TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10644:2014 (AOAC 2005.06) VỀ THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG ĐỘNG VẬT CÓ VỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CHIẾT PHA RẮN VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG

Hiệu lực: Còn hiệu lực

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10644:2014

THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG ĐỘNG VẬT CÓ VỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CHIẾT PHA RẮN VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG

Aquatic products – Determination of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in shellfish – HPLC method with solid phase extraction clean-up and fluorescence detection

Lời nói đầu

TCVN 10644:2014 xây dựng dựa theo AOAC 2005.06 Paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish. Prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection;

TCVN 10644:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG ĐỘNG VẬT CÓ VỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CHIẾT PHA RẮN VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG

Aquatic products – Determination of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in shellfish – HPLC method with solid phase extraction clean-up and fluorescence detection

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định các độc tố gây liệt cơ (PSP) như saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO), các gonyautoxin 2 và 3 (GTX 2,3), gonyautoxin 1 và 4 (GTX 1,4), decarbamoyl saxitoxin (dcSTX), B-1, C-1 và C-2, C-3 và C-4 trong động vật thủy sn có v (trai, ngao, hàu và sò).

Giới hạn định lượng của phương pháp:

saxitoxin: 22 mg/kg; GTX 2,3 (đồng thời): 125 mg/kg (nồng độ thấp nhất được th nghiệm);
B-1: 27 mg/kg; dcSTX: mg/kg;
NEO: 40 mg/kg; GTX 1,4 (đồng thời): 50 mg/kg;
C1,2 (đồng thời): 93 mg/kg; C3,4 (đồng thời): 725 mg/kg.

Xem Phụ lục A về các kết qu thử nghiệm liên phòng chấp nhận phương pháp.

2. Nguyên tắc

Phần mẫu thử được chiết bằng cách gia nhiệt với dung dịch axit axetic. Các dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn (SPE) C18. Sau quá trình oxy hóa periodat và peroxit, mẫu được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) s dụng detector huỳnh quang. Hu hết các độc tố (STX, C1,2, B-1, dcSTX và GTX2,3) có thể được định lượng sau khi làm sạch bằng cột SPE-C18 một lần. Các dịch chiết chứa các độc tố NEO, GTX1,4, C3,4 và B-2 phải được tinh sạch tiếp bằng cột SPE-COOH. Nồng độ các độc tố PSP tính được bằng cách so sánh diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và của các cht chun tương ng.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc th thuộc loại tinh khiết phân tích.

3.1. Nước đã kh ion hai ln.

3.2. Axit axetic băng.

3.3. Axit axetic, dung dịch 1 % khối lượng.

3.4. Axit axetic, dung dịch 0,1 M.

3.5. Metanol.

3.6. Amoni format, dung dịch 0,3 M và 0,1 M.

3.7. Amoni axetat, dung dịch 0,01 M.

3.8. Natri clorua, dung dịch 0,3 M và 0,05 M.

3.9. Natri hydroxit, dung dịch 1 M và 0,2 M.

3.10. Hydro peroxit (H2O2), dung dịch 10 % (khối lượng/thể tích) (được bo qun trong tủ lạnh).

3.11. Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4), dung dịch 0,3 M.

3.12. Axit periodic, dung dịch 0,03 M (được bảo quản trong tủ lạnh).

3.13. Axetonitril.

3.14. Chất oxy hóa periodat

Chuẩn bị trong ngày sử dụng bằng cách trộn 5 ml dung dịch axit periodic 0,03 M (3.12), 5 ml dung dịch amoni format 0,3 M (3.6) và 5 ml dung dịch dinatri hydro phosphat 0,3 M (3.11), điều chnh pH đến 8,2 bằng dung dịch natri hydroxit 0,2 M (3.9), dùng máy đo pH (4.4).

3.15. Chất bổ chính nền, dùng cho quá trình oxy hóa bằng periodat

Chun bị bằng cách chiết từ mẫu hàu không chứa các độc tố PSP theo 5.2 và 5.3. Chỉnh pH của dịch chiết đến 6,5 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M (3.9) và để yên 2 ngày đến 3 ngày để kết tủa các chất đồng thời chiết được. Gạn lớp phía trên hoặc lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 mm (4.16) và bo quản trong t lnh khi không sử dụng. Dịch chiết từ hàu không chứa các độc tố PSP có thể được bo qun đông lnh trong 2 tháng  nhiệt độ – 20 °C, nhưng chất b chính nền phải được chuẩn bị mới sau 2 tuần.

Phân tích chất bổ chính nền đi với các độc tố PSP bằng cách oxy hóa bằng periodat và peroxit để đm bảo không có đc tố trước khi s dụng.

3.16. Các dung dịch chuẩn STX, NEO, GTX1,4, GTX2,3, C1,2, B-1 và dcSTX

Chun bị các dung dịch chuẩn riêng rẽ nói trên trong dung dịch axit axetic 0,1 M (3.4) với các nồng độ trong dải từ 100 mg/ml đến 2 000 mg/ml1). Pha loãng với nước để có được các dung dịch chuẩn làm việc với nng độ trong dải từ 8 mg/ml đến 100 mg/ml. Các dung dịch này bền ít nhất một tháng.

CHÚ THÍCH Đ thun tiện, các cht chuẩn có th được kết hợp thành ba hỗn hợp bng cách pha loãng các dung dịch gốc trong nước. Các dung dịch này được chnh đến pH 4 bằng dung dịch axit axetic 0,1 M (3.4). Đối với các dung dịch pha loãng tiếp theo sử dụng dung dch axit axetic 0,1 mM, để đảm bảo các dung dịch duy trì  pH 4. Các hỗn hợp như sau:

– Hỗn hợp I: GTX1,4 và NEO, đối với quá trình oxy hóa bng periodat.

– Hỗn hợp II: GTX2,3, STX, B-1 và dcSTX, đvới quá trình oxy hóa bng peroxit.

– Hỗn hp III: C1,2 và C3,4, đối với quá trình oxy hóa bằng periodat và peroxit.

Hình B.2 cho thy sắc ký đồ đin hình của các hn hợp trên.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng với axit axetic 0,1 mM như trên. Bảo quản các dung dịch chuẩn pha loãng trong lọ bằng cht dẻo để trong vật cha bằng thủy tinh đã khử hoạt tính bằng cách ngâm lọ qua đêm trong natri hydroxit, rửa sạch bằng nước, sau đó tráng bằng metanol (3.5) và làm khô.

Các sn phẩm oxy hóa không bị ảnh hưng bi các loại lọ; do đó, phản ứng oxy hóa có thể được thực hiện trong lọ thủy tinh lấy mẫu tự động mà không cần khử hoạt tính.

3.17. Pha động

Pha động A: dung dịch amoni format 0,1 M (3.6);

Pha động B: dung dịch amoni format 0,1 M trong axetonitril 5 %.

Cả hai pha động đều được chnh đến pH 6 bằng cách thêm 6 ml dung dịch axit axetic 0,1 M (3.4).

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1. Hệ thống sắc ký lỏng (LC)

Hệ thống sắc ký lng (LC) có gradient hai kênh, được trang bị mt cổng bơm có thể bơm được 100 ml dung dịch. Sử dụng cột pha đảo C18 (4.18) có kích thước 15 mm x 4,6 mm đường kính trong, cỡ hạt 5 mm (ví d: cột Supelcosil LC-18) để tách các sản phẩm oxy hóa độc t. Nếu sử dụng cột có kích thước khác thì điều chnh điều kiện gradient và tốc độ dòng để tách được các sn phẩm oxy hóa độc tố PSP trong khong 15 min chạy sắc ký. Gradient pha động được khuyến cáo sử dụng để rửa giải các sản phẩm oxy hóa độc tố PSP bao gồm 2 pha động (xem 3.17) theo các điều kiện sau đây: 0 % đến 5 % pha động B trong 5 min đầu tiên, 5 % đến 70 % pha động B trong 4 min tiếp theo và tr về 0 % pha động B trong 2 min sau đó và ở mức 0 % pha động B thêm 3 min trước khi bơm tiếp.

