TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10810:2015 VỀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DICLAZURIL – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10810:2015

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DICLAZURIL – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs – Determination of diclazuril content – High performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 10810:2015 được xây dựng dựa theo Commission Regulation (EC) No. 152/2009;

TCVN 10810:2015 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DICLAZURIL – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs – Determination of diclazuril content – High performance liquid chromatographic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng diclazuril [(+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4- (2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phenyl] acetonitri] trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao.

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng đối với premix.

Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 0,1 mg/kg và giới hạn định lượng là 0,5 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử

3. Nguyên tắc

Sau khi bổ sung chất chuẩn nội, mẫu được chiết bằng metanol đã axit hóa.

Đối với thức ăn chăn nuôi, làm tinh sạch dịch chiết trên cột chiết pha rắn C18. Diclazuril được rửa giải ra khỏi cột bằng hỗn hợp metanol đã axit hóa và nước. Sau khi cho bay hơi, phần còn lại được hòa tan trong DMF/nước.

Đối với các premix, dịch chiết được cho bay hơi và phần còn lại được hòa tan trong DMF/nước.

Hàm lượng diclazuril được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo gradient ba kênh, sử dụng detector UV.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1. Nước, loại dùng cho HPLC.

4.2. Amoni axetat.

4.3. Tetrabutylamoni hydro sulfat (TBHS).

4.4. Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

4.5. Metanol, loại dùng cho HPLC.

4.6. N,N-dimethylformamide (DMF).

4.7. Axit clohydric, ρ₂₀ = 1,19 g/ml

4.8. Chất chuẩn: Diclazuril II-24: (+)-4-chlorphenyl [2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4- triazin-2-yl) phenyl] acetonitrile có độ tinh khiết đảm bảo, kí hiệu E771.

4.8.1. Dung dịch chuẩn gốc diclazuril, 500 μg/ml

Cân 25 mg chất chuẩn diclazuril (4.8), chính xác đến 0,1 mg, vào bình định mức 50 ml. Hòa tan trong DMF (4.6), thêm DMF (4.6) đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm hoặc sử dụng bình màu hổ phách và bảo quản trong tủ lạnh. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 ^oC dung dịch này có thể ổn định trong 1 tháng.

4.8.2. Dung dịch chuẩn diclazuril, 50 μg/ml

Chuyển 5,00 ml dung dịch chuẩn gốc (4.8.1) vào bình định mức 50 ml, thêm DMF (4.6) đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm hoặc sử dụng bình màu hổ phách và bảo quản trong tủ lạnh. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 °C dung dịch này có thể ổn định trong 1 tháng.

4.9. Chất chuẩn nội 2,6 dichloro-α-(4-chlorophenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2 (3H)-yl) α-methylbenzen-acetonitril

4.9.1. Dung dịch chuẩn nội gốc, 500 μg/ml

Cân 25 mg chất chuẩn nội (4.9) chính xác đến 0,1 mg, vào bình định mức 50 ml. Hòa tan trong DMF (4.6) , thêm DMF (4.6) đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm hoặc sử dụng bình màu hổ phách và bảo quản trong tủ lạnh. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 °C dung dịch này có thể ổn định trong 1 tháng.

4.9.2. Dung dịch chuẩn nội, 50 μg/ml

Chuyển 5,00 ml dung dịch chuẩn nội gốc (4.9.1) vào bình định mức 50 ml, thêm DMF (4.6) đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm hoặc sử dụng bình màu hổ phách và bảo quản trong tủ lạnh. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 °C dung dịch này có thể ổn định trong 1 tháng.

4.9.3. Dung dịch chuẩn nội dùng cho premix, ρ/1000 mg/ml

(ρ là hàm lượng diclazuril danh định trong premix, tính bằng mg/kg)

Cân ρ/10 mg chất chuẩn nội, chính xác đến 0,1 mg, trong bình định mức 100 ml, hòa tan trong DMF (4.6) trong bể siêu âm (5.6), thêm DMF đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm hoặc sử dụng bình màu hổ phách và bảo quản trong tủ lạnh. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 °C dung dịch này có thể ổn định trong 1 tháng.

