TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10990:2015 (ISO 13495:2013) VỀ THỰC PHẨM – NGUYÊN TẮC LỰA CHỌN VÀ TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ XÁC NHẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN BIẾT GIỐNG SỬ DỤNG AXIT NUCLEIC ĐẶC THÙ

Hiệu lực: Còn hiệu lực Ngày có hiệu lực: 31/12/2015

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10990:2015

ISO 13495:2013

THỰC PHẨM – NGUYÊN TẮC LỰA CHỌN VÀ TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ XÁC NHẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN BIẾT GIỐNG SỬ DỤNG AXIT NUCLEIC ĐẶC THÙ

Foodstuffs – priciples of selection and criteria of validation for varietal identification methods using specific nucleic acid

Lời nói đầu

TCVN 10990:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 13495:2013;

TCVN 10990:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn được thiết kế để hỗ trợ việc ra quyết đnh và đánh giá xác nhận các nguyên tắc được sử dụng đ thu được dữ liệu phân tử cht lượng cao đối với việc nhận biết giống.

Phép thử nhận biết giống yêu cầu các marker cht lượng cao, để có thể cho các dữ liệu giống nhau khi sử dụng các thiết bị, hóa chất và thuốc thử khác nhau. Do đó, tiêu chuẩn này chỉ đưa ra các phương pháp khuếch đại đặc thù.

Mục đích của tiêu chuẩn này là để đảm bảo rằng tt c các phương pháp phân tích đều phù hợp với các yêu cầu của khách hàng, nêu rõ các bước khác nhau đ đánh giá xác nhận phương pháp và để xác định các tiêu chí chấp nhận. Và cũng đảm bảo rằng các nguyên tắc chung được áp dụng trong khi thực hiện các phép phân tích này đều giống nhau trong tt cả các phòng thử nghiệm (chất chuẩn, cỡ mẫu, mẫu phòng thử nghiệm, phần mẫu thử, việc chiết, phân tích và giải thích kết quả, chứng nhận phân tích).

Tiêu chuẩn này có vai trò trong việc chuẩn hóa các kết quả thu được trong các phòng thử nghiệm khác nhau.

THỰC PHẨM – NGUYÊN TẮC LỰA CHỌN VÀ TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ XÁC NHẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN BIẾT GIỐNG SỬ DỤNG AXIT NUCLEIC ĐẶC THÙ

Foodstuffs – Principles of selection and criteria of validation for varietal identification methods using specitic nucleic acid

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy đnh kỹ thuật phân tử đ lập các hồ sơ phân tử v các giống của các loài thực vật cụ thể, đ cho phép nhận biết các giống, nghĩa là khẳng đnh việc nhận biết liên quan đến một hoặc nhiều mẫu đối chứng.

Tiêu chuẩn này có th áp dụng cho các loại nền mẫu khác nhau, các hạt, lá, củ, các sản phẩm công nghiệp của một giống. Các nền mẫu ở dạng hỗn hợp của các giống (như bột nhuyễn, mứt qu, bột) không áp dụng tiêu chuẩn này.

Tiêu chuẩn này không liên quan đến độ thuần di truyn.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công b thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).

TCVN ISO/IEC 17025:2005, Các yêu cầu chung về năng lực của các phòng thí nghiệm và hiệu chuẩn.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và đnh nghĩa sau:

3.1. Thuật ngữ liên quan đến giống

3.1.1Giống cây trồng (cultivar)

Nhóm cây trồng có thể được xác định rõ bởi các đặc tính hình thái, vật lý, tế bào, hóa học hoặc các đặc tính khác, sau khi sinh sản hữu tính hoặc vô tính giữ được tính chất đặc thù của nó.

[nguồn: ISO 7563:1998, định nghĩa 1.12]

CHÚ THÍCH 1: Khái niệm giống cây trồng khác vi khái niệm thứ” (varietas) trong thực vật học như sau:

– “giống cây trồng là đơn vị phân loại dưới loài, kết quả từ chn Ic có kisoát, k cả từ thực nghiệm;

– “thứ là đơn v phân loại dưới loài, kết quả từ chọn lọc tự nhiên.

Các thuật ngữ “giống cây trồng và “thứ (variety) (theo nghĩa của thứ cây trồng) là tương đương. Khi diễn giải hoặc chấp nhận danh pháp thực vật để sử dụng cụ thể, các thuật ngữ giống cây trồng hoặc thứ (hoặc các thuật ngữ tương đương bằng ngôn ngữ khác) có thể được sử dụng trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH 2: Tên các thứ và các loài thực vật sử dụng là tên Latinh và được gi là danh pháp thực vật.