Tốc độ dòng là 2 ml/min. Để kiểm tra rửa giải LC, dùng detector huỳnh quang đơn sắc, đặt  bước sóng kích thích 340 nm và bước sóng phát xạ ở 395 nm. Detetor phải đ nhạy để có chiều cao pic ít nhất 3 cm với nhiễu đường nền pic-pic là 3 mm (tỉ lệ tín hiệu : nhiễu là 10 : 1) để bơm 400 pg chất chuẩn STX thực hiện qua quá trình oxy hóa bằng peroxit dưới các điều kiện sắc ký nêu trên.

Hình B.1 đưa ra sắc ký đồ dự kiến đối với các độc tố sau quá trình oxy hóa bằng peroxit và periodat.

Hệ thống sắc ký phải có độ phân giải đường nền cao để tách được các sản phm oxy hóa chính GTX1,4 (cùng một pic), C1,2 (cùng một pic), NEO, GTX2,3 (cùng một pic), B-1 và STX, trong 15 min chạy sắc ký, ví dụ xem Hình B.2. Nên sử dụng bộ xử lý dữ liệu sắc ký để phân tích sắc ký đồ.

4.2. Bếp diện.

4.3. Máy trộn Vortex.

4.4. Máy đo pH.

4.5. Máy ly tâm, tạo được gia tốc hướng tâm 3600g.

4.6. ng ly tâm, bằng chất dẻo (polypropylen), dung tích 1,5 ml và 50 ml.

4.7. ng nghiệm thủy tinh, được chia vạch, dung tích 5 ml và 15 ml.

4.8. ng nghiệm hình nón, được chia vạch, dung tích 15 ml.

4.9. Lọ lấy mẫu tự động.

4.10. Ni cách thủy.

4.11. Nồi cách thy đun sôi.

4.12. T lạnh.

4.13. Bình cu đáy tròn, dung tích 50 ml.

4.14. Cân, có th cân chính xác đến 0,1 mg.

4.15. Pipet Pasteur.

4.16. Bộ lọc, cỡ lỗ 0,45 mm.

4.17. Cột SPE, đm bo các cột SPE được s dụng có khả năng thu hồi tối thiểu 80 % chất chun và rửa gii chính xác các mẫu theo 5.3 và 5.4.

4.18. Cột C18, cột LC-18 (500 mg/3 ml) 2).

4.19. Cột trao đi ion SPE-COOH.

Có thể sử dụng Bakerbond Carboxylic Acidsilane (COOH) liên kết với silica gel (th tích 500 mg/3 ml)3). Phenomenex4) hoc cột Isolute SPE-COOH.

5. Cách tiến hành

5.1. Chuẩn bị mô động vật có vỏ

Rửa sạch phía ngoài động vật có vỏ bằng nước sạch, m vỏ, lấy các mô và chuyển vào thiết bị đồng hóa. Trộn cho đến khi thu được mẫu đồng nhất.

5.2. Chiết

Cân 5,00 g ± 0,10 g mẫu đồng nhất (5.1), chính xác đến 0,1 mg, trộn với 3,0 ml dung dịch axit axetic 1 % (3.3) đựng trong ống ly tâm dung tích 50 ml (4.6), trên máy trộn Vortex (4.3), nới lỏng nắp (để tránh sự tích tụ áp lực trong quá trình làm nóng) và đặt trong nồi cách thủy đun sôi (4.11) (100 °C) sao cho lượng chứa trong ống thấp hơn mức nước. Gia nhiệt 5 min. Không đặt quá nhiều ống trong nồi cùng một lúc vì có thể làm nồi cách thy ngừng sôi hoặc nhiệt độ bị giảm xuống quá 30 s. Lấy ống ra khỏi nồi cách thủy, trộn trên máy trộn Vortex (4.3) và làm nguội 5 min bng cách đặt trong tủ lạnh (4.12) hoặc trong cốc có mỏ có chứa nước lạnh. Ly tâm 10 min ở tốc độ 4500 r/min (gia tốc 3600g) và gạn dung dịch phía trên vào ống nghiệm hình nón chia vạch dung tích 15 ml (4.8). Thêm 3 ml dung dịch axit axetic 1 % (3.3) vào ống ly tâm chứa phần cặn còn lại, trộn kỹ trên máy trộn Vortex (4.3) và ly tâm lại 10 min  4500 r/min (3600g). Thu lấy dịch phía trên cho vào ống nghiệm hình nón chia vạch chứa phần dịch chiết đầu tiên và pha loãng bằng nước đến 10,0 ml.

5.3. Làm sạch bằng cột SPE-C18

Dùng 6 ml metanol (3.5) để ổn định cột SPE-C18 (500 mg chất hấp thụ), tiếp theo là bằng 6 ml nước. Thêm 1 ml dịch chiết thô (tương đương 0,5 g động vật có v) vào cột. Giữ tốc độ chảy  khoảng 2 ml/min đến 3 ml/min đối với tt cả dịch ra gii. Thu dịch rửa gii vào ống nghiệm hình nón chia vạch dung tích 5 ml (4.7). Không để cột chảy đến khô. Rửa cột bằng 2 ml nước và gộp nước rửa với dịch rửa giải.

Chỉnh dịch chiết đến pH 6,5 bằng dung dịch NaOH 1 M (3.9), sử dụng giấy ch thị pH [được hiệu chun lại bng máy đo pH (4.4)], sau đó pha loãng bng nước chính xác đến 4 ml. Sử dụng phần dịch chiết này cho quá trình oxy hóa bằng periodat và peroxit theo 5.5. Đồng thời, phân tách một lượng dịch chiết không oxy hóa để chắc chắn rằng các pic độc tố PSP trong sắc ký đồ đúng là của các độc t PSP mà không phải là do các dịch chiết có huỳnh quang tự nhiên bị chiết cùng, bằng cách trộn một thể tích dịch chiết và chất bổ chính nền (3.15) với nước để thay cho chất oxy hóa periodat trước khi bơm lên hệ thống LC. Sắc ký đồ thu được cho phép nhận biết các pic phát sinh do các dịch chiết có hunh quang tự nhiên. Các độc tố PSP không tạo ra các pic trong các điều kiện này.

Đối với các dịch chiết mẫu có độc tố PSP cao hơn so với hỗn hợp chất chuẩn đậm đặc nhất, thì pha loãng dịch chiết mẫu bng nước sau khi làm sạch bằng cột SPE, sao cho nồng độ độc tố nm trong dải chất chuẩn và phân tích lại, bắt đầu từ 5.5. Ghi lại hệ số pha loãng, D.

5.4. Làm sạch bằng SPE-COOH

Việc làm sạch bằng trao đi ion SPE-COOH ch được sử dụng đối với các dịch chiết được phát hiện có chứa các độc tố PSP N-1-hydroxyl hóa sau khi làm sạch bằng cột C18 (4.18). n định cột bằng cách cho 10 ml dung dịch amoni axetat 0,01 M (3.7) đi qua cột SPE-COOH (4.19). Giữ tốc độ dòng ở khoảng 2 ml/min đến 3 ml/min đối với tất c dịch rửa giải. Không để cột chảy đến khô.