4.10. Dung dịch hiệu chuẩn, 2 μg/ml.

Dùng pipet lấy 2,00 ml dung dịch chuẩn diclazuril (4.8.2) và 2,00 ml dung dịch chuẩn nội (4.9.2) vào bình định mức 50 ml. Thêm 16 ml DMF (4.6), thêm nước đến vạch và trộn. Dung dịch này cần được chuẩn bị mới trước khi sử dụng.

4.11. Cột chiết pha rắn C18, ví dụ: Bond Elut, dung tích: 1 ml, khối lượng chất hấp thụ: 100 mg.

4.12. Dung môi chiết: metanol đã axit hóa.

Dùng pipet lấy 5,0 ml axit clohydric (4.7) cho vào 1000 ml metanol (4.5) và trộn.

4.13. Pha động dùng cho HPLC

4.13.1. Dung môi rửa giải A: dung dịch amoni axetat – tetrabutylamoni hydro sulfat.

Hòa tan 5 g amoni axetat (4.2) và 3,4 g TBHS (4.3) trong 1000 ml nước (4.1) và trộn.

4.13.2. Dung môi rửa giải B: axetonitril (4.4).

4.13.3. Dung môi rửa giải C: metanol (4.5).

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1. Máy lắc cơ học.

5.2. Thiết bị HPLC gradient ba kênh

5.2.1. Cột sắc kí lỏng, loại Hypersil ODS, cỡ hạt nhồi 3 μm, kích thước 100 mm x 4,6 mm, hoặc loại tương đương.

5.2.2. Detector UV, có điều chỉnh bước sóng hoặc detector mảng diod.

5.3. Bộ cỏ quay.

5.4. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 μm.

5.5. Bộ phân phối chân không.

5.6. Bể siêu âm.

5.7. Cân, có thể cân được 25 mg, chính xác đến 0,1 mg.

5.8. Cân, có thể cân được 1 g, chính xác đến 0,001 g.

5.9. Cân, có thể cân được 50 g, chính xác đến 0,01 g.

5.10. Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.

5.11. Bình định mức, dung tích 50 ml và 100 ml.

5.12. Bình nón, dung tích 500 ml.

6. Lấy mẫu

Mẫu phải đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi- Lấy mẫu.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).

8. Cách tiến hành

8.1. Yêu cầu chung

8.1.1. Mẫu thử trắng

Cần phân tích mẫu trắng để chắc chắn rằng không có mặt diclazuril hoặc chất gây nhiễu. Mẫu trắng phải cùng loại với mẫu thử nhưng không chứa diclazuril hoặc chất gây nhiễu.

8.1.2. Kiểm tra độ thu hồi

Kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng được bổ sung một lượng diclazuril tương tự lượng dự kiến đó có mặt trong mẫu. Để bổ sung ở mức 1 mg/kg, chuyển 0,1 ml dung dịch chuẩn gốc (4.8.1) vào 50 g mẫu trắng, trộn kỹ và để 10 min, trộn lại vài lần trước khi tiếp tục phép xác định (8.2).

Nếu không sẵn có mẫu trắng cùng loại với mẫu thử (xem 8.1.1) thì có thể kiểm tra độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn. Trong trường hợp này, mẫu phân tích được bổ sung một lượng diclazuril tương tự với lượng dự kiến có trong mẫu. Mẫu này được phân tích cùng với mẫu không thêm chuẩn và từ kết quả thu được tính độ thu hồi.

8.2. Chiết

8.2.1. Thức ăn chăn nuôi

Cân khoảng 50 g mẫu, chính xác đến 0,01 g, chuyển vào bình nón dung tích 500 ml, thêm 1,00 ml dung dịch chuẩn nội (4.9.2), 200 ml dung môi chiết (4.12) và đậy nắp bình. Lắc hỗn hợp trên máy lắc (4.1) qua đêm. Để yên 10 min. Chuyển 20 ml phần nước phía trên vào vật chứa bằng thủy tinh thích hợp và pha loãng với 20 ml nước. Chuyển dung dịch này vào cột chiết (4.11), dùng bộ phân phối chân không (5.5) để hút qua cột. Rửa cột với 25 ml hỗn hợp dung môi chiết (4.12) và nước, tỷ lệ 65:35 (thể tích). Loại bỏ phần đã thu và rửa giải các hợp chất với 25 ml hỗn hợp dung môi chiết (4.12) và nước, tỷ lệ 80:20 (thể tích). Cho bay hơi phần dịch này cho đến khô bằng thiết bị cô quay (5.3) ở 60 °C. Hòa tan phần còn lại trong 1,0 ml DMF (4.6), bổ sung 1,5 ml nước (4.1) và trộn. Lọc qua bộ lọc màng (5.4). Tiến hành xác định bằng HPLC (8.3).

