TIÊU CHUẨN NGÀNH 28 TCN 185:2003 VỀ MUỐI POLYPHOSPHAT TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ ION DO BỘ THUỶ SẢN BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN NGÀNH

28 TCN 185: 2003

MUỐI POLYPHOSPHAT TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ ION

Polyphosphate in fishery products – Method for quantitative analysis by ion chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng muối polyphosphat bao gồm ortophosphat (monophosphat), pyrophosphat (điphosphat), tripolyphosphat trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký ion.

2. Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Trung tâm Hóa học tư pháp quốc gia của Cục Thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (National Forensic Chemistry Center, U.S. Food and Drug Administration, Cincinnati, Ohio: De- termination of tripolyphosphate and related hydrolysis products in processed shrimp).

3. Nguyên tắc

Polyphosphat trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng nước cất khử ion. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột chiết pha rắn C18. Hàm lượng polyphosphat có trong dịch chiết được xác định trên máy sắc ký ion sử dụng hệ thống phản ứng sau cột với tác chất phản ứng là sắt nitrat trong axit percloric và đầu dò UV tại bước sóng l là 330 cm theo phương pháp ngoại chuẩn.

4. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1. Thiết bị, dụng cụ

4.1.1. Hệ thống máy sắc ký ion có đầu dò UV (sau đây gọi tắt ICUV).

4.1.2. Hệ thống phản ứng sau cột gắn ngay sau cột sắc ký với sơ đồ lắp đặt theo Hình 1; ống phản ứng teflon dung tích 0,5 ml.

4.1.3. Cột sắc ký Dinex Lon Pan AS7 tách an- ion, kích thước cột L x ID: 250 x 4 mm, tiền cột IonPac (4 x 50 mm).

4.1.4. Máy lắc mẫu.

4.1.5. Cần phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.6. Máy ly tâm có khả năng làm việc ở tốc độ 3000 vòng/phút.

4.1.7. Màng lọc mẫu 0,45 âm, loại bằng ny lon chịu dung môi.

4.1.8. Cột chiết pha rắn C18, loại chứa 300 mg C18.

4.1.9. Chai nhựa chứa mẫu dung tích 100 ml.

4.1.10. Xanh thủy tinh hoặc nhựa loại 100 ml.

4.1.11. Bể siêu âm

4.1.12. Dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm.

4.2. Hóa chất

Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng phân tích, gồm:

4.2.1. Chất chuẩn natri tripolyphosphat (Na₅P₃O₁₀) của hãng Monsanto hoặc hãng khác có chỉ số kỹ thuật tương đương.

4.2.2. Chất chuẩn natri pyrophosphat decahyđrat (Na₂P₂O₇.10H₂O) của hãng Aldrich hoặc hãng khác có chỉ số kỹ thuật tương đương.

4.2.3. Chất chuẩn natri phosphat (NaH₂PO₄H₂O) của hãng EM Science hoặc hãng khác có chỉ số kỹ thuật tương đương.

4.2.4. Axit nitric đậm đặc (d = 1,41 g/ml, 65 %).

4.2.5. Axit percloric đậm đặc (d – 1,75 g/ml, 70%).

4.2.6. Sắt nitrat (Fe(NO₃)₃.9H₂O

4.2.7. Metanol

4.2.8. Nước cất khử ion

4.3. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000 g/ml: tùy theo hàm lượng chuẩn trong giấy chứng nhận của các chất chuẩn (4.2.1; 4.2.2 và 4.2.3) để chuẩn bị các dung dịch chuẩn này có hàm lượng 1000 m g/g trong nước cất khử ion (4.2.8).

Chú thích: Bảo quản dung dịch chuẩn trong chai PE ở nhiệt độ phòng trong 1 tháng.

4.3.2. Dung tích chuẩn làm việc

4.3.2.1. Dung dịch chuẩn làm việc ortophosphat: chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn ortophosphat làm việc có nồng độ 10 – 100 m g/ml từ dung dịch chuẩn ortophosphat 1000 m g/ml (4.3.l) bằng cách pha loãng với nước cất khử ion (4.2.8).

4.3.2.2. Dung dịch chuẩn làm việc pyrophosphat: chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn pyrophosphat làm việc có nồng độ 0,5 – 50 m g/ml từ dung dịch chuẩn pyrophosphat 1000 m g/ml (4.3.1) bằng cách pha loãng với nước cất khử ion (4.2.8).

4.3.2.3. Dung dịch chuẩn làm việc tripolyphosphat: chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn tripolyphosphat làm việc có nồng độ 10 – 500 m g/ml từ dung dịch chuẩn tripolyphosphat 1000 m g/ml (4.3.1) bằng cách pha loãng với nước cất khử ion (4.2.8).