Loại bỏ dịch rửa giải. Cho 2 ml phần dịch chiết mẫu (tương ứng với 0,250 g mô động vật có vỏ) thu được từ quá trình làm sạch cột SPE-C18 (xem 5.3) đi qua cột và thu lấy dịch rửa giải vào ống nghiệm hình nón chia vạch dung tích 15 ml (4.7) được đánh số 1. Sau đó cho 4,0 ml nước đi qua cột và thu vào cùng ống nghiệm. Chnh thể tích cuối cùng đến 6 ml. Phần này có cha các độc tố C. Sau đó, cho 4,0 ml dung dịch NaCl 0,05 M (3.8) đi qua cột, thu dịch rửa giải vào ống nghiệm hình nón chia vạch dung tích 5 ml (4.7) được đánh số 2. Đm bảo rằng thể tích cuối cùng là 4,0 ml. Phần này có chứa các độc t GTX 1,4, GTX 2,3, B-1, B-2 và dcGTX 2,3. Tiếp theo, cho 5 ml dung dịch NaCl 0,3 M (3.8) đi qua cột và thu vào ng nghiệm hình nón chia vạch dung tích 5 ml (4.7) được đánh số 3. Đm bảo thể tích cuối cùng là 5,0 ml. Phần này có chứa các độc tố STX, NEO và dcSTX. Tiến hành oxy hóa theo 5.5 và phân tích HPLC.

Nếu gặp phi vấn đề về độ nhạy của detector thì cô đặc từng phần dung dch thu được từ cột trao đổi ion trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml (4.13) thay cho việc dùng ống nghiệm hình nón chia vạch và cho bay hơi đến khoảng 1 ml trên thiết bị cô quay trong nồi cách thủy (4.10) đặt  45 °C. Dùng pipet Pasteur (4.15) chuydung dịch vào ống nghiệm hình nón chia vạch dung tích 5 ml. Rửa sạch bình cầu đáy tròn ba ln với khoảng 0,2 ml đến 0,3 ml nước mỗi ln, chuyển nước ra vào ống nghiệm chia vạch sao cho thể tích dịch chiết cuối cùng là 2,0 ml.

CHÚ THÍCH Có th sử dụng bình định mức chia vạch 2 ml. Phân ch các phđược đánh số t 1 đến 3 bng LC sau khi oxy hóa bng periodat và peroxit như dưi đây.

5.5. Phn ứng oxy hóa

5.5.1. Oxy hóa bằng periodat

Phân phối tất cả các thuốc th và dung dịch sử dụng trong các phản ứng oxy hóa bằng pipet tự động (Eppendorf hoặc tương đương)5) với đầu tip bng chất do dùng một lần. Thêm 100 ml dung dịch chuẩn hoặc dịch chiết mẫu thử sau khi làm sạch bằng cột trao đổi ion hoặc cột SPE-C18 vào 100 ml dung dịch bổ chính nền (3.15) đựng trong ng ly tâm dung tích 1,5 ml (4.6) hoặc lọ lấy mẫu tự động (4.9), nếu thực hiện phân tích sắc ký tự động. Sau đó thêm 500 ml chất oxy hóa periodat và trộn kỹ trên máy trộn Vortex (4.3). Để dung dịch phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 1 min, sau đó thêm 5 ml axit axetic đặc (3.2) và trộn. Để yên hỗn hợp ít nhất 10 min ở nhiệt độ phòng trước khi bơm từ 50 ml đến 100 ml vào hệ thống LC. Dung dịch này bền được khong 1 ngày vi độc tố không hydroxyl hóa. Tuy nhiên, với NEO, B-2 và GTX1,4 xảy ra phân hủy chậm các sn phm oxy hóa (khoảng 30 % sau 8 h). Sau đó, phép định lượng vẫn có thể thực hiện được nếu các chất chuẩn và dung dịch thử được bảo quản và được phân tích trong cùng điều kiện.

5.5.2. Oxy hóa bng peroxit

Cho 25 ml dung dịch hydro peroxit 10 % (3.10) vào 250 ml dung dịch natri hydroxit 1 M (3.9) đựng trong ống ly tâm bng chất dẻo dung tích 1,5 ml (4.6) (hoặc lọ lấy mẫu tự động (4.9), nếu thực hiện phân tích sc ký tự động) và trộn. Sau đó thêm 100 ml dung dịch chuẩn hoặc dịch chiết mẫu sau khi làm sạch bằng cột trao đi ion hoặc cột SPE-C18. Trộn và để phn ứng 2 min ở nhiệt độ phòng. Thêm 20 ml axit axetic đặc (3.2) và trộn. Bơm 25 ml đến 50 ml dung dịch này vào hệ thống LC. Dung dịch này bền ít nhất 8 h.

CHÚ THÍCH Nếu bơm nhiều hơn 50 ml thì có thể pic sẽ bị doãng rộng.

6. Tính kết quả

6.1. Yêu cầu chung

Mỗi độc tố có trong mô động vật có vỏ được định lượng bằng cách so sánh trực tiếp với các chất chuẩn phân tích ở nồng độ tương tự như dự kiến có trong phần mẫu thử (xem 6.2). Để thuận tiện, có thể sử dụng ba hỗn hợp chất chuẩn phân tích để định lượng các độc tố.

STX, GTX 2,3, B-1 và C1,2 tạo ra các sn phẩm oxy hóa đơn lẻ với cả hai phản ứng oxy hóa, trong khi dcSTX tạo ra hai sản phẩm oxy hóa với cả hai phn ứng. Tuy nhiên, NEO, B-2, GTX1,4, và C 3,4 mỗi loại tạo ra ba pic sau quá trình oxy hóa bằng periodat nhưng chỉ các pic rửa gii thứ hai được sử dụng đ định lượng (Hình B.2). Vì một vài độc tố PSP (NEO và B-2; GTX1,4, và C3,4) cho các sn phẩm oxy hóa giống nhau, nên việc định lượng cũng chỉ có thể được thực hiện sau khi tách bằng sắc ký trao đổi ion COOH nêu trên. Nếu dcSTX có mặt với nồng độ cao thì sẽ gây nhiễu đến việc định lượng NEO sau khi oxy hóa bằng periodat. NEO có thể được định lượng bằng cách sử dụng t lệ toán học của các pic sau khi oxy hóa bằng periodat và peroxit như 6.2.

6.2. Tính nồng độ các độc tố PSP

Nồng độ độc tố, C, biểu thị bằng microgam trên kilogam (mg/kg), tính theo công thức sau:

Trong đó:

Ax là diện tích pic của độc tố có trong dịch chiết được phân tích;

As là diện tích pic của chất chuẩn có nồng độ gần giống nhất với nồng độ chất phân tích;

Cs là nồng độ của chất chuẩn, tính bng microgam trên mililit (mg/ml);

Vx là thể tích cuối cùng của dịch chiết được phân tích, tính bằng mililit (ml);

D là hệ số pha loãng dịch chiết mẫu (xem 5.3);

M là khối lượng phần mẫu thử, đã dùng trong quá trình làm sạch, tính bng gam (g), ví dụ 0,5 để làm sạch bằng cột SPE C18 và 0,25 g để làm sạch bng cột trao đổi ion SPE-COOH;

1000 là hệ số chuyển đổi kết quả từ mg/g sang mg/kg.

6.3. Tính NEO khi có mặt dcSTX

6.3.1. Yêu cu chung

Diện tích pic của NEO có trong phần mẫu thử có chứa cả NEO và dcSTX có thể tính theo hai phương pháp. Hình B.3 đưa ra sắc ký đồ sau khi oxy hóa bằng periodat và peroxit của chất chuẩn dcSTX và một phần mẫu thử chưa biết có chứa hỗn hợp NEO và dcSTX.

6.3.2. Phương pháp 1

Nếu nồng độ dcSTX trong phần mẫu thử cha hỗn hợp NEO và dcSTX là lớn đ tạo ra pic đu tiên tích phân tốt (pic D, Hình B.3) với oxy hóa bằng periodat, khi đó tính diện tích pic tương ứng với NEO (pic X(NEO)) từ t số của hai diện tích pic dcSTX tạo ra do oxy hóa cht chuẩn bằng periodat.

