TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10640:2014 (EN 15850:2010) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH ZEARALENON TRONG THỰC PHẨM CHỨA NGÔ, BỘT ĐẠI MẠCH, BỘT NGÔ, BỘT NGÔ DẠNG NHUYỄN, BỘT MÌ VÀ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10640:2014

EN 15850:2010

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH ZEARALENON TRONG THỰC PHẨM CHỨA NGÔ, BỘT ĐẠI MẠCH, BỘT NGÔ, BỘT NGÔ DẠNG NHUYỄN, BỘT MÌ VÀ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG

Foodstuffs – Determination of zearanlenone in maize based baby food, barley flour, maize flour, polenta, wheat flour and cereal based foods for infants and young children – HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection

Lời nói đầu

TCVN 10640:2014 hoàn toàn tương đương với EN 15850:2010;

TCVN 10640:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH ZEARALENON TRONG THỰC PHẨM CHỨA NGÔ, BỘT ĐẠI MẠCH, BỘT NGÔ, BỘT NGÔ DẠNG NHUYỄN, BỘT MÌ VÀ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG

Foodstuffs – Determination of zearanlenone in maize based baby food, barley flour, maize flour, polenta, wheat flour and cereal based foods for infants and young children – HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định zearalenon trong ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột ngô dạng nhuyễn, bột mì và ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và sử dụng detector huỳnh quang. Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong hai nghiên cứu liên phòng. Nghiên cứu đầu tiên phân tích các mẫu thức ăn cho trẻ nhỏ chứa ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột ngô dạng nhuyễn, bột mì chứa zearalenon trong dải từ 10 mg/kg đến 335 mg/kg và nghiên cứu thứ hai đối với các mẫu ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ chứa zearalenon trong dải từ 9 mg/kg đến 44 mg/kg.

Thông tin thêm về đánh giá xác nhận, xem Điều 9 và Phụ lục B.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung(nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Phần mẫu thử được chiết bằng dung dịch metanol hoặc axetonitril tùy thuộc vào sản phẩm được phân tích. Dịch chiết thu được sau đó được pha loãng bằng dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS) và được đưa lên cột ái lực miễn nhiễm chứa các kháng thể đặc thù đối với zearalenon. Zearalenon được tinh sạch và làm giàu trên cột và được tách ra khỏi các kháng thể sử dụng axetonitril hoặc metanol làm dung môi rửa giải. Zearalenon được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với detector huỳnh quang.

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với loại 1 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), trừ khi có quy định khác. Dung môi phải đạt chất lượng để phân tích HPLC, trừ khi có quy định khác. Có thể sử dụng các dung dịch bán sẵn có đặc tính tương đương với các dung dịch đã được liệt kê dưới đây

4.2. Dinatri hydro phosphat, Na₂HPO₄ khan hoặc Na₂HPO₄.12H₂O.

4.3. Kali clorua (KCI).

4.4. Kali dihydro phosphat, KH₂PO₄.

4.5. Natri clorua (NaCI).

4.6. Natri hydroxit (NaOH).

4.7. Dung dịch axit clohydric, w(HCI) = 37 % khối lượng trong nước.

4.8. Dung dịch axit clohydric, c(HCI) = 0,1 mol/l.

Pha loãng 8,28 ml dung dịch axit clohydric (4.7) trong nước đến 1 lít.

4.9. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l.

Hòa tan 4 g natri hydroxit (4.6) trong 1 lít nước.

4.10. Dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS), c(NaCI) = 120 mmol/l, c(KCI) = 2,7 mmol/l, c(đệm phosphat) = 10 mmol/l, pH = 7,4.

Hòa tan 8,0 g natri clorua (4.5), 1,2 g dinatri hydro phosphat khan hoặc 2,9 g Na₂HPO₄.12H₂O (4.2), 0,2 g kali dihydro phosphat (4.4) và 0,2 g kali clorua (4.3) trong 900 ml nước. Sau khi hòa tan, chỉnh pH đến 7.4 bằng dung dịch axit clohydric (4.8) hoặc dung dịch natri hydroxit (4.9), sau đó pha loãng bằng nước đến 1 lít.

Ngoài ra, có thể chuẩn bị dung dịch PBS có các đặc tính tương đương từ PBS bán sẵn trên thị trường.

