TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10929:2015 (EN 15891:2010) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH DEOXYNIVALENOL TRONG NGŨ CỐC, SẢN PHẨM NGŨ CỐC VÀ THỰC PHẨM TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR UV VÀ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10929:2015

EN 15891:2010

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH DEOXYNIVALENOL TRONG NGŨ CỐC, SẢN PHẨM CỐC NGŨ VÀ THỰC PHẨM TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR UV VÀ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM

Foodstuffs – Determination of deoxynivalenol in cereals, cereal products and cereal based foods for infants and young children – HPLC method with immunoaffinity column cleanup and UV detection

Lời nói đầu

TCVN 10929:2015 hoàn toàn tương đương EN 15891:2010;

TCVN 10929:2015 do Ban Kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn; Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH DEOXYNIVALENOL TRONG NGŨ CỐC, SẢN PHẨM CỐC NGŨ VÀ THỰC PHẨM TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR UV VÀ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM

Foodstuffs – Determination of deoxynivalenol in cereals, cereal products and cereal based foods for infants and young children – HPLC method with immunoaffinity column cleanup and UV detection

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định deoxynivalenol (DON) trong ngũ cốc (hạt và bột), thực phẩm từ ngũ cốc và thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector UV và làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm.

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong ba nghiên cứu liên phòng thử nghiệm. Nghiên cứu thứ nhất đã phân tích mẫu lúa mì, bột gạo, bột lúa mạch, ngô, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì với DON trong dải từ 85,4 µg/kg đến 1 768 µg/kg, nghiên cứu thứ hai đã phân tích lúa mì và ngô với DON trong dải từ 165 µg/kg đến 4 700 µg/kg và nghiên cứu thứ ba đã tiến hành phân tích thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ với DON trong dải từ 58 µg/kg đến 452 µg/kg.

Thông tin về việc đánh giá xác nhận nêu trong Điều 9 và Phụ lục B.

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

Deoxynivalenol được chiết ra khỏi mẫu bằng nước. Dịch chiết được làm sạch trên cột ái lực miễn nhiễm để loại bỏ tạp chất. Deoxynivalenol sau đó được định lượng bằng HPLC với detector UV.

4  Thuốc thử

4.1  Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đạt loại 1 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), trừ khi có qui định khác. Dung môi phải đạt chất lượng cho phép phân tích HPLC. Có thể sử dụng các dung dịch có bán sẵn có các đặc tính tương đương với các loại được liệt kê dưới đây.

4.2  Dinatri hydro phosphat, Na₂HPO₄, dạng khan hoặc dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na₂HPO₄.12 H₂O).

4.3  Kali clorua, KCl

4.4  Kali dihydro phosphat, KH₂PO₄

4.5  Natri clorua, NaCl

4.6  Natri hydroxit, NaOH

4.7  Dung dịch axit clohydric, w(HCl) = 37 % phần khối lượng trong nước

4.8  Dung dịch axit clohydric, c(HCl) = 0,1 mol/l

Pha loãng 8,28 ml dung dịch axit clohydric (4.7) bằng nước đến 1 lít.

4.9  Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l

Hòa tan 4 g natri hydroxit (4.6) trong 1 lít nước.

4.10  Dung dịch muối đậm phosphat (PBS), c(NaCl) = 120 mmol/l, c(KCl) = 2,7 mmol/l, c(đệm phosphat) = 10 mmol/l, pH = 7,4

Hòa tan 8,0 g natri hydroxit (4.5), 1,2 g dinatri hydro phosphat khan hoặc 2,9 g Na₂HPO₄·12 H₂O (4.2), 0,2 g kali dihydro phosphat (4.4) và 0,2 g kali clorua (4.3) trong 900 ml nước.

Sau khi hòa tan, chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch axit clohydric (4.8) hoặc dung dịch natri hydroxit (4.9), sau đó pha loãng bằng nước đến 1 lít. Cách khác, có thể chuẩn bị dung dịch PBS có các đặc tính tương tự từ các vật liệu PBS bán sẵn.

4.11  Axetonitril

CẢNH BÁO – Axetonitril là chất độc và khi trộn mẫu phải dùng máy nghiền trộn chống nổ đặt trong tủ hút. Sau khi trộn, mẫu phải được lọc bên trong tủ hút.