Đối với cht chuẩn dcSTX được phân tích với oxy hóa bằng periodat, thì t số của hai diện tích pic đưc tính bng:

Trong đó:

X(dcSTX) là diện tích pic của dcSTX trong pic C.

Diện tích pic NEO có thể được tính như sau:

6.3.3. Phương pháp 2

Nếu nồng độ của dcSTX trong phần mẫu thử chứa NEO và dcSTX không đ đ tạo ra pic đu tiên có thể tích phân tốt (pic D, Hình B.3) với oxy hóa bng periodat, thì tính diện tích pic tương ứng với NEO (pic X(NEO)) từ t số pic dcSTX được to ra với oxy hóa bằng periodat (pic A, Hình B.3) và diện tích pic dcSTX được to ra do quá trình oxy hóa bằng peroxit (pic E, Hình B.3) trong chất chuẩn.

Đối với cht chuẩn dcSTX được phân tích với oxy hóa bằng periodat và peroxit, thì t số của hai diện tích pic được tính bằng:

Trong đó:

X(dcSTX) là diện tích pic của dcSTX trong pic C.

Diện tích pic NEO có th được tính như sau:

6.4. Áp dụng phương pháp đối với phép phân tích thông dụng

Để áp dụng hiệu quả phương pháp này vào phép phân tích thông dụng khi cần phân tích một số lượng lớn mẫu thì nên sử dng quy trình sau (xem Hình C.1):

a) Phân tích dịch chiết mẫu thử sau khi làm sạch bằng cột SPE-C18 và quá trình oxy hóa bằng periodat. Nếu không có pic nào tương ứng với pic của chất chuẩn PSP, thì mẫu thử là âm tính và không cần phi phân tích tiếp.

b) Nếu có mặt bt kỳ độc tố STX, dcSTX, GTX2,3, B-1 hoặc C1,2 không hydroxyl hóa, nhưng không có mặt các độc tố NEO, GTX1,4 và C3,4 đã N-hydroxyl hóa, thì các độc tố không hydroxyl hóa có thể được định lượng bằng cách so sánh trực tiếp vi các chất chuẩn đã biết qua quá trình oxy hóa bằng periodat. Tuy nhiên, phản ứng oxy hóa peroxit nhạy hơn đối với B-1, C1,2 và dcSTX và được ưu tiên hơn nếu yêu cầu độ phát hiện tối ưu. Tuy nhiên, phn ứng oxy hóa bằng peroxit có thể được sử dụng để xác nhận kết qu của tất c các độc tố thu được từ quá trình oxy hóa bằng periodat.

c) Nếu có mặt c hai độc tố N-hydroxyl hóa và không hydroxyl hóa, thì các độc tố không hydroxyl hóa được định lượng sau khi oxy hóa một phần dịch chiết mẫu thử khác bng cách sử dng hydro peroxit và các pic được so sánh với pic của các chất chuẩn bị oxy hóa tương tự. Nguyên nhân là do quá trình oxy hóa bằng periodat một số độc tố hydroxyl hóa tạo ra các pic của sản phẩm chất rửa gii đồng chất không hydroxyl hóa và một số độc tố (đặc biệt là B-1, C1,2 và dcSTX) mà quá trình oxy hóa bằng peroxit cho độ phát hiện tốt hơn.

d) Để định lượng mọi độc tố N-hydroxyl hóa, làm sạch một phần dịch chiết mẫu thử khác bằng các cột SPE-COOH và phần thích hợp được oxy hóa sau quá trình oxy hóa bằng periodat. Bước này tách được C3,4 ra khỏi GTX1,4 và B-2 ra khỏi NEO, cho phép định lượng tất cả các độc tố bằng cách so sánh trực tiếp với các chất chuẩn và được thực hiện cùng với quá trình oxy hóa bằng periodat.

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) kết qu thử nghiệm thu được;

e) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưng đến kết qu.

 

Phụ lục A

(tham khảo)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Phương pháp này chấp nhận trị số HorRat < 2,0 để x lý số liệu thống kê với đối với tổng các độc tố PSP.

Các kết quả th nghiệm liên phòng được nêu trong các bảng từ Bảng A.1 đến Bng A.18.

Bảng A.1 – Các kết qu liên phòng th nghiệm về xác định STX trong động vật có v sau khi làm sạch bằng cột SPE C18

Số mu

Nn mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe%

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

11a(1b)

471,00

 

41,16

8,74

115,25

0,49

1

15(0)

1048,07

 

229,23

21,87

641,84

1,38

2

Ngao

15(0)

338,27

 

90,88

26,87

254,46

1,43

3

Hàu

15

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

15

KPH

 

 

 

 

 

5

Ngao

15(0)

522,20

 

69,39

13,29

194,29

0,75

5D

Ngao

15(0)

517,87

 

73,89

14,27

206,89

0,81

6

Ngao

15

KPH

 

 

 

 

 

7

Trai

14(0)

23,36

 

8,48

36,30

23,74

1,29

8

Trai

15(0)

309,60

 

78,07

25,22

218,60

1,32

8D

Trai

15(0)

315,53

 

70,28

22,27

196,78

1,17

9

Trai

15(0)

132,47

 

33,38

25,20

93,46

1,16

10

Hàu

15(0)

136,13

 

46,14

33,89

129,19

1,57

10D

Hàu

15(0)

144,47

 

41,64

28,82

116,59

1,35

11

Hàu

15(0)

257,67

 

59,49

23,09

166,57

1,18

12

Trai

15(0)

783,87

 

215,24

27,46

602,67

1,65

Thêm chuẩn 1

Trai

15(0)

223,07

74,4

52,46

23,52

146,89

1,17

Thêm chuẩn 2

Trai

15(0)

447,00

74,5

112,49

25,17

314,97

1,39

Thêm chuẩn 3

Trai

15(0)

51,27

93,2

16,96

33,08

47,49

1,32

Thêm chuẩn 4

Trai

15(0)

169,00

76,8

43,00

25,44

120,40

1,22

Thêm chuẩn 5

Trai

11(0)

13,18

 

8,65

65,63

24,22

2,14

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bng A.2 – Các kết qu liên phòng thử nghiệm về xác định STX trong động vật có v sau khi làm sạch bng cột SPE-COOH

Số mu

Nn mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe%

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mẫu thực nghiệm

Trai

15a(0b)

451,80

 

121,68

26,93

340,70

1,49

1

15(0)

955,93

 

187,77

19,64

525,76

1,22

2

Ngao

14(0)

294,57

 

82,80

28,11

231,84

1,46

3

Hàu

14

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

14

KPH

 

 

 

 

 

5

Ngao

15(0)

509,53

 

85,78

16,84

240,18

0,95

5D

Ngao

15(0)

474,40

 

82,56

17,40

231,17

0,97

6

Ngao

14

KPH

 

 

 

 

 

7

Trai

12(0)

21,33

 

6,80

31,88

19,04

1,12

8

Trai

15(0)

270,13

 

68,83

25,48

192,72

1,31

8D

Trai

13(0)

269,08

 

49,81

18,51

139,47

0,95

9

Trai

14(0)

119,64

 

38,16

31,90

106,85

1,45

10

Hàu

14(0)

140,00

 

45,24

32,31

126,67

1,50

10D

Hàu

15(0)

123,67

 

26,92

21,77

75,38

0,99

11

Hàu

15(0)

232,87

 

37,89

16,27

106,09

0,82

12

Trai

14(0)

644,00

 

78,89

12,25

220,89

0,72

Thêm chuẩn 1

Trai

13(0)

191,08

63,7

39,19

20,51

109,73

1,00

Thêm chuẩn 2

Trai

15(0)

409,27

68,2

122,65

29,97

343,42

1,64

Thêm chuẩn 3

Trai

11(0)