4.11. Axetonitril

Cảnh báo – Axetonitril là chất độc hại và các mẫu phải được pha trộn bằng máy trộn chống nổ trong tủ hút. Sau khi trộn, mẫu phải được lọc trong tủ hút.

4.12. Metanol, loại dùng cho HPLC.

4.13. Metanol, loại kỹ thuật.

4.14. Dung môi chiết A

Trộn 75 thể tích axetonitril (4.11) với 25 thể tích nước.

4.15. Dung môi A dùng cho phân tích HPLC

Trộn 4 thể tích axetonitril (4.11) với 6 thể tích nước.

4.16. Pha động A dùng cho HPLC

Trộn 53 thể tích axetonitril (4.11) với 47 thể tích nước. Lọc và khử khí pha động HPLC trước khi sử dụng.

4.17. Dung môi chiết B

Trộn 75 thể tích metanol (4.13) với 25 thể tích nước.

4.18. Dung môi rửa

Trộn 15 thể tích metanol (4.12) với 85 thể tích PBS (4.10).

4.19. Dung môi bơm B dùng cho phân tích HPLC

Trộn 5 thể tích metanol (4.12) với 5 thể tích nước.

4.20. Pha động B dùng cho HPLC

Trộn 75 thể tích metanol (4.12) với 25 thể tích nước. Lọc và khử khí pha động HPLC trước khi sử dụng.

4.21. Cột ái lực miễn nhiễm

Cột ái lực miễn nhiễm chứa các kháng thể hấp thu zearalenon. Cột có khả năng tách được không nhỏ hơn 1 500 ng zearalenon và có độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % khi dùng 10 mldịch chiết chứa 75 ng zearalenon trong hỗn hợp của 15 thể tích metanol và 85 thể tích PBS.

4.22. Zearalenon, dạng tinh thể hoặc dạng màng trong ampun, độ tinh khiết không nhỏ hơn 98 % phần khối lượng hoặc ở dạng dung dịch zearlenon có bán sẵn trên thị trường.

Cảnh báo – Zearalenon là hợp chất oestrogen và cần được xử lý đặc biệt cẩn thận. Luôn phải mang găng tay và kính bảo hộ, giai đoạn chuẩn bị mẫu và chất chuẩn phải được thực hiện trong tủ hút.

4.23. Dung dịch gốc zearalenon, c » 200 mg/ml.

Cho 4,0 ml axetonitril (4.11) vào 5 mg zearalenon (4.22) để tạo thành dung dịch có nồng độ khối lượng khoảng 1,25 mg/ml. Pha loãng 800 ml dung dịch này đến 5 ml bằng axetonitril (4.11) để tạo thành dung dịch gốc có nồng độ khoảng 200 mg/ml.

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh đông ở – 18 °C đến – 20 °C. Để dung dịch đạt đến nhiệt độ phòng trước khi mở. Dung dịch được bảo quản theo cách này bền được 12 tháng. Xác nhận lại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để lâu hơn sáu tháng.

4.24. Dung dịch thêm chuẩn zearalenon, c » 10 mg/ml

Pha loãng 250 ml dung dịch gốc (4.23) với 4,75 ml axetonitril (4.11) để tạo thành dung dịch có nồng độ khối lượng khoảng 10 mg/ml.

Để xác định nồng độ chính xác, ghi lại đường hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng trong khoảng từ 200 nm tới 300 nm trong cuvet thạch anh 1 cm của máy đo phổ (5.25) với axetonitril (4.11) làm dung dịch so sánh. Xác định bước sóng cho độ hấp thụ cực đại (A khoảng 274 nm). Tính nồng độ khối lượng của zearalenon, r_zon, tính bằng microgam trên mililit sử dụng công thức (1):

r_zon =  (1)

Trong đó:

A_max là độ hấp thụ xác định được tại điểm cực đại của đường hấp thụ (274 nm);

M là khối lượng phân tử của zearalenon, tính bằng gam trên mol (M = 318,4 g/mol);

e là hệ số hấp thụ phân tử của zearalenon trong axetronitril (4.11), tính bằng mét vuông trênmol, (1 262 m²/mol, xem [1]);

b là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng xentimet (cm).

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh đông ở – 18 °C đến – 20 °C. Để dung dịch đạt đến nhiệt độ phòng trước khi mở. Dung dịch được bảo quản theo cách này bền được 12 tháng. Xác nhận lại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để lâu hơn sáu tháng.