4.12  Polyetylen glycol (PEG), có khối lượng phân tử xấp xỉ 8 000 g/mol

4.13  Metanol

4.14  Axit axetic, 96 % phần khối lượng hoặc axit axetic băng, 100 % phần khối lượng

4.15  Dịch pha loãng dùng cho phân tích HPLC

Trộn 9,5 phần thể tích metanol (4.13) với 90,5 phần thể tích nước.

4.16  Pha động HPLC

Trộn 15 phần thể tích metanol (4.13) với 85 phần thể tích nước. Thêm 0,1 phần thể tích axit axetic (4.14). Lượng chính xác metanol được sử dụng và việc sử dụng axit axetic phụ thuộc vào cột HPLC được chọn để phân tích và phải điều chỉnh, nếu cần. Khử khí dung dịch trước khi sử dụng.

4.17  Dung môi rửa

Trộn 50 phần thể tích metanol (4.13) với 50 phần thể tích nước.

4.18  Cột ái lực miễn nhiễm (IA)

Cột ái lực miễn nhiễm phải chứa các kháng thể đặc hiệu đối với DON. Cột phải có khả năng giữ không nhỏ hơn 1 000 ng DON và có độ thu hồi không nhỏ hơn 85 % khi dùng 500 ng DON trong 1 ml đến 2 ml nước.

4.19  Deoxynivalenol, có độ tinh khiết không nhỏ hơn 97 % phần khối lượng

CẢNH BÁO – Deoxynivalenol là chất có tính độc cao. Phải đeo găng tay và kính an toàn vào mọi lúc và phải tiến hành tất cả các giai đoạn chuẩn bị mẫu và chuẩn bị các chất chuẩn trong tủ hút.

4.20  Dung dịch gốc deoxynivalenol 1, nồng độ khối lượng ρ ≈ 1,25 mg/ml

Cho 4,0 ml axetonitril (4.11) vào khoảng 5 mg deoxynivalenol (4.19) để tạo thành dung dịch có nồng độ khoảng 1,25 mg/ml. Cách khác, có thể sử dụng dung dịch bán sẵn có các đặc tính tương đương.

Bảo quản dung dịch này trong tủ đông lạnh ở nhiệt độ khoảng -18 °C. Dung dịch được bảo quản bằng cách này có thể bền được trong 12 tháng. Cứ sau sáu tháng thì cần kiểm tra lại nồng độ của dung dịch.

4.21  Dung dịch gốc deoxynivalenol 2, ρ ≈ 250 µg/ml

Pha loãng 800 µl dung dịch gốc 1 (4.20) đến 4 ml bằng axetonitril (4.11) để tạo thành dung dịch có nồng độ khoảng 250 µg/ml.

Bảo quản dung dịch này trong tủ đông lạnh ở nhiệt độ khoảng -18 °C. Dung dịch được bảo quản bằng cách này có thể bền được trong 12 tháng. Cứ sau sáu tháng thì cần kiểm tra lại nồng độ của dung dịch.

4.22  Dung dịch chuẩn deoxynivalenol A

Pha loãng 200 µl dung dịch gốc 2 (4.21) đến 2,0 ml bằng axetonitril (4.11) để tạo thành dung dịch có nồng độ khoảng 25 µg/ml.

Để xác định chính xác nồng độ khối lượng, ghi lại đường hấp thụ giữa bước sóng 200 nm đến 270 nm, ví dụ: các bước cách nhau 5 nm; trong máy đo quang phổ (5.16) so với axetonitril. Nhận biết bước sóng có độ hấp thụ cực đại và tính nồng độ khối lượng của deoxynivalenol, ρ_DON, tính bằng microgam trên mililit, theo Công thức (1):

Trong đó:

A_max là độ hấp thụ cực đại xác định được trên đường hấp thụ (bước sóng ở đây là: 220 nm)

M là khối lượng mol của deoxynivalenol (M = 296,3 g/mol), tính bằng gam trên mol (g/mol).

ε là hệ số hấp thụ mol của deoxynlvalenol trong axetonitril (4.11) (ở đây là: 681 m²/mol, xem [1]);

b là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng xentimet (cm).

Tính nồng độ khối lượng của dung dịch gốc 2 (4.21), ρ_DON2, tính bằng microgam trên mililit, theo Công thức (2):

Bảo quản dung dịch này trong tủ đông lạnh ở nhiệt độ khoảng -18 °C. Dung dịch được bảo quản bằng cách này có thể bền được trong 12 tháng. Cứ sau sáu tháng thì cần kiểm tra lại nồng độ của dung dịch.

