TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10331:2014 VỀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ROBENIDINE – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10331:2014

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ROBENIDINE – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs – Determination of robenidine content – Method using high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 10331:2014 được xây dựng dựa theo Commission regulation (EC) No. 152/2009;

TCVN 10331:2014 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ROBENIDINE – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs – Determination of robenidine content – Method using high-performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng robenidine (1,3-bis [(4-chlorobenzylidene) amino]guanidine-hydrochloride) trong thức ăn chăn nuôi sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Giới hạn định lượng của phương pháp là 5 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi- Chuẩn bị mẫu thử.

3. Nguyên tắc

Mẫu được chiết bằng metanol đã axit hóa. Chất chiết được làm khô và một phần mẫu được làm sạch trên cột nhôm oxit. Robenidine được rửa giải ra khỏi cột bằng metanol, cô đặc và bổ sung một lượng thích hợp pha động. Hàm lượng robenidine được xác định sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo sử dụng detector UV.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1. Metanol.

4.2. Metanol đã axit hóa

Chuyển 4,0 ml axit clohydric (p₂₀ = 1,18 g/ml) vào bình định mức 500 ml, thêm metanol (4.1) đến vạch và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới ngay trước khi sử dụng.

4.3. Axetonitril, loại dùng cho. HPLC.

4.4. Rây phân tử

Loại 3A, cỡ hạt từ 8 mesh đến 12 mesh (hạt cỡ 1,6 mm đến 2,5 mm, nhôm silicat dạng tinh thể, đường kính lỗ 0,3 mm).

4.5. Nhôm oxit có hoạt tính axit, loại I, dùng cho sắc ký cột

Chuyển 100 g nhôm oxit vào bình chứa thích hợp và thêm 2,0 ml nước. Đậy nắp và lắc bình trong khoảng 20 min. Bảo quản bằng vật chứa đậy kín.

4.6. Dung dịch kali dihydro phosphat, c = 0,025 mol/l

Hòa tan 3,40 g kali dihydro phosphat vào nước (loại dùng cho HPLC) trong bình định mức 1 000 ml, thêm nước đến vạch và trộn.

4.7. Dung dịch di-natri hydro phosphat, c = 0,025 mol/l

Hòa tan 3,55 g di-natri hydro phosphat khan (hoặc 4,45 g dạng ngậm hai phân tử nước hoặc 8,95 g dạng ngậm mười phân tử nước) (loại dùng cho HPLC) vào nước đựng trong bình định mức 1 000 ml, thêm nước đến vạch và trộn.

4.8. Pha động dùng cho HPLC

Trộn các thuốc thử sau đây với nhau:

– 650 ml axetonitril (4.3);

– 250 ml nước (loại dùng cho HPLC);

– 50 ml dung dịch kali di-hydro phosphat (4.6);

– 50 ml dung dịch di-natri hydro phosphat (4.7).

Lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,22 μm (5.6) và đuổi khí dung dịch (ví dụ bằng cách siêu âm 10 min).

4.9. Chất chuẩn

Robenidine tinh khiết: 1,3-bis [(4-chlorobenzylidene) amino] guanidine-hydrochloride.

4.9.1. Dung dịch chuẩn gốc robenldine, 300 mg/ml

Cân 30 mg chất chuẩn robenidine (4.9), chính xác đến 0,1 mg. Hòa tan bằng metanol đã axit hóa (4.2) trong bình định mức 100 ml, thêm cùng loại dung môi đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm và bảo quản ở nơi tối.

4.9.2. Dung dịch chuẩn trung gian robenidine, 12 μg/ml

Chuyển 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.9.1) vào bình định mức 250 ml, thêm pha động (4.8) đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm và bảo quản ở nơi tối.

4.9.3. Dung dịch hiệu chuẩn

Chuyển các lượng 5,0 ml, 10,0 ml, 15,0 ml, 20,0 ml và 25,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.9.2) vào một dãy các bình 50 ml đã được hiệu chuẩn, thêm pha động (4.8) đến vạch và trộn. Các dung dịch này chứa tương ứng 1,2 μg/ml, 2,4 μg/ml, 3,6 μg/ml, 4,8 μg/ml và 6,0 μg/ml robenidine. Chuẩn bị các dung dịch này ngay trước khi sử dụng.