4.25. Dung dịch chuẩn zearalenon A, r = 2 mg/ml, để phân tích mẫu thức ăn dành cho trẻ nhỏ có chứa ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột ngô dạng nhuyễn và bột mì.

Chuyển một lượng dung dịch thêm chuẩn (4.24) chứa tương ứng với 10 mg zearalenon sang một lọ (5 9) khác hoặc bình định mức đã hiệu chuẩn (5.10). Thêm axetonitril (4.11) để thu được tổng thể tích là 5 ml.

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh đông ở – 18 °C đến – 20 °C. Để đạt đến nhiệt độ phòng trước khi mở. Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền được 12 tháng. Xác nhận lại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để quá sáu tháng.

4.26. Dung dịch chuẩn zearalenon B, r = 0,4 mg/ml, để phân tích mẫu ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Chuyển một lượng dung dịch thêm chuẩn (4.24) chứa tương ứng với 2 mg zearalenon sang một lọ (5.9) khác hoặc bình định mức đã hiệu chuẩn (5.10). Thêm axetonitril (4.11) với tổng thể tích là 5 ml.

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh đông ở – 18 °C đến – 20 °C. Để dung dịch đạt đến nhiệt độ phòng trước khi mở. Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền được 12 tháng. Xác nhận lại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để quá sáu tháng.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

5.2. Máy nghiền tốc độ cao hoặc máy đông hóa.

5.3. Cân phân tích, có thể cân đến 0,000 1 g.

5.4. Cân kỹ thuật, có thể cân đến 0,1 g.

5.5. Máy lắc ngang hoặc máy lắc đứng có thể điều chỉnh được tốc độ.

5.6. Máy trộn Vortex, hoặc loại tương đương.

5.7. Máy xay, có các loại rây khác nhau.

5.8. Máy trộn.

5.9. Lọ thủy tinh, có các kích cỡ khác nhau.

5.10. Bình định mức, dung tích 3 ml, 5 ml và 10 ml.

5.11. Cốc có mỏ, dung tích 250 ml.

5.12. Bình nón, có nắp vặn hoặc nắp bằng thủy tinh dung tích 100 ml, 250 ml và 500 ml.

5.13. Giấy lọc, định tính, dai, chảy nhanh, đường kính 24 cm, cỡ lỗ 30 mm, được gấp nếp trước hoặc loại tương đương.

5.14. Bộ lọc vi sợi thủy tinh, ví dụ, cỡ lỗ 1,6 mm hoặc tương đương.

5.15. Pipet, ví dụ, dung tích 25 ml đến 250 ml, 1 ml, 5 ml và 10 ml.

5.16. Xyranh hoặc micropipet, kín khí, ví dụ dung tích 100 ml, 500 ml, 1 000 ml.

5.17. Hệ thống tự động hoặc hệ thống chân không, thích hợp với các cột ái lực miễn nhiễm.

5.18. Bầu chứa, dung tích từ 50 ml đến 75 ml và các bộ phận để gắn với cột ái lực miễn nhiễm.

5.19. Xyranh bằng chất dẻo, dung tích 5 ml.

5.20. Bơm chân không, ví dụ có thể hút chân không 1 kPa và/hoặc bơm 18 l/min.

5.21. Hệ thống lọc chân không để lọc dung môi, được gắn với bộ lọc vi sợi thủy tinh 47 mm.

5.22. Bộ lọc xyranh dùng một lần, bằng nylon có cỡ lỗ 0,45 mm.

Trước khi sử dụng, kiểm tra zearalenon có bị thất thoát trong quá trình lọc hay không (phép thử độ thu hồi).

CHÚ THÍCH Các vật liệu lọc khác dùng để có thể giữ lại zearalenon.

5.23. Bể siêu âm.

5.24. Thiết bị HPLC, bao gồm thiết bị như sau:

5.24.1. Hệ thống bơm, có khả năng bơm ví dụ từ 100 ml đến 300 ml.

5.24.2. Bơm pha dộng, không xung, có khả năng duy trì tốc độ dòng từ 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min.

5.24.3. Cột phân tách HPLC pha đảo, cho phép tách zearalenon ra khỏi và các thành phần gây nhiễu khác. Phần chồng lấn lên nhau tối đa phải nhỏ hơn 10 % chiều cao pic.