CHÚ THÍCH: Có thể tiến hành việc chuẩn bị dung dịch chuẩn bằng cách cân chính xác chất chuẩn deoxynivalenol và dung môi được dùng để hòa tan chất chuẩn này.

4.23  Dung dịch thêm chuẩn deoxynivalenol, ρ = 100 µg/ml

Dùng pipet lấy một lượng dung dịch gốc 2 (4.21) tương đương với 500 µg deoxynivalenol cho vào bình định mức 5 ml. Pha loãng đến vạch bằng axetonitril (4.11).

Bảo quản dung dịch này trong tủ đông lạnh ở nhiệt độ khoảng -18 °C. Dung dịch được bảo quản bằng cách này có thể bền được trong 12 tháng. Cứ sau sáu tháng thì cần kiểm tra lại nồng độ của dung dịch.

4.24  Dung dịch chuẩn deoxynivalenol B

Dùng pipet lấy 500 µl dung dịch thêm chuẩn (4.23) cho vào bình định mức 5 ml. Pha loãng bằng axetonitril (4.11) đến vạch.

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng – 18 °C. Dung dịch được bảo quản bằng cách này có thể bền được trong 12 tháng. Cứ sau sáu tháng thì cần kiểm tra lại nồng độ của dung dịch.

5  Thiết bị, dụng cụ

5.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị và dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

5 2  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 1 g.

5.3  Cân phòng thử nghiệm, có thể cân chính xác đến 0,1 g.

5.4  Máy trộn tốc độ cao hoặc máy đồng hóa.

5.5  Máy lắc phòng thử nghiệm hoặc máy khuấy từ, có thể điều chỉnh tốc độ đến khoảng 500 min^-1.

5.6  Máy trộn Vortex, hoặc tương đương.

5.7  Máy ly tâm, có khả năng ly tâm với lực ly tâm là 2 500 g.

5.8  Ống ly tâm, dung tích 250 ml.

5.9  Giấy lọc, định tính, dai, chảy nhanh, gấp nếp và có đường kính 18,5 cm.

5.10  Giấy lọc sợi thủy tinh, chảy nhanh, xốp, cỡ lỗ 1,6 µm hoặc nhỏ hơn.

5.11  Pipet, dung tích 10 ml, 5 ml, 1 ml và 25 µl đến 250 µl.

5.12  Bình chứa dùng cho cột ái lực miễn nhiễm, ví dụ: dung tích 20 ml, có bộ nối thích hợp.

5.13  Lọ thủy tinh nhỏ hoặc ống phân tích, có các kích cỡ khác nhau.

5.14  Bộ gia nhiệt hoặc nồi cách thủy ổn nhiệt, có thể duy trì khoảng 50 °C.

5.15  Thiết bị HPLC, gồm các bộ phận sau:

5.15.1  Hệ thống bơm mẫu, có thể bơm ví dụ: 100 µl đến 300 µl.

5.15.2  Bơm pha động, không xung, có thể duy trì tốc độ dòng 1 ml/min.

5.15.3  Cột HPLC phân tích pha đảo, ví dụ: C18, octadecyl silan (ODS), dài 15 cm đến 25 cm, đường kính trong 4,6 mm và kích cỡ hạt 5 µm, cột này phải đảm bảo phân giải deoxynivalenol ra khỏi các pic khác.

Mức độ tối đa các pic chồng lên nhau phải nhỏ hơn 10 %. Nếu cần, chỉnh pha động để đường nền đủ độ phân giải. Có thể sử dụng cột bảo vệ pha đảo tương ứng phù hợp.

5.15.4  Detector UV, cài đặt ở bước sóng 220 nm.

5.15.5  Bộ ghi, máy tích phân hoặc máy tính có hệ thống xử lý dữ liệu

5.15.6  Bộ chuyển mạch pha động, hoặc bơm HPLC thứ hai, nếu cần.

5.16  Máy đo quang phổ UV.

6  Cách tiến hành

6.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này đã được đánh giá trong ba nghiên cứu liên phòng thử nghiệm. Các nghiên cứu này đã được tiến hành trong các phòng thử nghiệm khác nhau ở các thời điểm khác nhau. Do vậy, các qui trình sử dụng này có khác đôi chút về quá trình chiết và làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm đối với lúa mì, bột gạo, bột lúa mạch, ngô, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì (được mô tả trong 6.2 và 6.4) và đối với thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (được mô tả trong 6.3 và 6.5). Các qui trình mô tả ở đây giống với một trong những qui trình được mô tả trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm gốc.