8.2.2. Premix

Cân khoảng 1 g mẫu thử, chính xác đến 0,001 g, chuyển vào bình nón dung tích 500 ml, bổ sung 1.0 ml dung dịch chuẩn nội (4.9.3), 200 ml dung môi chiết (4.12) và đậy nắp bình. Lắc hỗn hợp qua đêm trên máy lắc (5.1). Để yên 10 min. Chuyển 10000/p ml (p là hàm lượng danh định của diclazuril trong premix tính bằng mg/kg) phần nước phía trên vào bình cầu đáy tròn dung tích thích hợp. Làm bay hơi đến khô dưới áp suất giảm ở 60 °C bằng thiết bị cô quay (5.3). Hòa tan phần còn lại trong 10,0 ml DMF (4.6), thêm 15,0 ml nước (3.1) và trộn. Tiếp tục xác định bằng HPLC (8.3).

8.3. Xác định bằng HPLC

8.3.1. Thông số

Nên sử dụng các điều kiện sau đây, có thể sử dụng các điều kiện khác nếu cho kết quả tương đương:

– Cột sắc kí lỏng (5.1.1): kích thước 100 mm x 4,6 mm, Hypersil ODS, cỡ hạt nhồi 3 μm, hoặc loại tương đương;

– Pha động (4.6):

Dịch rửa giải A (4.13.1): dung dịch amoni axetat và tetrabutyl-amoni hydro sulfat;

Dịch rửa giải B (4.13.2): axetonitril;

Dịch rửa giải C (4.13.3): metanol.

– Cách rửa giải: các điều kiện ban đầu gradient tuyến tính: A : B : C = 60 : 20 : 20 (thể tích) sau 10 min. Rửa giải gradient trong 30 min: A : B : C = 45: 20 : 35 (thể tích). Dùng B rửa trong 10 min.

– Tốc độ dòng: 1,5 ml/min đến 2 ml/min;

– Thể tích bơm: 20 μl;

– Bước sóng phát hiện: 280 nm.

Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc kí, bơm vài lần dung dịch hiệu chuẩn (4.10) có chứa 2,0 μg/ml, cho đến khi đạt được chiều cao (diện tích) pic và thời gian lưu ổn định.

8.3.2. Dung dịch hiệu chuẩn

Bơm 20 μl dung dịch hiệu chuẩn (4.10) vài lần và xác định chiều cao (diện tích) pic trung bình của diclazuril và pic chất chuẩn nội.

8.3.3. Dung dịch mẫu

Bơm 20 μl dung dịch mẫu (8.2.1 hoặc 8.2.1) vài lần và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của pic diclazuril và pic chất chuẩn nội.

9. Tính kết quả

9.1. Thức ăn chăn nuôi

Hàm lượng diclazuril trong mẫu thử, w (mg/kg), được tính theo công thức sau:

Trong đó:

h_d,s  là chiều cao (diện tích) pic của diclazuril trong dung dịch mẫu (8.2.1);

h_i,s  là chiều cao (diện tích) pic của chất chuẩn nội trong dung dịch mẫu thử (8.2.1);

h_d,c là chiều cao (diện tích) pic của diclazuril trong dung dịch hiệu chuẩn (4.10);

h_i,c là chiều cao (diện tích) pic của chất chuẩn nội trong dung dịch hiệu chuẩn (4.10);

c_d,c là nồng độ diclazuril trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);

m  là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V  là thể tích của dịch chiết mẫu theo 8.2.1 (trường hợp này là 2,5 ml).