43,55

79,2

11,36

26,08

31,81

1,02

Thêm chun 4

Trai

15(0)

147,93

67,2

31,42

21,24

87,98

1,00

Thêm chuẩn 5

Trai

9(0)

10,44

 

4,48

42,91

12,54

1,35

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bng A.3 – Các kết qu liên phòng thử nghiệm về xác định NEO trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bng cột SPE C18

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRf

RSDRg, %

Giới hạn tái lập, Rh

Trị số HorRat

Mẫu thực nghiệm

Trai

10a(2b)

565,50

 

113,31

20,04

317,27

1,15

3

Hàu

15

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

15

KPH

 

 

 

 

 

5

Ngao

7(1)

33,14

 

12,75

38,47

35,70

1,44

5D

Ngao

9(1)

40,00

 

17,41

43,53

48,75

1,68

6

Ngao

15

KPH

 

 

 

 

 

8

Trai

14(0)

283,66

 

91,76

32,33

256,93

1,67

8D

Trai

14(0)

278,29

 

70,58

25,36

197,62

1,31

9

Trai

13(0)

140,08

 

45,88

32,75

128,46

1,52

12

Trai

15(0)

871,07

 

227,63

26,13

637,36

1,60

Thêm chuẩn 1

Trai

14(0)

222,64

55,7

88,03

39,54

246,48

1,97

Thêm chuẩn 2

Trai

15(0)

445,40

56,9

116,94

25,68

327,43

1,43

Thêm chuẩn 3

Trai

14(0)

158,29d

 

39,36

24,87

110,21

1,18

Thêm chuẩn 4

Trai

12(0)

213,33e

 

85,77

40,21

240,16

1,99

Thêm chun 5

Trai

12(0)

344,08e

 

163,71

47,58

458,39

2,53

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d Tng của NEO và dcSTX, tính theo NEO.

e NEO không có mặt trong các mẫu này. Các pic tạo bi dcSTX nhưng đưc tính theo NEO.

f sR là độ lệch chuẩn tái lp.

g RSDR là đ lệch chuẩn tương đi tái lập.

h R = 2,x sR.

Bng A.4 – Các kết quả liên phòng th nghiệm về xác định NEO trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe, %

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

15a(0b)

642,80

 

147,95

23,02

414,26

1,35

3

Hàu

14

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

14

KPH

 

 

 

 

 

5

Ngao

10(0)

38,80

 

13,02

33,56

36,46

1,29

5D

Ngao

10(0)

42,20

 

18,27

43,29

51,16

1,68

6

Ngao

14

KPH

 

 

 

 

 

8

Trai

13(1)

254,62

 

89,85

35,29

251,58

1,80

8D

Trai

15(0)

266,20

 

92,93

34,91

260,20

1,79

9

Trai

14(0)

97,64

 

46,37

47,49

129,84

2,09

12

Trai

14(1)

842,93

 

199,36

23,65

558,21

1,44

Thêm chuẩn 1

Trai

14(0)

212,29

53,1

68,05

32,06

190,54

1,59

Thêm chuẩn 2

Trai

15(0)

492,43

61,6

159,58

32,41

446,82

1,82

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bng A.5 – Các kết qu liên phòng th nghiệm về xác định NEO khi có mặt dcSTX trong mẫu động vật có vỏ thêm chuẩn sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH – Thêm chuẩn 3

Số phòng th nghiệm

NEO, mg/kg

Đ thu hồi, %

2

107

53,5

6a

137

68,5

12a

154

77,2

15

86

43,0

18

75

37,5

19a

92

46,0

22

112

56,0

23

153

76,5

Giá tr trung bình

114,48

57,28

Độ lệch chuẩn tái lp, SR

 

30,49

Độ lệch chuẩn tương đối tái lp, RSDR

26,63

 

Giới hạn tái lập: R = 2,8 x SR

 

85,37

Trị số HorRat

1,20

a Việc tính toán được thực hiện trong phòng thí nghiệm cộng tác sử dụng các kết quả do các cộng tác viên cung cp.

Bng A.6 – Các kết qu liên phòng thử nghiệm về xác định dcSTX trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE C18

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRe

RSDRf, %

Giới hạn tái lập, Rg

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

9a(0b)

18,78

 

21,61

115,07

60,51

3,95

1

13(0)

12,31

 

4,33

35,17

12,12

1,13

3

Hàu

15

KPHc

 

 

 

 

4

Trai

15

KPH

 

 

 

 

 

5

Ngao

14(0)

8,14

 

2,71

33,29

7,59

1,01

5D

Ngao

12(1)

7,42

 

1,83

24,66

5,12

0,74

6

Ngao

15

KPH

 

 

 

 

 

7

Trai

11(1)

10,55

 

2,02

19,15

5,66

0,60

11

Hàu

11(0)

3,45

 

1,63

47,25

4,56

1,26

12d

Trai

 

 

 

 

 

 

 

Thêm chuẩn 3

Trai

15(0)

83,73

83,7

41,17

49,17

115,28

2,12

Thêm chuẩn 4

Trai

15(0)

293,87

73,5

63,35

21,56

177,38

1,12

Thêm chuẩn 5

Trai

14(1)

385,64

64,27

40,60

10,53

113,68

0,57

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d Không tính được, ch có 7 phòng th nghiệm báo cáo d liệu; s còn lại báo cáo là không phát hiện được.

e sR là độ lệch chuẩn tái lp.

f RSDR là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

g R = 2,x sR.

Bng A.7 – Các kết qu liên phòng th nghiệm về xác định dcSTX trong động vật có v sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRe

RSDRf, %

Giới hạn tái lập, Rg

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

10a(0b)

12,60

 

12,38

98,25

34,66

3,18

1

Sò

12(1)

9,88

 

3,89

39,37

10,89

1,23

3

Hàu

14

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

14

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

11(0)

8,36

 

4,86

58,13

13,61

1,77

5D

Ngao

10(0)

6,80

 

3,33

48,97

9,32

1,44

6

Ngao

14

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

13(0)

11,62

 

3,04

26,16

8,51

0,84

11d

Hàu

 

 

 

 

 

 

 

12

Trai

10(0)

7,80

 

3,22

41,28

9,02

1,24

Thêm chuẩn 3

Trai

13(0)

69,08

69,1

17,09

24,74

47,85

1,03

Thêm chun 4

Trai

15(0)

276,00

69,0

52,83

19,14

147,92

0,99

Thêm chuẩn 5

Trai

15(0)

396,27

66,04

93,72

23,65

262,42

1,29

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d Không tính được, ch có 6 phòng th nghiệm báo cáo d liệu; s còn lại báo cáo là không phát hiện được.

e sR là độ lệch chuẩn tái lp.

f RSDR là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

g R = 2,x sR.

Bng A.8 – Các kết quả liên phòng thử nghiệm về xác định GTX1,4 trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE C18

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRe

RSDRf, %

Giới hạn tái lập, Rg

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

11a(0b)

1437,55

 

649,76

45,20

1819,33

2,98

1

10(0)

199,30

 

170,10

85,35

476,28

4,19

2

Ngao

11(1)

285,27

 

60,08

21,06

168,22

1,09

3

Hàu

16

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

16

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

11(0)

61,36

 

28,46

46,38

79,69

1,91

5D

Ngao

11(0)

62,09

 

17,73

28,56

49,64

1,17

6

Ngao

16

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

15(0)

1489,13d

 

417,08

28,01

1167,82

1,86

8

Trai

12(0)

572,67

 

156,87

27,39

439,24

1,57

8D

Trai

13(0)

672,23

 

164,05

24,40

459,34

1,44

9

Trai

13(0)

254,46

 

69,57

27,34

194,80

1,39

11

Hàu

12(0)

81,00

 

54,86

67,73

153,61

2,90

12

Trai

10(0)

1815,70d

 

427,69

23,56

1197,53

1,61

Thêm chuẩn 1

Trai

10(0)

240,10

60,0

115,87

48,26

324,44

2,43

Thêm chuẩn 2

Trai

11(0)

1440,45d

 

274,83

19,08

769,52

1,26

Thêm chuẩn 5

Trai

12(1)

2236,25d

 

571,98

25,58

1601,54

1,80

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d Tng của GTX1,4 và C3,4, được tính theo GTX1,4.

e sR là độ lệch chuẩn tái lp.

f RSDR là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

g R = 2,x sR.