Chú thích: Chỉ được sử dụng các loại dung dịch chuẩn làm việc trên đây ngay trong ngày.

4.3.3. Dung dịch axit percloric 2%: hòa tan 28,5 ml axit percloric (4.2.5) bằng nước cất khử ion (4.2.8) trong bình định mức 1 lít rồi định mức đến vạch.

4.3.4. Dung dịch phản ứng sau cột: hòa tan 1 g sắt nitrat (4.2.6) trong 1000 ml dung dịch axit perchloric 2% (4.3.3).

4.3.5. Dung dịch pha động (axit nitric 70 mM): hòa tan 4,82 ml axit nitric đậm đặc rồi định mức đến 1000 ml bằng nước cất khử Ion (4.2.3). Đuổi khí hòa tan bằng cách đặt vào bể siêu âm trong khoảng 10 – 15 phút trước khi chạy máy sắc ký ion.

5. Phương pháp tiến hành

5.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cân chính xác 0,5 g mẫu thủy sản (ký hiệu m) đã được đồng nhất vào trong chai nhựa dung tích 100 ml (4.l.9). Thêm 50 ml nước cất khử ion (4.2.8) vào trong chai rồi lắc mạnh trong 30 phút trên máy lắc mẫu (4.1.4). Sau đó, ly tâm chai trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút trên máy ly tâm (4.1.6). Lọc dịch chiết qua màng lọc m g 0,45 (4.1.7).

5.2. Chuẩn bị mẫu trắng

Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử nhưng thay 0,5 g thủy sản bằng 0,5 ml nước cất đã khử ion.

5.3. Làm sạch dịch chiết

5.3.1. Chuẩn bị cột

Nối cột chiết pha rắn C18 (4.1.8) vào đầu ra của một xilanh thủy tinh 100 ml (4.1.10). Thêm lần lượt 10 ml metanol (4.2.7), 10 ml nước cất đã khử ion vào xanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột.

5.3.2. Làm sạch dịch chiết

Cho dịch chiết thu được tại (5.1) và (5.2) vào các cột C18 đã được chuẩn bị (5.3.1). Sau khi cho dịch chiết vào cột, thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 100 ml (đã bỏ 2 ml đầu). Sau đó, tráng rửa bình chứa 3 lần, mỗi lần bằng 2 ml nước cất khử ion (4.2.8). Cho nước tráng qua cột rồi gom dịch qua cột vào bình định mức trên. Định mức tới vạch bằng nước cất (ký hiệu v). Tiến hành phân tích các dịch thu được trên máy sắc ký ion theo Điều 5.4.

5.4. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký ion

5.4.1. Điều kiện phân tích

5.4.1.1. Đặt chế độ làm việc cho máy sắc ký ion như sau:

a) Cột sắc ký ion: Dionex IonPac (L x ID: 250 x 4 mm, tiền cột IonPac NG1

(L x ID: 4 x 50mm).

Nhiệt độ cột: Nhiệt độ trong phòng.

c) Pha động: Dung dịch axit Nitric 70 mm (4.3.5).

d) Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

đ) Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV là 330 nm

e) Thể tích tiêm: 100 m l

5.4.1.2. Điều kiện trong hệ thống phản ứng sau cột:

a) Tác nhân: 1g/l sắt nitrat trong axit Percloric 2 % (4.3.4). Tốc độ dòng là 0,5 ml/phút:

b) Nhiệt độ phản ứng trong ống teflon (4.3.4): nhiệt độ trong phòng.

5.4.2. Ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động.

5.4.3. Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.2) vào máy sắc ký. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ từng loại phosphat theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).

5.4.4. Tiêm dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu trắng đã được làm sạch (5.3.2) vào hệ thống sắc ký, mỗi mẫu 2 lần. Tính kết quả thu được theo Điều 6.

5.5. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.5.1. Độ lặp lại của 2 lần tiêm

Độ lệch chuẩn (CV_S) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn pyrophosphat 10 m g/ml và 25m g/ml phải nhỏ hơn 1,2 %.

5.5.2. Đường chuẩn đối với mỗi loại phosphat phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R₂) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

Khoảng tuyến tính:

a) Ortophosphat: 10 – 100 m g/ml

b) Pyrophosphat: 0,5 – 50 m g/ml

c) Tripolyphosphat: 10 – 500 m g/ml.

6. Tính kết quả

Hàm lượng các phosphat có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.4.3). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các phosphat có trong mẫu được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C là nồng độ các phosphat có trong mẫu, tính theo m g/g

Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào máy, tính theo đơn vị diện tích.

a, b là các thông số của đường chuẩn được xác định tại Điều 5.4.3.

F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỷ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch v (5.3.2) và khoa lượng mẫu m sử dụng (5.1).