Cột Phenomenex Prodigy^® ODS 31) (150 mm x 4,6 mm đường kính trong, cỡ hạt 5 mm, cỡ lỗ 25 mm) hoặc Spherisorb^{® 1)} ODS-2 Excel (250 mm x 4,6 mm đường kính trong, cỡ hạt 5 mm, cỡ lỗ 25 mm) cho thấy phù hợp khi sử dụng pha động A (4.16).

Cột Supelcosil^{® 1)}(C₁₈), (kích thước 250 mm x 4,6 mm đường kính trong, cỡ hạt 5 mm, cỡ lỗ 18 mm) được nhồi 12 % cacbon hoặc loại tương tự cho thấy phù hợp khi được sử dụng với pha động B (4.20).

5.24.4. Tiền cột, tốt nhất là có vật liệu pha tĩnh giống với vật liệu pha tĩnh của cột phân tích, đường kính trong 4 mm, cỡ hạt 5 mm.

5.24.5. Detector huỳnh quang, lắp được cuvet dòng chảy và thích hợp để đo ở bước sóng kích thích 274 nm hoặc 275 nm và bước sóng phát xạ ở 446 mm hoặc 450 mm.

5.24.6. Bộ ghi, bộ tích phân hoặc máy tính dựa vào hệ thống phân tích dữ liệu.

5.24.7. Bộ khử khí (tùy chọn).

5.25. Máy đo phổ UV, có các cuvet thạch anh thích hợp.

6. Cách tiến hành

6.1. Chiết

6.1.1. Chiết bột đại mạch, bột ngô, bột ngô nhuyễn, bột mì và thức ăn chứa ngô dành cho trẻ nhỏ

Cân 25 g phần mẫu thử đã nghiền, chính xác đến 0,1 g, cho vào cốc có mỏ (5.11). Thêm 100 ml dung môi chiết A (4.14). Đồng hóa 3 min trong máy đồng hóa (5.2) ở tốc độ cao. Lọc dịch chiết qua giấy lọc (5.13). Chuyển 88 ml PBS (4.10) vào bình nón (5.12). Dùng pipet (5.15) cho 12 ml dịch lọc và lắc để trộn kỹ bằng tay. Nếu khi thêm phần dịch lọc vào PBS mà mẫu trở nên vẩn đục thì lọc qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (5.14) trước khi làm sạch.

6.1.2. Chiết ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Cân 20 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón có nắp vặn (5.12). Thêm 150 ml dịch chiết dung môi B (4.17). Lắc nhanh bằng tay trong vài giây để thu được huyền phù đồng nhất, sau đó lắc thêm 1 h trong máy lắc (5.5) hoặc cho vào bể siêu âm (5.23) 15 min và lắc tiếp trên máy lắc (5.5) 15 min.

Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.13) và thu lấy dịch chiết vào bình nón dung tích 100 ml (5.12). Chuyển chính xác 30 ml phần dịch chiết đã lọc vào ống đong dung tích 150 ml có nắp đậy. Pha loãng dịch chiết trong ống đong bằng PBS (4.10) đến thể tích cuối cùng 150 ml. Lắc và lọc khoảng 20 ml dịch chiết này qua màng lọc vi sợi thủy tinh (5.14) cho vào cốc có mỏ bằng thủy tinh bằng cách sử dụng chân không nhẹ (5.21). Loại bỏ 20 ml này và lọc tiếp thêm khoảng 70 ml để phân tích.

CHÚ THÍCH Không sử dụng chân không mạnh khi bắt đầu quá trình lọc, có thể làm dịch chiết bị đục sau khi lọc

Thực hiện ngay quy trình làm sạch trên cột ái lực miễn nhiễm (6.2).

6.2. Làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm

Để cột ái lực miễn nhiễm đến nhiệt độ phòng trước khi làm ổn định. Nối cột ái lực miễn nhiễm (4.21) với hệ thống chân không (5.17) và gắn bầu chứa (5.18) lên đỉnh cột ái lực miễn nhiễm. Ổn định sơ bộ cột ái lực miễn nhiễm bằng 20 ml PBS (4.10) sử dụng tốc độ dòng 3 ml/min đến 5 ml/min. Chuyển 50 ml dung dịch chiết mẫu pha loãng (và có thể đã lọc) (xem 6.1.1 hoặc 6.1.2) vào bầu chứa. Rút dịch chiết qua cột bằng trọng lực với tốc độ dòng ổn định cho đến khi tất cả dịch chiết đã qua cột và phần dung môi cuối cùng qua cột.Cần có tốc độ dòng chảy là một giọt trên giây đến hai giọt trên giây.