Bng A.9 – Các kết quả liên phòng th nghiệm về xác định GTX1,4 trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bng cột SPE-COOH

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRf

RSDRg, %

Giới hạn tái lập, Rh

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

16a(06)

1279,38

 

316,92

24,77

887,38

1,61

1c

 

 

 

 

 

 

 

2

Ngao

13(1)

364,23

 

141,21

38,77

395,39

2,08

3

Hàu

15

KPHd

 

 

 

 

 

4

Trai

15

KPHd

 

 

 

 

 

5

Ngao

13(0)

73,54

 

17,18

23,36

48,10

0,99

5D

Ngao

13(0)

71,46

 

22,60

31,63

63,28

1,33

6

Ngao

16

KPHd

 

 

 

 

 

7

Trai

14(1)

240,07

 

64,50

26,87

180,60

1,35

8

Trai

15(1)

645,00

 

147,94

22,94

414,23

1,34

8D

Trai

15(1)

674,73

 

120,99

17,93

338,77

1,06

9

Trai

14(0)

235,57

 

44,94

19,08

125,83

0,96

11

Hàu

8(1)

48,88

 

13,03

26,66

36,48

1,06

12

Trai

16(0)

2079,31

 

394,95

18,99

1105,86

1,33

Thêm chuẩn 1

Trai

14(0)

267,50

66,9

86,80

32,45

243,04

1,66

Thêm chuẩn 2

Trai

15(0)

628,07

78,5

167,26

26,63

468,33

1,55

Thêm chuẩn 5

Trai

14(0)

265,21e

 

68,76

25,93

192,53

1,33

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ.

c không tính được. Một nửa số phòng thử nghiệm báo cáo là không phát hiện được

d KPH là không phát hiện được.

e GTX1,4 không có mặt trong mẫu này. Các pic to bi dcGTX2,3 (đã xác nhận bng quá trình oxy hóa peroxit) nhưng được tính theo GTX1,4.

f sR là độ lệch chuẩn tái lp.

g RSDR là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

h R = 2,x sR.

Bảng A.10 – Các kết qu liên phòng thử nghiệm về xác định GTX2,3 trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE C18

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe, %

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mẫu thực nghiệm

Trai

12a(1b)

3291,17

 

523,82

15,92

1466,70

1,19

1

16(0)

2526,00

 

652,30

25,82

1826,44

1,86

2

Ngao

15(1)

2537,73

 

479,37

18,89

1342,24

1,36

3

Hàu

16

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

16

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

16(0)

119,75

 

21,78

18,19

60,98

0,83

5D

Ngao

16(0)

113,75

 

24,44

21,49

68,43

0,97

6

Ngao

16

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

14(0)

348,64

 

92,95

26,66

260,26

1,42

8

Trai

16(0)

813,13

 

252,98

31,11

708,34

1,89

8D

Trai

16(0)

757,31

 

180,55

23,84

505,54

1,43

9

Trai

16(0)

316,44

 

65,95

20,84

184,66

1,10

10

Hàu

16(0)

367,25

 

88,99

24,23

249,17

1,30

10D

Hàu

15(1)

336,20

 

78,60

23,38

220,08

1,24

11

Hàu

15(1)

673,00

 

182,03

27,05

509,68

1,59

12

Trai

15(1)

1855,93

 

505,27

27,22

1414,76

1,87

Thêm chuẩn 1

Trai

14(1)

227,36

75,8

42,71

18,79

119,59

0,94

Thêm chuẩn 2

Trai

16(0)

529,31

88,2

167,47

31,64

468,92

1,80

Thêm chuẩn 5

Trai

16(0)

954,31

79,5

293,49

30,75

821,77

1,91

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bảng A.11 – Các kết quả liên phòng thử nghim về xác định GTX2,3 trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe, %

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mu thc nghiệm

Trai

15a(1b)

3314,33

 

594,49

17,94

1664,57

1,34

1

16(0)

2347,94

 

522,01

22,23

1461,63

1,58

2

Ngao

16(0)

2697,50

 

506,20

18,77

1417,36

1,36

3

Hàu

15

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

14

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

15(1)

132,00

 

25,33

19,19

70,92

0,88

5D

Ngao

16(0)

115,94

 

28,43

24,52

79,60

1,11

6

Ngao

15

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

15(0)

342,80

 

80,23

23,40

224,64

1,25

8

Trai

16(0)

804,63

 

164,42

20,43

460,38

1,24

8D

Trai

16(0)

745,94

 

164,78

22,09

461,38

1,32

9

Trai

16(0)

320,88

 

58,22

18,14

163,02

0,96

10

Hàu

15(1)

369,47

 

71,38

19,32

199,86

1,04

10D

Hàu

15(0)

341,60

 

86,11

25,21

241,11

1,34

11

Hàu

16(0)

701,31

 

203,93

29,08

571,00

1,72

12

Trai

16(0)

1873,94

 

345,02

18,41

966,06

1,27

Thêm chuẩn 1

Trai

15(0)

261,27

87,1

42,72

16,35

119,62

0,84

Thêm chun 2

Trai

16(0)

563,56

93,9

116,81

20,73

327,07

1,19

Thêm chuẩn 5

Trai

16(0)

1024,88

85,4

174,72

17,05

489,22

1,07

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bng A.12 – Các kết quả liên phòng thử nghiệm về xác định B-1 trong động vật có v sau khi làm sạch bằng cột SPE C18

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe, %

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

11a(0b)

435,36

 

47,84

10,99

133,95

0,61

1

13(0)

91,08

 

25,12

27,58

70,34

1,20

2

Ngao

11(1)

31,00

 

7,36

23,74

20,61

0,88

3

Hàu

16

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

16

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

13(1)

42,77

 

8,36

19,55

23,41

0,76

5D

Ngao

13(1)

40,54

 

7,22

17,81

20,22

0,69

6

Ngao

16

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

15(0)

145,07

 

27,11

18,69

75,91

0,87

8

Trai

15(0)

328,00

 

47,09

14,36

131,85

0,76

8D

Trai

15(0)

334,13

 

51,52

15,42

144,26

0,82

9

Trai

15(0)

119,80

 

25,34

21,15

70,95

0,96

10

Hàu

12(0)

37,67

 

9,26

24,58

25,93

0,94

10D

Hàu

14(0)

39,57

 

12,97

32,78

36,32

1,26

11

Hàu

14(0)

73,14

 

16,47

22,52

46,12

0,95

12

Trai

15(0)

946,87

 

263,88

27,87

738,86

1,73

Thêm chuẩn 2

Trai

14(0)

53,36

 

16,01

30,00

44,83

1,21

Thêm chuẩn 3

Trai

15(0)

311,13

77,8

69,98

22,49

195,94

1,18

Thêm chuẩn 4

Trai

15(0)

1212,53

75,8

239,77

19,77

671,36

1,27

Thêm chuẩn 5

Trai

14(1)

691,00

86,4

223,40

32,33

625,52

1,91

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bng A.13 – Các kết qu liên phòng th nghiệm về xác định B-1 trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe, %

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mẫu thực nghiệm

Trai

14a(0b)

349,71

 

58,75

16,80

164,50

0,90

1

12(1)

71,75

 