4.10. Nước loại dùng cho HPLC

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1. Cột thủy tinh

Cột được làm bằng thủy tinh màu nâu có khóa và có bể chứa dung tích khoảng 150 ml, đường kính trong từ 10 mm đến 15 mm, dài 250 mm.

5.2. Máy lắc cơ học hoặc bộ khuấy từ.

5.3. Bộ cô quay.

5.4. Thiết bị HPLC, có detector UV có thể thay đổi bước sóng hoặc detector mảng diod hoạt động trong phạm vi 250 nm đến 400 nm và có cột sắc ký lỏng, C18, pha đảo, kích thước 300 mm x 4 mm, cỡ hạt 10 μm hoặc loại tương đương.

5.5. Màng lọc bằng sợi thủy tinh (Whatman GF/A hoặc loại tương đương).

5.6. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,22 μm.

5.7. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 μm.

5.8. Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml và 1 000 ml.

5.9. Bình cầu đáy tròn, dung tích 250 ml.

5.10. Bình nón, dung tích 150 ml và 250 ml.

5.11. Cân, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

5.12. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).

8. Cách tiến hành

CHÚ THÍCH: Robenidine rất nhạy với ánh sáng. Sử dụng thủy tinh màu nâu để đựng mẫu.

8.1. Yêu cầu chung

8.1.1. Mẫu trắng cần được phân tích để chắc chắn rằng không chứa robenidine và các chất gây nhiễu.

8.1.2. Cần thực hiện phép thử kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng (8.1.1) bổ sung chất chuẩn robenidine ở mức tương tự có trong mẫu. Để bổ sung robenidine ở mức 60 mg/kg, chuyển 3,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.9.1) vào bình nón 250 ml (5.10). Cho bay hơi dung dịch đến khoảng 0,5 ml dưới dòng khí nitơ. Bổ sung 15 g mẫu trắng, trộn và đợi 10 min trước khi tiếp tục chiết (8.2).

CHÚ THÍCH: Mẫu trắng phải có dạng tương tự mẫu thử và không phát hiện có robenidine.

8.2. Chiết mẫu

Cân khoảng 15 g mẫu đã chuẩn bị, chính xác đến 0,01 g. Chuyển sang bình nón 250 ml (5.10) và thêm 100,0. ml metanol đã axit hóa (4.2), đậy nắp và lắc 1 h trên máy lắc (5.2). Lọc dung dịch qua màng lọc sợi thủy tinh (5.5) và thu lấy dịch lọc vào bình nón 150 ml (5.10). Thêm 7,5 g rây phân tử (4.4), đậy nắp và lắc trong 5 min. Lọc ngay qua màng lọc sợi thủy tinh. Bảo quản dung dịch này để tinh sạch (8.3).

8.3. Tinh sạch

8.3.1. Chuẩn bị cột nhôm oxit

Chèn nút bông thủy tinh nhỏ vào đầu dưới cột thủy tinh (5.1) và lèn chặt bằng đũa thủy tinh. Cân 11,0 g nhôm oxit đã chuẩn bị (4.5) và chuyển sang cột. Chú ý ở giai đoạn này để giảm thiểu tiếp xúc với không khí. Gõ nhẹ vào phía dưới cột nạp để nhôm oxit lắng xuống dưới.

8.3.2. Tinh sạch mẫu

Dùng pipet lấy 5,0 ml dịch chiết mẫu đã chuẩn bị (8.2) chuyển lên cột. Để đầu tip pipet gần thành cột và để cho dung dịch hấp thụ lên nhôm oxit. Rửa giải robenidine ra khỏi cột bằng cách sử dụng 100 ml metanol (4.1) ở tốc độ 2 ml/min đến 3 ml/min và thu lấy dịch rửa giải vào bình cầu đáy tròn 250 ml (5.9). Làm bay hơi dung dịch metanol đến khô dưới áp suất giảm ở 40 °C trên bộ cô quay (5.3). Hòa tan lại cặn trong 3 ml đến 4 ml pha động (4.8) và chuyển nước rửa sang bình định mức 10 ml (5.8). Rửa bình bằng 1 ml đến 2 ml pha động và chuyển nước rửa sang bình định mức. Thêm cùng loại dung môi đến vạch và trộn. Lấy một lượng dung dịch lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 μm (5.7). Sử dụng dung dịch này để phân tích HPLC (8.4).