Sau khi dịch chiết qua cột, rửa cột dùng 20 ml nước hoặc đối với thức ăn cho trẻ nhỏ dùng 5 ml dung môi rửa (4.18) sau đó dùng 15 ml nước ở tốc độ một giây trên giây đến hai giọt trên giây.

Loại bỏ nước còn dư ra khỏi cột ái lực miễn nhiễm ví dụ bằng 3 ml khí hoặc cho khí nitơ qua cột. Loại bỏ hết dịch rửa giải ở giai đoạn này của quá trình làm sạch.

CHÚ THÍCH 1 Các điều kiện trên đây để ổn định sơ bộ cột và rửa giải có thể thay đổi theo hướng dẫn của nhà sản xuất cột.

CHÚ THÍCH 2 Cần cẩn thận để không vượt quá khả năng của cột ái lực miễn nhiễm.

6.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

6.3.1. Chuẩn bị mẫu bột đại mạch, bột ngô, bột mì, bột ngô dạng nhuyễn, thức ăn có chứa ngô dành cho trẻ nhỏ

Đặt lọ (5.9) dưới từng cột ái lực miễn nhiễm. Dùng pipet lấy 1,5 ml axetonitril (4.11) cho vào bầu chứa của cột (5.18). Để cho dung môi tiếp xúc với cột ái lực miễn nhiễm 1 min sau đó rửa giải zearalenon ra khỏi cột ái lực miễn nhiễm bằng cách để dung môi qua cột ở tốc độ một giọt trên giây đến hai giọt trên giây. Đảm bảo đã thu nhận được tất cả dung môi, ví dụ cho 5 ml không khí đi qua cột.

Làm bay hơi dịch rửa giải thu được đến khô bằng dòng khí nitơ. Hòa tan phần còn lại thu được trong 1 ml dung môi bơm dùng cho HPLC A (4.15). Trộn kỹ trên máy trộn vortex (5.6). Chuyển vào lọ nhỏ (5.9).

Ngoài ra, dịch rửa giải có thể được pha loãng đến thể tích xác định (ví dụ 3 ml) bằng cách thêm nước và sau đó được phân tích bằng HPLC.

6.3.2. Chuẩn bị mẫu ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Đặt bình định mức dung tích 3,0 ml (5.10) dưới cột và cho 0,75 ml metanol (4.12) đi qua cột, thu lấy dịch rửa giải. Sau khi những giọt metanol cuối cùng chảy qua cột, để metanol còn giữ trên cột khoảng 1 min. Sau đó thêm tiếp 0,75 ml metanol và tiếp tục thu lấy dịch rửa giải. Cẩn thận cho không khí đi qua cột để thu được những giọt cuối cùng.

Đổ đầy nước đến vạch của bình định mức và lắc. Trong trường hợp mẫu đục, lọc dung dịch thử qua bộ lọc xyranh HPLC (5.22) với xyranh bằng chất dẻo (5.19).

CHÚ THÍCH 1 Khi trộn, metanol và nước bị co ngót thể tích. Điều chỉnh thể tích sau khi lắc, nếu cần.

CHÚ THÍCH 2 Ngoài quy trình làm sạch và rửa giải ái lực miễn nhiễm thủ công (xem 6.3.1 và 6.3.2) còn có thể thực hiện với bộ chuẩn bị mẫu tự dộng, với điều kiện là khối lượng và tốc độ rửa giải không thay đổi.

6.4. Quy trình thêm chuẩn

Sử dụng dung dịch chuẩn (4.25) để xác định độ thu hồi theo quy trình thêm chuẩn. Mức thêm chuẩn phải nằm trong dải hiệu chuẩn (tốt nhất là giữa dải nồng độ). Để yên mẫu thêm chuẩn tối thiểu 30 min cho bay hết dung môi.

7. Phân tích HPLC

7.1. Các điều kiện vận hành HPLC

Khi sử dụng cột quy định trong 5.24.3 và pha động quy định trong 4.16 hoặc 4.20, việc cài đặt sau đây cho thấy phù hợp, xem Hình A.1 và Hình A.2:

– tốc độ dòng pha động (cột): 0,7 ml/min đến 1,0 ml/min;

– detector huỳnh quang, bước sóng phát xạ: 446 nm đến 450 nm;

– detector huỳnh quang, bước sóng kích thích: 274 nm đến 275 nm;

– thể tích bơm 100 ml đến 300 ml.

7.2. Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn cho HPLC

Dùng pipet (5.15) hoặc xyranh (5.16) để chuẩn bị năm dung dịch hiệu chuẩn HPLC trong các bình định mức dung tích 10 ml riêng rẽ, chuyển các thể tích nêu trong Bảng 1 và Bảng 2 thích hợp đối với các mẫu. Pha loãng đến vạch từng dung dịch bằng dung môi bơm thích hợp cho HPLC (4.15 đối với Bảng 1 hoặc 4.19 đối với Bảng 2).

Bảng 1 – Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn HPLC đối với thức ăn dành cho trẻ nhỏ có chứa ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột mì, bột ngô dạng nhuyễn

Bảng 2 – Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn HPLC đối với ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Việc chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các pipet khác nhau hoặc bằng các lọ thủy tinh đã hiệu chuẩn.

7.3. Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn ngay khi bắt đầu ngày phân tích bằng cách bơm dung dịch hiệu chuẩn thích hợp đối với mẫu thử (xem Bảng 1 hoặc Bảng 2) vào hệ thống HPLC. Thiết lập đường chuẩn trước để phân tích mẫu thử bằng cách dựng đồ thị nồng độ khối lượng zearalenon, tính bằng nanogam trên mililit, trên trục x dựa vào dấu hiệu pic như diện tích hoặc chiều cao trên trục y, kiểm tra độ tuyến tính sử dụng hồi quy tuyến tính (r² ³ 0,998).

7.4. Xác định zearalenon trong dung dịch mẫu thử

Bơm các lượng dịch dung dịch mẫu thử (6.3.1 hoặc 6.3.2) vào hệ thống HPLC sử dụng các điều kiện như đã dùng để chuẩn bị đường chuẩn.

7.5. Nhận biết pic

Nhận biết các pic zearalenon trong dung dịch mẫu thử bằng cách so sánh thời gian lưu của dung dịch mẫu với thời gian lưu gần giống nhất của chất chuẩn được bơm vào HPLC. Nồng độ khối lượng của zearalenon trong dung dịch mẫu thử phải nằm trong dải hiệu chuẩn. Nếu mức zearalenon trong dung dịch mẫu thử vượt quá nồng độ khối lượng chuẩn lớn nhất thì pha loãng mẫu với pha động HPLC, để đưa nồng độ về trong dải hiệu chuẩn và phân tích lại. Hệ số pha loãng phải được đưa vào tất cả các phép tính tiếp theo.

8. Tính kết quả

Xác định nồng độ khối lượng zearalenon trong dung dịch mẫu thử (6.3.1 hoặc 6.3.2) trực tiếp từ đường chuẩn (7.3), tính bằng nanogam trên mililit. Tính khối lượng của zearalenon, w_zon, tính bằng nanogam trên gam, sử dụng công thức (2):

w_zon =  (2)

Trong đó:

r_a là nồng độ khối lượng của zearalenon trong phần dung dịch thử được bơm và được xác định từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V₁ là thể tích của dung môi chiết (100 ml đối với 6.1.1 hoặc 150 ml đối với 6.1.2), tính bằng mililit (ml);

V₂ là thể tích thu được sau rửa giải khỏi cột ái lực miễn nhiễm và sau khi hòa tan lại với pha động (1,0 ml hoặc 3,0 ml), tính bằng mililit (ml);

V₃ thể tích của phần dịch chiết được sử dụng để làm sạch cột ái lực miễn nhiễm (6 ml đốivới 6.1.1 và 10 ml đối với 6.1.2), tính bằng mililit (ml);

m_s là khối lượng mẫu thử được lấy để phân tích (25 g đối với 6.1.1 và 20 g đối với 6.1.2).

Các kết quả này được tính bằng công thức đơn giản sau:

w_zon = r_a x 0,667 (đối với các mẫu được chuẩn bị theo 6.1.1. thể tích cuối cùng là 1 ml);

w_zon = r_a x 2,0 (đối với các mầu được chuẩn bị theo 6.1.1, thể tích cuối cùng là 3 ml);

w_zon = r_a x 2,25 (đối với các mẫu được chuẩn bị theo 6.1.2, thể tích cuối cùng là 3 ml).

9. Độ chụm

9.1. Yêu cầu chung

Chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng về độ chụm của phương pháp đối với bột đại mạch, bột ngô, bột mì, bột ngô dạng nhuyễn, ngô dành cho trẻ nhỏ được đưa ra trong Bảng B.1. Chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng về độ chính xác của phương pháp đối với ngũ cốc cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ được đưa ra trong Bảng B.2. Các giá trị nhận được từ các thử nghiệm liên phòng có thể không áp dụng được đối với dải nồng độ và/hoặc nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục B

9.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn độ lặp lại r.

Đối với mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.1:

Các giá trị đối với thức ăn có chứa ngô

dành cho trẻ nhỏ:	= 10,9 mg/kg	r = 11,0 mg/kg (được thêm vào)
Các giá trị đối với bột đại mạch:	= 143 mg/kg	r = 27,5 mg/kg (được thêm vào)
Các giá trị đối với bột ngô:	= 87,2 mg/kg	r = 34,8 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với bột ngô:	= 335 mg/kg	r = 82,9 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với bột ngô dạng nhuyễn	= 66,5 mg/kg	r = 16,6 mg/kg (được thêm vào)
Các giá trị đối với bột mì	= 227 mg/kg	r = 52,9 mg/kg (được thêm vào)
Đối với các mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.2:
Các giá trị đối với ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ:
	= 9,1 mg/kg	r= 1,5 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
	= 17,1 mg/kg	r= 2,5 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
	= 44,0 mg/kg	r = 3,4 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
	= 18,4 mg/kg	r= 4,5 mg/kg (được thêm vào)
	= 26,6 mg/kg	r= 4,2 mg/kg (được thêm vào)

9.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng trên vật liệu thử giống hệt nhau bởi hai phòng thử nghiệm không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn độ tái lập R.

Đối với các mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.1:

Các giá trị đối với thức ăn có chứa ngô

dành cho trẻ nhỏ:	= 10,9 mg/kg	r = 11,7 mg/kg (được thêm vào)
Các giá trị đối với bột đại mạch:	= 143 mg/kg	r = 71,8 mg/kg (được thêm vào)
Các giá trị đối với bột ngô:	= 87,2 mg/kg	r = 50,4 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với bột ngô:	= 335 mg/kg	r = 343,7 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với bột ngô dạng nhuyễn	= 66,5 mg/kg	r = 30,6 mg/kg (được thêm vào)
Các giá trị đối với bột mì	= 227 mg/kg	r = 107,9 mg/kg (được thêm vào)
Đối với các mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.2:
Các giá trị đối với ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ:
	= 9,1 mg/kg	R= 3,3 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
	= 17,1 mg/kg	R= 6,2 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
	= 44,0 mg/kg	R = 12,5 mg/kg (nhiễm tự nhiên)
	= 18,4 mg/kg	R = 6,6 mg/kg (được thêm vào)
	= 26,6 mg/kg	R = 6,1 mg/kg (được thêm vào)

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và phương pháp lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;

g) mọi chi tiết quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

SẮC KÝ ĐỒ ĐIỂN HÌNH

CHÚ DẪN

X thời gian (min)

Y tín hiệu (mV)

1 zearalenon

Hình A.1 – Sắc ký đồ điển hình, mẫu lúa mì bị nhiễm zearalenon tự nhiên 190 mg/kg, được phân tích sử dụng các điều kiện HPLC nêu trong 7.1

CHÚ DẪN

X thời gian (min)

Y tín hiệu (mV)

1 zearalenone

Hình A.2 – Sắc ký đồ điển hình, mẫu lúa mì bị nhiễm zearalenone tự nhiên 36 mg/kg, được phân tích sử dụng các điều kiện HPLC nêu trong 7.1

PHỤ LỤC B

(tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Dữ liệu nêu trong Bảng B.1 thu được trong các phép thử nghiệm liên phòng [2], [3] theo hướng dẫn của AOAC về quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá các đặc tính của phương pháp phân tích (4).

Bảng B.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với các mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình6.1.1

Mẫu	Thức ăn dành cho trẻ nhỏ có chứa ngô (đượcthêm vào)	Bột đại mạch (đượcthêm vào)	Bột ngô (nhiễm tự nhiên)	Bột dạng nhuyễn(được thêm vào)	Bột mì(được thêm vào)	Bột ngô (nhiễm tự nhiên)
Năm thử nghiệm liên phòng	2002	2002	2002	2002	2002	2002
Số phòng thử nghiệm	29	29	29	29	29	28
Số phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đã trừ ngoại lệ	28	28	29	29	29	27
Số ngoại lệ (phòng thửnghiệm)	1	1	0	0	0	1
Số kết quả được chấp nhận	23	25	27	27	27	27
Giá trị trung bình, , mg/kg	10,9	143	87,2	66,5	227	335
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr,mg/kg	3,9	9,8	12,4	5,9	18,9	29,6
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %	35,8	6,9	14,2	8,9	8,3	8,8
Giới hạn độ lặp lại r [r = 2,8 xsr], mg/kg	11,0	27,5	34,8	16,6	52,9	82,9
Độ lệch chuẩn tái lập,  sR,  mg/kg	4,2	25,6	18,0	10,9	38,6	123
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %	38,2	17,9	20,6	16,4	17	36,6
Giới hạn độ tái lập R [R = 2,8 x sR], mg/kg	11,7	71,8	50,4	30,6	108	344
Độ thu hồi, % a	100	92	91	91	95	98
Giá trị HorRat, được tính toán sử dụng độ lệch chuẩn dự đoán (PSRDR) từ Thompson, xem [5] và [6]	1,7	0,8	0,9	0,7	0,9	1,9
a Các giá trị thu hồi nhận được độc lập từ các mẫu thêm chuẩn đơn lẻ của từng nền mẫu (100 mg/kg) của từng phòng thử nghiệm tham gia nghiên cứu cộng tác

Bảng B.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.2

Mẫu	Ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ
	(được thêm vào)		(bị nhiễm tự nhiên)
Năm thử nghiệm liên phòng	2005	2005	2005	2005	2005	2005
Số lượng phòng thử nghiệm	17	17	19	19	19	19
Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đã trừ ngoại lệ	17	17	19	17	18	17
Số phòng thử ngoại lệ	0	0	0	2	1	2
Số kết quả được chấp nhận	17	17	19	17	18	17
Giá trị trung bình, , mg/kg	18,4	26,6	< 2	9,1	17,1	44
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/kg	1,6	1,5	n.a.	0,5	0,9	1,2
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại,RSDr, %	8,7	5,7	n.a.	5,9	5,3	2,8
Giới hạn độ lặp lại r [r = 2,8 xsr], mg/kg	4,5	4,2	n.a.	1,5	2,5	3,4
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/kg	2,4	2,2	n.a.	1,2	2,2	4,5
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %	12,9	8,2	na.	13,0	13,0	10,1
Giới hạn độ tái lập R [R = 2,8 x s­R], mg/kg	6,7	6,1	n.a.	3,3	6,2	12,5
Độ thu hồi, % a	92	91	n.a.	n.a.	n.a.	n.a.
Giá trị HorRat, được tính toán sử dụng độ lệch chuẩn dự đoán (PSRDR) từ Thompson, xem [5]và [6]	0,4	0,3	n.a.	0,4	0,4	0,4
a Các giá trị thu hồi nhận được từ phép phân tích các cặp mẫu mù. Mỗi phòng thử nghiệm tham gia nghiên cứu hợp tác thực hiện hai mẫu mù thêm chuẩn ở các mức 20 mg/kg và 30 mg/kg

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Josephs, R.D., Krska, R, MacDonald, S., Wilson, P., Pettersson, H., Preparation of a calibrant as certified reference material for determination of the Fusarium mycotoxin zearalenone. Journal of AOAC International, 2003, 86(1), 50-60

[2] MacDonald S., Anderson, S., Brereton, P., Wood, R. and Damant, A.„ Determination of zearalenone in barley, maize and wheat flour, polenta and maize based baby food by immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International, 2005, 88, 1733-1740

[3] Arranz, I., Mischke, C., Ambrosio, K., Kroeger, K., Derbyshire, M., Stroka, J., van Egmond. H. and Sizoo, E., Validation of an Analytical Method to Determine the Content of Zearalenone in Baby Food and Animal Feed, Report of the Final Trial, 2006

[4] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, Associate Referee’s Manual on Development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, p. 23-51

[5] Horwitz. W. and Albert, R., The Horwitz Ratio (HorRat): A Useful Index of Method Performance with Respect to Precision. Journal of AOAC International, 2006, 89, 1095-1109

[6] Thompson, M„ Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, 2000, 125, 385-386