13,02

18,15

36,46

0,76

2

Ngao

9(0)

27,11

 

4,43

16,34

12,40

0,59

3

Hàu

14

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

14

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

12(0)

42,00

 

11,07

26,36

31,00

1,02

5D

Ngao

12(0)

40,75

 

9,73

23,88

27,24

0,92

6

Ngao

14

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

13(0)

120,85

 

17,71

14,65

49,59

0,67

8

Trai

14(0)

285,79

 

43,73

15,30

122,44

0,79

8D

Trai

14(0)

274,14

 

52,47

19,14

146,92

0,98

9

Trai

14(0)

123,71

 

29,11

23,53

81,51

1,07

10

Hàu

10(0)

30,60

 

5,99

19,58

16,77

0,72

10D

Hàu

12(0)

37,58

 

10,93

29,08

30,60

1,11

11

Hàu

12(0)

63,00

 

11,09

17,60

31,05

0,73

12

Trai

14(0)

784,86

 

73,41

9,35

205,55

0,56

Thêm chuẩn 2

Trai

13(0)

46,00

 

8,78

19,09

24,58

0,75

Thêm chuẩn 3

Trai

13(0)

292,54

73,1

43,03

14,71

120,48

0,76

Thêm chuẩn 4

Trai

14(0)

1064,71

66,5

147,33

13,84

412,52

0,87

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Thêm chuẩn 5

Trai

15(0)

619,67

77,5

85,39

13,78

239,09

0,80

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bng A.14 – Các kết quả liên phòng thử nghiệm về xác định C1,2 trong động vật có v sau khi làm sạch bng cột SPE C18

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe, %

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

12a(0b)

299,00

 

50,81

16,99

142,27

0,89

2

Ngao

13(1)

253,62

 

56,83

22,41

159,12

1,14

3

Hàu

16

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

15

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

16(0)

256,50

 

74,66

29,11

209,05

1,48

5D

Ngao

15(1)

239,13

 

50,81

21,25

142,27

1,07

6

Ngao

16

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

15(0)

912,40

 

301,90

33,09

845,32

2,04

8

Trai

12(0)

118,08

 

63,81

54,04

178,67

2,45

8D

Trai

10(1)

96,30

 

24,10

25,03

67,48

1,10

9

Trai

9(0)

76,56

 

80,34

104,9

224,95

4,46

10

Hàu

11(0)

161,91

 

43,73

27,01

122,44

1,28

10D

Hàu

15(0)

189,73

 

58,51

30,84

163,83

1,50

11

Hàu

16(0)

357,69

 

58,20

16,27

162,96

0,87

12

Trai

16(0)

256,50

 

67,38

26,27

188,66

1,34

Thêm chuẩn 2

Trai

13(1)

734,85

73,5

108,97

14,83

305,12

0,88

Thêm chuẩn 5

Trai

14(1)

1566,50

78,3

227,74

14,54

637,67

0,97

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bng A.15 – Các kết qu liên phòng th nghiệm về xác định C1,2 trong động vật có v sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRe

RSDRf, %

Giới hạn tái lập, Rg

Trị số HorRat

Mu thực nghiệm

Trai

14a(0b)

300,93

 

77,77

25,84

217,76

1,35

2

Ngao

14(1)

261,07

 

66,24

25,37

185,47

1,30

3

Hàu

14

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

14

KPHc

 

 

 

 

 

5

Ngao

14(1)

237,07

 

64,30

27,12

180,04

1,37

5D

Ngao

15(0)

238,07

 

80,34

33,75

224,95

1,70

6

Ngao

15

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

15(0)

983,40

 

255,06

25,94

714,17

1,62

8

Trai

9(0)

108,56

 

40,27

37,09

112,76

1,66

8D

Trai

10(0)

93,40

 

35,75

38,28

100,10

1,67

9d

Trai

 

 

 

 

 

 

10

Hàu

14(0)

204,36

 

57,38

28,08

160,66

1,38

10D

Hàu

14(0)

200,71

 

48,51

24,17

135,83

1,19

11

Hàu

15(0)

349,07

 

81,27

23,28

227,56

1,24

12

Trai

12(1)

257,75

 

39,23

15,22

109,84

0,78

Thêm chuẩn 2

Trai

14(0)

859,64

86,0

204,53

23,79

572,68

1,45

Thêm chun 5

Trai

15(0)

1687,13

84,4

342,42

20,30

958,78

1,37

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d không tính đưc, ch 3 phòng thử nghiệm báo cáo dữ liệu, các phòng còn lại báo cáo không phát hiện được.

e sR là độ lệch chuẩn tái lp.

f RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

g R = 2,8 x sR.

Bng A.16 – Các kết quả liên phòng thử nghiệm v xác định C3,4 trong động vật có v sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH

Số mu

Nền mu

S lượng phòng thử nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ thu hồi, %

sRd

RSDRe, %

Giới hạn tái lập, Rf

Trị số HorRat

3

Hàu

15

KPHc

 

 

 

 

 

4

Trai

15

KPHc

 

 

 

 

 

6

Ngao

15

KPHc

 

 

 

 

 

7

Trai

13a(0b)

837,15

 

227,24

27,14

636,27

1,65

12

Trai

10(1)

237,50

 

106,35

44,78

297,78

2,25

Thêm chuẩn 2

Trai

9(0)

724,78

80,5

180,88

24,96

506,46

1,49

Thêm chuẩn 5

Trai

15(0)

1425,07

79,2

301,97

21,19

845,52

1,40

a là số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi tr các ngoại lệ thống kê Dixon.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c KPH là không phát hiện được.

d sR là độ lệch chuẩn tái lp.

e RSDR là độ lệch chun tương đối tái lập.

f R = 2,8 x sR.

Bảng A.17 – Các kết quả liên phòng th nghiệm về xác định độc tố PSP trong động vật có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE C18 – xử lý thống kê mẫu mù giống nhau

Độc tố PSP

Cặp Youden

Nn mu

Số lượng phòng th nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

src

RSDrd, %

sRe

RSDRf%

Giới hạn lặp lại, rg

Giới hạn tái lập , Rh

Trị số HorRat

STX

5 và 5D

Ngao

15a(0b)

520,03

31,38

6,03

71,46

13,74

87,85

200,10

0,78

 

8 và 8D

Trai

15(0)

312,57

67,80

21,69

73,23

23,43

189,84

205,05

1,23

 

10 và 10D

Hàu

15(0)

140,30

24,96

17,79

43,91

31,29

69,87

122,94

1,46

NEO

8 và 8D

Trai

13(0)

280,00

43,14

15,41

83,82

29,94

120,79

234,70

1,55

dcSTX

5 và 5D

Ngao

12(0)

7,46

0,68

9,08

2,02

27,04

1,90

5,65

0,81

GTX1,4

5 và 5D

Ngao

9(0)

64,61

12,85

19,89

24,13

37,35

35,98

67,57

1,55

 

8 và 8D

Trai

11(0)

601,45

119,96

19,95

155,53

25,86

335,89

435,48

1,50

GTX2,3

5 và 5D

Ngao

16(0)

116,75

15,77

13,51

23,15

19,83

44,15

64,82

0,90

 

8 và 8D

Trai

16(0)

785,22

135,94

17,31

220,26

28,05

380,64

616,72

1,69

 

10 và 10D

Hàu

15(0)

347,13

66,64

19,20

81,10

23,36

186,59

227,09

1,25

B-1

5 và 5D

Ngao

13(0)

41,65

5,26

12,62

7,82

18,78

14,72

21,90

0,73

 

8 và 8D

Trai

15(0)

331,07

27,86

8,42

49,17

14,87

78,01

137,68

0,79

 

10 và 10D

Hàu

12(0)

38,58

8,35

21,63

11,69

30,30

23,37

32,73

1,16

C1,2

5 và 5D

Ngao

15(0)

241,47

37,53

15,54

53,39

22,11

105,09

149,49

1,12

8 và 8D

Trai

8(0)

101,00

28,62

28,34

38,38

38,00

80,14

107,45

1,68

 

10 và 10D

Hàu

11(0)

168,77

53,48

31,69

53,48

31,69

149,75

149,75

1,52

a là s lưng phòng th nghiệm được giữ lại sau khi trừ các ngoại l thống kê Cochran.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c sr là độ lệch chuẩn tái lập.

d RSDr là độ lệch chuẩn tương đối tái lp.

e sR là độ lệch chuẩn tái lập.

f RSDR là độ lệch chuẩn tương đối tái lp.

g r = 2,8 x sr.

h R = 2,8 x sR.