6.2  Chiết lúa mì, bột gạo, bột lúa mạch, ngô, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì

Cân 25 g (m_s) phần mẫu thử và 5 g PEG (4.12), chính xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm (5.8). Thêm 200 ml nước (V₁) (hoặc một lượng khác theo qui định tử nhà sản xuất cột IA) và đồng hóa ở tốc độ cao trong 3 min sử dụng máy đồng hóa (5.4). Có thể, sử dụng các qui trình chiết khác cho các kết quả tương đương. Lắc đồng thời mẫu và dung môi chiết trên máy lắc 2 h hoặc cho que khuấy từ vào bình đậy nắp và đặt vào máy khuấy từ (5.5) để trộn ở tốc độ trung bình-cao trong 30 min. Trong cả hai trường hợp, nên lắc mạnh mẫu cùng với thuốc thử bằng tay để đảm bảo trộn kỹ trước khi đặt vào máy lắc. Ly tâm mẫu đã đồng hóa trong 15 min ở 2 500 g. Sau khi ly tâm, lọc mẫu bằng giấy lọc sợi thủy tinh (5.10).

CHÚ THÍCH Trong nghiên cứu đánh giá xác nhận đã cho thấy rằng một số nền mẫu (ngô) đã được chiết trên máy khuấy từ không cần phải ly tâm.

6.3  Chiết mẫu thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Cân 25 g mẫu thử (m_s), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 250 ml hoặc 500 ml. Thêm 200 ml nước (V₁), đậy nắp và lắc trong 1 h trong máy lắc phòng thử nghiệm (5.5). Để mẫu ổn định sau khi lắc và chuyển 50 ml dịch huyền phù vào ống ly tâm (5.8) và ly tâm 15 min ở 2 500 g.

Chuẩn bị phễu và giấy lọc (5.9). Rót mẫu đã chiết sau khi ly tâm vào bình nón 250 ml hoặc 500 ml qua phễu và giấy lọc đã chuẩn bị.

6.4  Làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm đối với lúa mì, bột gạo, bột lúa mạch, ngô, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì

Chuẩn bị cột IA và tiến hành qui trình làm sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị. Chuyển 2,0 ml (V₃) dịch chiết lỏng đã lọc (6.2) sang cột ái lực miễn nhiễm (4.18). Cho dịch chiết chảy hết qua cột ở tốc độ khoảng một giọt trên giây. Rửa cột bằng 5 ml nước hoặc PBS (4.10). Làm khô cột bằng cách thổi không khí qua. Dùng pipet chuyển 2 ml axetonitril (4.11) hoặc metanol (4.13), theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cho vào bình chứa của cột. Để dung môi rửa giải chảy chậm qua cột. Khóa dòng chảy, sau đó đợi 1 min trước khi rửa giải deoxynivalenol ra khỏi cột ở tốc độ một giọt trên giây và thu vào bình nhỏ 4 ml hoặc ống phân tích (5.13). Cẩn thận cho không khí đi qua cột để thu lấy các giọt cuối cùng.

CHÚ THÍCH: Cần tiến hành cẩn thận không để vượt quá dung tích của cột ái lực miễn nhiễm.

6.5  Làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm đối với thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Chuẩn bị cột IA và tiến hành qui trình làm sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị. Chuyển 10 ml (V₃) pha nước (6.3) vào bình chứa (5.12) của cột ái lực miễn nhiễm (4.18). Để dung dịch tự chảy qua cột ở tốc độ khoảng một giọt trên giây. Khi dịch chiết chảy hết qua cột ái lực miễn nhiễm, cho 5 ml nước hoặc PBS (4.10) chảy qua cột. Làm khô cột bằng cách đẩy khí nitơ qua cột trong khoảng 5 s. Sau đó loại bỏ hết dung môi của qui trình làm sạch. Cuối cùng, đặt lọ nhỏ dung tích 2,0 ml đến 2,5 ml (5.13) dưới cột và cho 0,5 ml metanol (4.13) chảy qua cột, thu lấy dịch rửa giải. Để metanol còn lại trên cột xấp xỉ 1 min trước khi cho chảy nốt. Sau đó, thêm tiếp 1,0 ml metanol và tiếp tục thu lấy dịch rửa giải. Thổi cẩn thận không khí qua cột để thu lấy các giọt dung môi cuối cùng.