9.2. Premix

Hàm lượng diclazuril trong mẫu thử, w(mg/kg), được tính theo công thức sau:

Trong đó:

h_d,c là chiều cao (diện tích) pic của diclazuril trong dung dịch hiệu chuẩn (4.10);

h_i,c là chiều cao (diện tích) pic của chất chuẩn nội trong dung dịch hiệu chuẩn (4.10);

h_d,s  là chiều cao (diện tích) pic của diclazuril trong dung dịch mẫu (8.2.2);

h_i,s  là chiều cao (diện tích) pic của chất chuẩn nội trong dung dịch mẫu thử (8.2.2);

c_d,c  là nồng độ diclazuril trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (3.10);

m  là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V  là thể tích của dịch chiết mẫu theo 8.2.2 (trường hợp này là 25 ml);

p là hàm lượng danh định của diclazuril trong premix, tính bằng millgam trên kilogam (mg/kg).

10. Đánh giá xác nhận kết quả

10.1. Nhận biết

Việc nhận biết chất phân tích có thể được khẳng định bằng đồng sắc kí hoặc sử dụng detector mảng diot để so sánh phổ đồ của dịch chiết mẫu (8.2.1 hoặc 8.2.2) và của dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3).

10.1.1. Đồng sắc kí

Bổ sung một thể tích thích hợp dung dịch hiệu chuẩn (4.10) vào dịch chiết mẫu (8.2.1 hoặc 8.2.2). Lượng dicrazuril bổ sung phải xấp xỉ lượng dicrazuril dự kiến tìm thấy trong dịch chiết mẫu.

Chỉ có chiều cao pic dicrazuril và pic chất chuẩn nội tăng sau khi tính cả lượng bổ sung và độ pha loãng của dịch chiết. Sai khác về chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao phải nằm trong phạm vi ± 10 % chiều rộng ban đầu của pic diclazuril hoặc pic chất chuẩn nội trong dịch chiết mẫu không thêm chuẩn.

10.1.2. Detector mảng diot

Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau:

a) tại bước sóng tương ứng với độ hấp thụ cực đại, phổ đồ của mẫu và của chất chuẩn, được ghi lại ở đỉnh cao nhất trên sắc kí đồ, phải giống nhau trong một biên độ được xác định bằng khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diot, biên độ đặc trưng là ± 2 nm;

b) tại bước sóng từ 230 nm đến 320 nm, phổ đồ của mẫu và của chất chuẩn được ghi lại ở đỉnh cao nhất trên sắc kí đồ không được khác với các phần phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của chất phân tích chuẩn;

c) tại bước sóng từ 230 nm đến 320 nm, phổ đồ của điểm uốn lên, đỉnh cao nhất và điểm uốn xuống của pic chất phân tích không được khác với các phần phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ tương ứng với phổ đồ của đỉnh cao nhất.

Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng thì không xác nhận được sự có mặt của chất phân tích trong mẫu.

11. Độ lặp lại và độ thu hồi

11.1. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá:

– 30 % giá trị cao hơn (trong hai kết quả của hai phép xác định nêu trên), khi hàm lượng diclazuril từ 0,5 mg/kg đến 2,5 mg/kg;

– 0,75 mg/kg, khi hàm lượng diclazuril từ 2,5 mg/kg đến 5 mg/kg;

– 15 % giá trị cao hơn, khi hàm lượng diclaztiril lớn hơn 5 mg/kg.

11.2. Độ thu hồi

Đối với các mẫu thức ăn chăn nuôi (mẫu trắng) được thêm chuẩn, độ thu hồi ít nhất là 80 %.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác

Một nghiên cứu cộng tác đã được tổ chức thực hiện trên năm mẫu phân tích được phân tích bởi 11 phòng thí nghiệm. Các mẫu này gồm có hai mẫu premix; một mẫu được trộn với chất hữu cơ (O 100) và một mẫu khác được trộn với chất vô cơ (A 100). Hàm lượng diclazuril lý thuyết là 100 mg/kg. Ba mẫu thức ăn hỗn hợp cho chim được thực hiện bằng ba quy trình khác nhau (NL) (L1/Z1/K1). Hàm lượng diclazuril lý thuyết là 1 mg/kg. Các phòng thí nghiệm thực hiện phân tích từng mẫu một hoặc phép thử lặp lại.

Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 – Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác