phổ.

1. Lấy mẫu thử

Tiến hành lấy mẫu theo TCVN 5451-91 (ISO 950-1979)

2. Nguyên tắc

Dựa trên phản ứng tạo phức màu của các nhóm e-NH₂ tự do của lizin trong phân tử protein với thuốc thử ninhydrin và đo độ hấp thụ quang học của phức màu tạo thành ở bước sóng 540nm. Dung dịch tiêu chuẩn được sử dụng là dung dịch lơxin vì phân tử lơxin tương đương với lizin và chỉ chứa 1 nhóm e-NH₂.

3. Thuốc thử

Tất cả thuốc thử phải có chất lượng tinh khiết phân tích. Nước sử dụng là nước cất hoặc là nước có độ tinh khiết tương đương.

3.1 Dung dịch đệm

Hoà tan 30g natri formiat trong 60ml nước cất, thêm 10ml dung dịch axit formic 86-88% và thêm tiếp nước cất cho đủ 100ml.

3.2 Thuốc thử ninhydrin

Cho 1g ninhydrin tinh khiết và 1g CdCl₂.2,5H₂O vào bình tối có nút mài. Thêm 25ml dung dịch đệm (3.1) và 75ml etylen glycol, lắc đều đến tan hoàn toàn. Thuốc thử được ổn định trong 1 tháng ở nhiệt độ 4⁰C , trong bóng tối.

3.3 Dung dịch rượu etylic 20% và 95%.

3.4 Dung dịch natri cacbonat 2% và 4%

3.5 Dung dịch lơxin chuẩn

Cân 100mg lơxin tinh khiết với độ chính xác 0,1mg cho vào bình định mức 100ml, hoà tan hoàn toàn bằng dung dịch rượu etylic 20% và đưa thể tích đến vạch định mức bằng dung dịch này. 1ml dung dịch lơxin chuẩn chứa 1mg lơxin.

4. Dụng cụ

Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g

Máy nghiền mẫu

Rây có lỗ sàng 250mm

Quang phổ kế có bước sóng 540nm.

Nồi cách thuỷ có điều chỉnh nhiệt độ tự động

Ống nghiệm cỡ 18x150mm

Bình định mức dung tích 100, 500ml.

Pipet chia độ dung tích 1, 2, 10, 20ml

Giá ống nghiệm bằng nhôm

Phễu lọc có đường kính 4,0 – 4,5cm

Giấy lọc định lượng.

5. Tiến hành thử

5.1. Xây dựng đồ thị chuẩn

Cho vào các bình định mức dung tích 100ml lần lượt 0, 10, 20, 30 và 40ml dung dịch chuẩn gốc lơxin (mục 3.5). Dùng dung dịch rượu etylic 20% đưa thể tích đến vạch mức và lắc đều. Nồng độ lơxin trong các dung dịch chuẩn tương ứng sẽ là 0, 100, 200, 300 và 400mg/ml. Dùng pipet hút chính xác 0,5ml mỗi dung dịch chuẩn này cho lần lượt vào các ống nghiệm. Thêm tiếp vào mỗi ống nghiệm 0,5ml dung dịch Na₂CO₃ 4% và 2ml thuốc thử ninhydrin. Lắc đều mẫu và đun trên nồi cách thuỷ 30′. Sau đó làm lạnh bằng cách nhúng cả giá ống nghiệm vào nước. Thêm tiếp vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch rượu etylic 95% lắc kỹ và đo độ hấp thụ quang học trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm.

Xây dựng đồ thị chuẩn với trục tung là các giá trị độ hấp thụ quang học đo được, trục hoành là nồng độ của các dung dịch lơxin chuẩn từ 0 đến 400mg/1ml.

5.2. Chuẩn bị mẫu thử

Từ mẫu trung bình nghiền khoảng 10g mẫu đến kích thước lọt hoàn toàn qua lỗ sàng 250mm.

5.3. Tiến hành

Cho vào ống nghiệm 200-250mg bột thuỷ tinh sạch, cân chính xác 30mg mẫu thử đã được chuẩn bị theo (5.1) cho vào mỗi ống nghiệm. Mỗi mẫu tiến hành 2 lần song song. Thêm vào ống nghiệm 1ml dung dịch Na₂CO₃ 2%. Trộn đều mẫu với bột thuỷ tinh, đặt vào giá ống nghiệm và đặt vào bếp cách thuỷ đã đạt nhiệt độ 80⁰C, giữ trong10phút. Dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều dung dịch thành thể đồng nhất. Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml ninhydrin. Khuấy đều mẫu và đun trên nồi cách thuỷ 30phút. Sau đó làm lạnh bằng cách nhúng cả giá ống nghiệm vào nước. Sau khi nguội, cho vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch rượu etylic 95%, lắc kỹ và lọc qua giấy lọc trên phễu thuỷ tinh đường kính 4,0 – 4,5cm. Đo độ hấp thụ quang học của các dịch lọc trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm, đúng theo trình tự thực hiện khi lên màu.

Nếu gặp mẫu cho màu xanh lam thì có thể pha loãng bằng dung dịch rượu etylic 95% và khi tính toán phải tính đến hệ số pha loãng.

Hàm luợng lizin của các mẫu thử được tính theo đồ thị chuẩn (mục 5.1) ứng với các dung dịch lơxin có nồng độ từ 0 đến 400mg/1ml

6. Tính toán kết quả

6.1. Hàm lượng lizin (X₁, %) trong mẫu thử được tính theo công thức:

Trong đó:

C: nồng độ lơxin trong mẫu thử tìm thấy trên đồ thị chuẩn, mg/ml.

m: khối lượng mẫu thử, mg

1000: hệ số chuyển đổi từ mg sang mg

1,11: hệ số chuyển đổi từ lơxin sang lizin

Kết quả phép thử là trị số trung bình số học của hai lần phân tích song song.

6.2. Hàm lượng lizin trong mẫu thử tính theo chất khô (X₂, %) xác định theo công thức sau:

Trong đó:

X₁: hàm lượng lizin trong mẫu thử ở dạng khô không khí, %

W: độ ẩm của mẫu thử, %

* Chú ý:

Trong nghiên cứu, hàm lượng lizin trong mẫu thử thường tính bằng tỷ lệ phần trăm so với protein (X₃, %), theo công thức sau:

Trong đó:

X₂: hàm lượng lizin trong mẫu thử tính theo chất khô, %

P: hàm lượng protein trong mẫu thử tính theo chất khô, %