CHÚ THÍCH: Phương pháp nạp lên cột IA, rửa và rửa giải có khác nhau đôi chút giữa các nhà sản xuất cột và các hướng dẫn cụ thể về việc sử dụng cột phải kèm theo độ chính xác. Nhìn chung, để xác định dexynivalenol, qui trình bao gồm chiết mẫu bằng nước, ly tâm, lọc, nạp mẫu lên cột có thể đã được rửa trước, rửa cột bằng nước cất hoặc (dung dịch muối đệm phosphat PBS) và rửa giải deoxynivalenol bằng metanol hoặc axetonitril. Tiến hành cẩn thận tránh để vượt quá thể tích nạp tối đa hoặc dung tích của cột.

6.6  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Đặt lọ nhỏ vào bộ gia nhiệt hoặc nồi cách thủy ổn nhiệt (5.14) và cho bay hơi dưới dòng nitơ ở nhiệt độ không quá 50 °C. Hòa tan lại phần cặn ở nhiệt độ môi trường bằng 0,5 ml chất pha loãng HPLC (4.15) hoặc pha động (4.16). Trộn kỹ để đảm bảo phần cặn hòa tan lại hết bằng cách lắc ít nhất 30 s, ví dụ bằng máy trộn Vortex (5.6).

CHÚ THÍCH 1: Nếu cần, có thể lọc mẫu trước khi phân tích bằng HPLC. Tiến hành kiểm tra bằng dung dịch chuẩn để đánh giá sự thất thoát của deoxynivalenol trong bước lọc này.

CHÚ THÍCH 2: Sau khi bay hơi, có thể bảo quản phần cặn một tuần ở (4 ± 2) ºC tránh ánh sáng.

6.7  Qui trình thêm chuẩn

Để xác định độ thu hồi, tiến hành qui trình thêm chuẩn sử dụng dung dịch thêm chuẩn (4.23). Mức thêm chuẩn phải nằm trong dải hiệu chuẩn (tốt nhất là ở giữa dải). Cho dung dịch thêm chuẩn vào phần mẫu thử đã biết không chứa deoxynivalenol và để ổn định trong 30 min trước khi thêm dung môi chiết.

7  Phân tích HPLC

7.1  Điều kiện vận hành HPLC

Sử dụng thiết bị qui định trong 5.15 và cột qui định trong 5.15.3 theo các điều kiện chứng minh cho việc tách tốt, xem Hình A.1. Lượng chính xác của dịch chiết metanol sử dụng trong pha động và axit axetic sẽ phụ thuộc vào cột HPLC được chọn để phân tích và phải được điều chỉnh nếu cần, để tách tốt deoxynivalenol.

– Tốc độ dòng pha động (cột): 1,0 ml/min;

– Bước sóng detector UV: 220 nm;

– Thể tích bơm: 100 µl đến 300 µl.

Sử dụng bộ chuyển mạch pha động (5.15.6), qui trình pha động được cài đặt như trong Bảng 1:

Bảng 1 – Qui trình pha động

Sử dụng các điều kiện HPLC ở trên, deoxynivalenol thường rửa giải với thời gian lưu khoảng 11 min, xem Hình A.1

CHÚ THÍCH: Pha động được chuẩn bị bằng axetonitril và nước. Sử dụng pha động này có thể đạt được hiệu quả tách tốt.

7.2  Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn HPLC

Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn từ dung dịch chuẩn B (4.24). Đối với thực hành chuẩn, cho bay hơi lượng dung dịch chuẩn B trong bình định mức 10 ml phù hợp với Bảng 2 và Bảng 3. Đổ đầy đến vạch bằng dung môi pha loãng HPLC (4.15) hoặc pha động (4.16).

Bảng 2 – Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn HPLC đối với lúa mì, bột gạo, bột lúa mạch, ngô, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì

Bảng 3 – Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn HPLC đối với thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

7.3  Dựng đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách bơm một lượng từ 100 µl đến 300 µl các dung dịch hiệu chuẩn (7.2), ở nồng độ thích hợp khác nhau, vào máy sắc ký ở thời điểm bắt đầu của ngày phân tích. Dựng đường chuẩn trước khi phân tích mẫu thử bằng cách dựng đồ thị nồng độ deoxynivalenol, tính bằng nanogam trên mililit, trên trục X dựa theo tín hiệu pic hoặc chiều cao trên trục Y và kiểm tra đồ thị tuyến tính sử dụng hồi qui tuyến tính (r² ≥ 0,998).

7.4  Xác định deoxynivalenol trong dung dịch thử

Bơm các lượng từ 100 µl đến 300 µl dung dịch mẫu thử (6.6) vào máy sắc ký, sử dụng trong cùng điều kiện đã dùng để dựng đường chuẩn.

7.5  Nhận biết pic

Nhận biết pic deoxynivalenol trong dung dịch mẫu thử bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của chuẩn HPLC gần nhất được bơm vào trong quá trình chạy HPLC. Nồng độ deoxynivalenol trong dung dịch mẫu thử phải nằm trong dải hiệu chuẩn. Nếu mức deoxynivalenol trong dung dịch mẫu thử vượt quá nồng độ khối lượng của dung dịch chuẩn cao nhất thì pha loãng mẫu chiết bằng dung môi HPLC hoặc pha động để có mức deoxynivalenol nằm trong dải hiệu chuẩn và phân tích lại. Hệ số pha loãng phải được đưa vào trong các phép tính tiếp theo.

8  Tính kết quả

Xác định nồng độ deoxynivalenol trong dung dịch mẫu thử (6.6) trực tiếp từ đường chuẩn (7.3) tính bằng nanogam trên mililit. Tính phần khối lượng deoxynivalenol, w_DON, bằng microgam trên kilogam, theo Công thức (3):

Trong đó:

ρ_DON là nồng độ của deoxynivalenol trong phần lỏng của dung dịch thử thu được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V₁ là thể tích của dung môi dùng để chiết trong 6.2 hoặc 6.3, tính bằng mililit (trong trường hợp này là: 200 ml).

V₂ là thể tích cuối cùng của dung dịch thử trong 6.6, tính bằng mililit (ml) (trong trường hợp này là: 0,5 ml);

V₃ là thể tích của dịch chiết sử dụng để làm sạch cột ái lực miễn nhiễm, tính bằng mililit (ml) (trong trường hợp này là: 2,0 ml trong 6.4 và 10 ml trong 6.5);

m_s là khối lượng của mẫu chiết được lấy để phân tích, tính bằng gam (g) (trong trường hợp này là: 25 g).

Báo cáo kết quả đến ba chữ số thập phân.

VÍ DỤ

ρ_DON 545 ng/ml,

V₁ 200 ml.

V₂ 0,5 ml

V₃ 2,0 ml

m_s 25,0 g

9  Độ chụm

9.1  Yêu cầu chung

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp trên lúa mì, bột gạo, bột lúa mạch, ngô, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì được nêu trong [2] và [3]. Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp đối với thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nêu trong [4]. Dữ liệu về độ chụm nêu trong Phụ lục A và Phụ lục B. Các giá trị thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và/hoặc nền mẫu khác với các dải nồng độ và/hoặc nền mẫu đã nêu.

9.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Sử dụng qui trình chiết nêu trong 6.2 và qui trình làm sạch nêu trong 6.4:

Các giá trị đối với bột lúa mạch là:	= 1 768 µg/kg	r = 153,8 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với bột gạo là:	= 458 µg/kg	r = 83,6 µg/kg	(thêm chuẩn)
	= 85 µg/kg	r = 33,7 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với bột lúa mì là:	= 678 µg/kg	r = 113,7 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với cháo ngô là:	= 123 µg/kg	r = 22,1 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với ngũ cốc ăn sáng là:	= 217 µg/kg	r = 80,6 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với lúa mì là:	= 165 µg/kg	r = 95 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 1 466 µg/kg	r = 197,1 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 4 612 µg/kg	r = 579,2 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với ngô là:	= 501 µg/kg	r = 145,6 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 2 763 µg/kg	r = 274,5 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 4 712 µg/kg	r = 480,8 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)

Sử dụng qui trình chiết nêu trong 6.3 và qui trình làm sạch nêu trong 6.5:

Các giá trị đối với thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ là:

 = 115 µg/kg  r = 24,2 µg/kg (thêm chuẩn)