Bảng A.18 – Các kết quả liên phòng th nghiệm về xác định độc tố PSP trong động vt có vỏ sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH – xử lý thống kê mẫu mù giống nhau

Độc tố PSP

Cặp Youden

Nn mu

Số lượng phòng th nghiệm

Giá trị trung bình, mg/kg

src

RSDrd, %

sRe

RSDRf%

Giới hạn lặp lại, rg

Giới hạn tái lập , Rh

Trị số HorRat

STX

5 và 5D

Ngao

15(0)

491,97

43,99

8,94

85,73

17,43

123,16

240,04

0,98

 

8 và 8D

Trai

13(0)

273,31

36,19

13,24

60,05

21,97

101,32

168,15

1,13

 

10 và 10D

Hàu

14(0)

132,14

32,87

24,88

37,88

28,67

92,05

106,08

1,32

NEO

8 và 8D

Trai

13(0)

262,65

67,73

25,79

89,95

34,24

189,65

251,79

1,75

 

 

 

10(0)

40,50

7,82

19,30

15,86

39,15

21,89

44,40

1,51

dcSTX

5 và 5D

Ngao

9(0)

6,89

0,88

12,80

3,15

45,76

2,47

8,83

1,35

GTX1,4

5 và 5D

Ngao

12(0)

73,92

11,10

15,02

19,36

26,19

31,09

54,20

1,11

 

8 và 8D

Trai

15(0)

659,87

85,84

13,01

135,04

20,47

240,36

378,12

1,20

GTX2,3

5 và 5D

Ngao

15(0)

124,47

19,88

15,97

28,14

22,61

55,65

78,80

1,03

 

8 và 8D

Trai

16(0)

775,28

91,07

11,75

166,54

21,48

380,64

616,72

1,69

 

10 và 10D

Hàu

14(0)

357,21

84,30

23,60

84,30

23,60

236,03

236,03

1,26

B-1

5 và 5D

Ngao

11(0)

40,68

5,04

12,39

10,37

25,48

14,11

29,03

0,98

 

8 và 8D

Trai

14(0)

279,96

40,58

14,49

48,02

17,15

113,62

134,44

0,89

 

10 và 10D

Hàu

10(0)

35,25

8,49

24,10

9,56

27,11

23,78

26,76

1,02

C1,2

5 và 5D

Ngao

14(0)

230,43

46,06

19,99

62,14

26,97

128,97

174,01

1,35

 

8 và 8D

Trai

8(0)

100,94

19,99

19,80

40,52

40,14

55,96

113,45

1,78

 

10 và 10D

Hàu

14(0)

202,54

37,12

18,33

52,66

26,00

103,93

147,46

1,28

a là s lưng phòng th nghiệm được giữ lại sau khi trừ các ngoại l thống kê Cochran.

b là số lượng phòng th nghiệm ngoại lệ.

c sr là độ lệch chuẩn lp lại.

d RSDr là độ lệch chuẩn tương đối lp lại.

e sR là độ lệch chuẩn tái lập.

f RSDR là độ lệch chuẩn tương đối tái lp.

g r = 2,8 x sr.

h R = 2,8 x sR.

 

Phụ lục B

(tham khảo)

Ví dụ về sắc ký đồ

CHÚ DN: Các mũi tên ch trên các pic được sử dụng đ định lượng.

Hình sc ký đồ cho thy các sản phẩm oxy hóa được hình thành sau khi oxy hóa bằng periodat và peroxit của các độc tố trong thử nghiệm này. Khi lượng bng nhau của từng chất độc đã được sử dụng cho mi phản ứng oxy hóa.

Hình B.1 – Sắc ký đồ của các độc t không hydroxyl hóa và các độc tố hydroxyl hóa

CHÚ DẪN

Các mũi tên ch trên các pic được sử dụng đ định lượng.

Pic 1 và 2 là sản phm oxy hóa th cấp của GTX1, 4;   Pic 3 và 4 là sản phẩm oxy hóa thứ cấp của NEO;

Pic 5 là một sản phm oxy hóa thứ cp của dcSTX;     Pic 6 là một sn phm oxy hóa th cp của C3, 4.

Hình B.2 – Sắc ký đồ điển hình thu được vi 3 hỗn hợp của các chất chuẩn phân tích độc tố PSP

(Các độc tố hydroxyl bị oxy hóa với periodat và các độc tố không hydroxyl hóa với peroxit)

CHÚ DN

A, B, và E là din tích pic của cht chun dcSTX sau khi oxy hóa bng periodat (pic A và pic B) và peroxit (pic E);

C, D, và F là diện tích pic của mẫu chưa biết b nhiễm dcSTX và NEO sau khi oxy hóa bng periodat (pic C, pic D) và peroxil (pic F).

Hình B.3 – Sắc ký đồ của chất chuẩn dcSTX sau khi oxy hóa bằng periodat và peroxit

(giải thích các tính toán NEO có mặt dcSTX)

 

Phụ lục C

(tham khảo)

Sơ đồ quy trình phân tích thông dụng

Hình C.1 – Sơ đồ quy trình phân tích thông dụng

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] AOAC Official Method 959.08 Paralytic Shellfish Poison, Biological Method

 


1) Có bán sẵn t Hội đồng nghiên cứu quc gia Canada (Halifax, Canada). Đây là ví dụ v sn phthích hợp có bán sn trên th trưng. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chun và không n định phải s dụng chúng. Có th sử dụng các sản phm tương t nếu cho kết quả tương đương.

2) Supelco, Bellefonte, PA, USA là ví dụ v sn phm thích hợp có bán sẵn trên thị trưng.

3) J.T Baker, Phillipsburg, New Jersey, USA là ví dụ v sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trưng.

4) Torrance, CA, USA là ví d về sản phm thích hợp có bán sẵn trên thị trưng.

Các thông tin nêu trên đưa ra tạo thuận tin cho ngui sử dụng tiêu chun và không n định phi sử dụng các sản phm này. Có th s dụng các sn phm tuơng tự nếu cho kết qu tương đương.

5) Đây là ví dụ v sn phẩm thích hp có bán sn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chun và không n đnh phi sử dng các sn phm này. Các sản phẩm tương t có th được s dng nếu cho kếquả tương đương.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10644:2014 (AOAC 2005.06) VỀ THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG ĐỘNG VẬT CÓ VỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CHIẾT PHA RẮN VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG
Số, ký hiệu văn bản TCVN 10644:2014 Ngày hiệu lực
Loại văn bản Tiêu chuẩn Việt Nam Ngày đăng công báo
Lĩnh vực Ngày ban hành
Cơ quan ban hành Tình trạng Còn hiệu lực

Các văn bản liên kết

Văn bản được hướng dẫn Văn bản hướng dẫn
Văn bản được hợp nhất Văn bản hợp nhất
Văn bản bị sửa đổi, bổ sung Văn bản sửa đổi, bổ sung
Văn bản bị đính chính Văn bản đính chính
Văn bản bị thay thế Văn bản thay thế
Văn bản được dẫn chiếu Văn bản căn cứ

Tải văn bản