8.4. Xác định bằng HPLC

8.4.1. Các thông số

Các điều kiện sau đây được dùng để hướng dẫn, có thể sử dụng các điều kiện khác nếu cho kết quả tương đương:

– Cột sắc ký lỏng (5.4),

– Pha động dùng cho HPLC (4.8),

– Tốc độ dòng: từ 1,5 ml/min đến 2 ml/min,

– Bước sóng detector: 317 nm,

– Thể tích bơm: 20 μl đến 50 μl.

Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc ký, bơm vài lần dung dịch hiệu chuẩn (4.9.3) nồng độ 3,6 μg/ml, cho đến khi đạt được chiều cao pic và thời gian lưu ổn định.

8.4.2. Dựng đường chuẩn

Bơm mỗi dung dịch hiệu chuẩn (4.9.3) vài lần và đo chiều cao hoặc diện tích pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn từ chiều cao hoặc diện tích trung bình của pic của các dung dịch hiệu chuẩn trên trục tung và nồng độ tương ứng bằng microgam trên mililit trên trục hoành.

8.4.3. Dung dịch mẫu

Bơm dịch chiết mẫu (8.3.2) vài lần, bằng cách sử dụng cùng một thể tích như đã thực hiện đối với các dung dịch hiệu chuẩn và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của các pic robenidine.

9. Tính kết quả

Từ đường chuẩn (8.4.2), xác định nồng độ của dung dịch mẫu bằng microgam trên mililit theo chiều cao hoặc diện tích trung bình của các pic robenidine của dung dịch mẫu thử.

Hàm lượng robenidine có trong mẫu thử, w, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính bằng công thức sau:

Trong đó:

c là nồng độ robenidine trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

10. Đánh giá xác nhận kết quả

10.1. Nhận biết

Việc nhận biết chất phân tích có thể được khẳng định bằng đồng sắc ký, hoặc bằng cách sử dụng detector mảng diod, bằng cách này so sánh phổ của chất chiết mẫu và của dung dịch hiệu chuẩn (4.9.3) nồng độ 6 μg/ml.

10.1.1. Đồng sắc ký

Chất chiết mẫu được bổ sung một lượng thích hợp dung dịch hiệu chuẩn (4.9.3). Lượng robenidine được bổ sung phải tương tự lượng robenidine dự kiến tìm thấy trong chất chiết mẫu.

Chiều cao pic robenidine phải tăng sau khi bổ sung chất chuẩn và cần tính đến độ pha loãng của dịch chiết. Chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao tối đa chỉ được dao động trong phạm vi ± 10 % chiều rộng tương ứng trước khi bổ sung.

10.1.2. Detector mảng diod

Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau:

(a) bước sóng hấp thụ cực đại của mẫu và của phổ chuẩn, được ghi lại ở đỉnh pic trên sắc ký đồ, phải giống nhau trong một biên độ phụ thuộc vào khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diod, thường là xấp xỉ 2 nm;

(b) trong dải bước sóng từ 250 nm đến 400 nm, sắc ký đồ của mẫu và của chất chuẩn được ghi lại ở đỉnh pic trên sắc ký đồ, không được khác với những phần của phổ trong dải từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này được đáp ứng khi cùng có các cực đại như nhau và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của chất phân tích;

(c) trong dải bước sóng từ 250 nm đến 400 nm, phổ của đỉnh pic và độ dốc hai phía của pic thu được từ dịch chiết mẫu không được khác so với các phần quang phổ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này được đáp ứng khi cùng một cực đại có mặt và khi tất cả các điểm quan sát được có độ lệch giữa các phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của phổ cao nhất.

Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng thì sự có mặt của các chất phân tích không được xác nhận.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá 10 % có hàm lượng robenidine lớn hơn 15 mg/kg.

10.3. Độ thu hồi

Đối với mẫu trắng thêm chuẩn, độ thu hồi ít nhất là 85 %.

11. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Một nghiên cứu cộng tác do châu Âu tổ chức thực hiện trên bốn mẫu thức ăn gia cầm và thức ăn chăn nuôi thỏ ở dạng bột hoặc dạng viên, gồm 12 phòng thử nghiệm tham gia. Các phép phân tích lặp lại đã thực hiện trên mỗi mẫu. Các kết quả được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Kết quả thử nghiệm cộng tác

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử.

e) kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi -Lấy mẫu