 = 212 µg/kg  r = 83,0 µg/kg (thêm chuẩn)

 = 58 µg/kg  r = 22,8 µg/kg (bị nhiễm tự nhiên)

 = 115 µg/kg  r = 20,5 µg/kg (bị nhiễm tự nhiên)

 = 452 µg/kg  r = 103,0 µg/kg (bị nhiễm tự nhiên)

9.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

Sử dụng qui trình chiết nêu trong 6.2 và qui trình làm sạch nêu trong 6.4:

Các giá trị đối với bột lúa mạch là:	= 1 768 µg/kg	R = 685,3 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với bột gạo là:	= 458 µg/kg	R = 146,9 µg/kg	(thêm chuẩn)
	= 85 µg/kg	R = 35,5 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với bột lúa mì là:	= 678 µg/kg	R = 309,3 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với cháo ngô là:	= 123 µg/kg	R = 79,6 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với ngũ cốc ăn sáng là:	= 217 µg/kg	R = 160 µg/kg	(thêm chuẩn)
Các giá trị đối với lúa mì là:	= 165 µg/kg	R = 177,4 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 1 466 µg/kg	R = 844,7 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 4 612 µg/kg	R = 3 881,3 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
Các giá trị đối với ngô là:	= 501 µg/kg	R = 315,8 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 2 763 µg/kg	R = 1 834,6 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 4712 µg/kg	R = 2 700,9 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
Sử dụng qui trình chiết nêu trong 6.3 và qui trình làm sạch nêu trong 6.5:
Các giá trị đối với thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ là:
	= 115 µg/kg	R = 40,9 µg/kg	(thêm chuẩn)
	= 212 µg/kg	R = 119,0 µg/kg	(thêm chuẩn)
	= 58 µg/kg	R = 24,7 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 115 µg/kg	R = 30,2 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)
	= 452 µg/kg	R = 133,9 µg/kg	(bị nhiễm tự nhiên)

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và kiểu quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;

g) các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Sắc ký đồ điển hình

CHÚ DẪN

x  thời gian, tính bằng phút (min)

y  tín hiệu UV, tính bằng milivol (mV)

1  deoxynivalenol.

Hình A.1 – Sắc ký đồ điển hình của mẫu bột mì bị nhiễm tự nhiên ở nồng độ khoảng 900 µg/kg

Phụ lục B

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các thông số trong Bảng B.1, đối với bột lúa mạch, bột gạo, bột lúa mì, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì, thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm [2] phù hợp với Hướng dẫn của AOAC về các qui trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá các đặc tính của phương pháp phân tích [5]. Dữ liệu về lúa mì và ngô thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm do BIPEA tổ chức vào tháng 5/2004 [3].

Dữ liệu đưa ra trong Bảng B.2 thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm [4] phù hợp với Hướng dẫn của AOAC về các qui trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá các đặc tính của phương pháp phân tích [5].

Bảng B.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với bột lúa mạch, bột gạo, lúa mì, bột lúa mì, ngô, cháo ngô và ngũ cốc ăn sáng từ lúa mì

Mẫu	Bột lúa mạch n.c.a	Bột gạo 1 f.a	Bột gạo 2 f.a	Bột lúa mì f.a	Cháo ngô f.a	Ngũ cốc ăn sáng f.a	Lúa mì 1 n.c.a	Lúa mì 2 n.c.a	Lúa mì 3 n.c.a	Ngô 1 n.c.a	Ngô 2 n.c.a	Ngô 3 n.c.a
Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm	2003	2003	2003	2003	2003	2003	2004	2004	2004	2004	2004	2004
Số lượng phòng thử nghiệm	13	13	13	13	13	13
Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	10	11	10	12	11	12	16	16	17	16	16	17
Số phòng thử nghiệm ngoại lệ	2	1	2	2	1	1
Số lượng các kết quả được chấp nhận	10	11	10	12	11	12	16	16	17	17	16	17
Giá trị trung bình, , µg/kg	1 768	458	85	678	123	217	165	1 466	4 612	501	2 763	4 712
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, µg/kg	54,92	29,87	12,04	40,62	7,88	28,77	34,3	71,1	209	52,5	99	173,4
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %	3,1	6,5	14,1	6,0	6,4	13,2	21	5	5	10	4	4
Giới hạn lặp lại, r [r = 2,8 x sr], µg/kg	153,8	83,6	33,7	113,7	22,1	80,6	95	197,1	579,2	145,6	274,5	480,8
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, µg/kg	244,8	52,5	12,7	110,5	28,4	57,1	64	304,7	1 400,2	113,9	661,9	974,4
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR,%	13,8	11,5	14,8	16,3	23,1	26,3	39	21	30	23	24	21
Giới hạn tái lập, R [R = 2,8 x sR], µg/kg	685,3	146,9	35,5	309,3	79,6	160,0	177,4	844,7	3 881,3	315,8	1 834,6	2 700,9
Độ thu hồi, % b	81	86	n.a.a	81	86	86	n.a.a	n.a.a	n.a.a	n.a.a	n.a.a	n.a.a
Chỉ số HotRat, phù hợp với [6]	0,9	0,6	0,6	1,0	1,1	1,3	1.9	1,4	2,4	1,3	1,8	1,7
Chỉ số HorRat, phù hợp với [7]	0,9	0,6	0,7	1,0	1,1	1,3	1,9	1,4	2,4	1,3	1,8	1,7
a n.c. bị nhiễm tự nhiên, f. là có tăng cường và n.a. không thể áp dụng được. b Các giá trị độ thu hồi thu được độc lập theo từng phòng thử nghiệm tham gia trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm tiến hành phân tích mẫu được thêm chuẩn đơn lẻ của từng mẫu nền (1 000 µg/kg).

Bảng B.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Mẫu	Thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ
	f. a	f. a	n.c. a	n.c. a	n.c. a	n.c. a
Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm	2005	2005	2005	2005	2005	2005
Số lượng phòng thử nghiệm	12	14	14	11	12	14
Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	11	13	14	11	10	13
Số phòng thử nghiệm ngoại lệ	1	1	0	0	2	1
Số lượng các kết quả được chấp nhận	11	13	14	11	10	13
Giá trị trung bình, , µg/kg	115	212	< 6	58	115	452
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, µg/kg	8,6	29,6	n.a. a	8,2	7,3	36,7
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %	7,5	14,0	n.a. a	14,0	6,4	8,1
Giới hạn lặp lại, r [r = 2,8 x sr], µg/kg	24,2	83,0	n.a. a	22,8	20,5	103,0
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, µg/kg	14,6	42,5	n.a. a	8,8	10,8	47,8
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %	12,7	20,1	n.a. a	15,2	9,4	10,6
Giới hạn tái lập, R [R = 2,8 x sR], µg/kg	40,9	119,0	n.a. a	24,7	30,2	133,9
Độ thu hồi, %	89	85	n.a. a	n.a. a	n.a. a	n.a. a
Chỉ số HorRat, phù hợp với [6]	0,6	1,0	n.a. a	0,6	0,4	0,6
Chỉ số HorRat, phù hợp với [7]	0,7	1,0	n.a. a	0,7	0,4	0,6
a f. là có thêm chuẩn, n.c. bị nhiễm tự nhiên và n.a. không áp dụng.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Krska R., Schubert-Ullrich P., Josephs R.D., Emteborg H., ButtingerG., Petterson H., Van Egmond H.P., Schothorst R.C., MacDonald S. and Chan D., 2007, Determination of molar absorptivity coefficients for major type-B trichothecenes and certification of calibrators for deoxynivalenol and nivalenol, Anal. Bioanal. Chem, 388, 1215-1226

[2] MacDonald S.J., Chan D., Brereton P., Damant A. and Wood R., 2005, Determination of Deoxynivalenol in Cereals and Cereal Products by Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography: Interlaboratory Study, Journal of AOAC International, 88, 1197-1204

[3] IRTAC – BIPEA – Rapport de comparaisons inter laboratoires – Mars 2004 N° 002

[4] Stroka J., Derbyshire M., Mischke C., Ambrosio M., Kroeger K., Arranz I., Sizoo E. and Van Egmond H.P., 2006, Liquid Chromatographic Determination of Deoxynivalenol in Baby Food and Animal Feed: Interiaboratory Study, Journal of AOAC International, 89, 1012-1020

[5] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, Associate Referee’s Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, 23-51

[6] Horwitz, W. and Albert, R., 2006, The Horwitz Ratio (HorRat): A Useful Index of Method Performance with Respect to Precision, Journal of AOAC International, 89, 1095-1109

[7] Thompson, M., 2000, Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst, 125, 385-386