3.1.2Loài (species)

Nhóm các sinh vật có mức tương đồng di truyền (ADN) cao và có khả năng lai giống cao: thường chứa các phân loài (subspecies), thứ (variety) hoặc nòi (race).

CHÚ THÍCH 1: Tên loài được in nghiêng, gồm tên chi cùng với tên cụ th, ví dụ: Ananas comosus.

3.1.3Thứ (variety)

Bộ phận duy nhất và cùng kiểu của các loài thực vật (trừ các loài lai) giữ được các đặc trưng của thực vật từ thế hệ này sang thế hệ khác qua quá trình nhân giống tự nhiên.

[Nguồn: ISO 5527: – định nghĩa 2.1.7, được sửa đi – thuật ngữ khác thích hợp hơn “giống cây trồng” đã bị xóa].

3.2. Các thuật ngữ liên quan đến chiết và tinh sạch ADN/ARN

3.2.1. Chiết axit nucleic (nucleic acid extraction)

Xử lý mẫu để giải phóng axit nucleic đích.

CHÚ THÍCH 1. Quy trình chiết axit nucleic được sử dng đ tách các axit nucleic ra khỏi các thành phần khác nhau của tế bào, như protein, lipit, cacbohydrat và các chất nhiễm bn khác có trong mẫu.

[Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), đnh nghĩa 3.2.1, đã sửa đi – Chú thích 1 đã được bổ sung]

3.2.2Tinh sạch axit nucleic (nucleic acid purification)

Phương pháp làm ADN sạch hơn

CHÚ THÍCH 1: Quy trình hoặc quá trình gm các bước được sử dụng đ tách ADN và/hoặc ARN ra khỏi các thành phn khác có trong mẫu. Mẫu ADN hoặc ARN đã tinh sạch cao có các ảnh hưng quan sát được hoặc đo được không đáng kể đến các chất ức chế phản ứng chuỗi polymerase.

CHÚ THÍCH 2: Trong tiêu chuẩn này, độ tinh sạch liên quan đến việc giảm các ảnh hưởng quan sát được và đo được của các chất ức chế PCR.

[Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.2.2, đã sửa đi – Chú thích 1 đã được b sung; Chú thích 2 đã sửa đi].

3.3. Các thuật ngữ liên quan đến khuếch đại PCR của các axit nucleic

3.3.1Amplicon (amplicon)

Đoạn ADN cụ th tạo ra bởi công nghệ khuếch đại ADN, như phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

3.3.2Lai giống (hybridization)

Sự liên kết cụ thể của các trình tự axit nucleic bổ sung trong các điều kiện phản ứng thích hợp.

[Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.6.3]

3.3.3PCR đa thành phn (Multiplex PCR)

PCR sử dụng nhiều cặp mồi trong các locus liên kết khác nhau trong một hn hợp phản ứng đơn lẻ đồng thời đ tạo ra các amplicon.

[Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.4.11, đã sửa đổi – đoạn sau “mồi đã được bổ sung]

3.3.4Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction)

PCR

Quy trình sử dụng enzym để khuếch đại ADN in vitro.

[Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.4.1]

3.3.5Mồi (primer)

Oligonucleotid có chiều dài xác định và trình tự bổ sung cho đoạn ADN cần phân tích.

[Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.4.12].

3.3.6Mu dò (probe)

Phân tử axit nucleic dán nhãn có trình tự xác định được dùng đ phát hin ADN đích bằng lai giống.

[Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.6.1, đã sửa đi – thuật ngữ gốc là mẫu dò ADN].

3.3.7Tính đặc thù (specificity)

Đặc tính của phương pháp tương thích hoàn toàn vi đặc tính hoặc chất phân tích trong quá trình nghiên cu.

CHÚ THÍCH 1: Điu này mô tả khả năng nhận biết cụ thể trình tự axit nucleic đ phát hiện bng cách phân biệt với các trình tự axit nucleic khác và xu hướng đối với mồi hoặc mẫu dò để lai với đích của nó và không lai với các trình tự khác không phải đích.

[Nguồn: ISO 24276:2006, định nghĩa 3.1.4, đã sửa đổi – Chú thích 1 đã được bổ sung].

3.3.8Chu trình nhiệt (thermocycler)

Thiết bị tự động của phòng thử nghiệm được dùng để tăng và hạ nhiệt độ nhanh của mẫu theo chu kỳ thông qua một loạt các bước rời rạc và đã được cài đặt chương trình trước.

3.4. Các thuật ng liên quan đến phát hiện

3.4.1Điện di (electrophoresis)

Phương pháp tách các hạt điện tích do dịch chuyển điện tích khác nhau của chúng dưới một điện trường.

CHÚ THÍCH: Các sn phẩm PCR có thể được tách bằng các kiểu điện di khác nhau.

3.5. Các thuật ngữ liên quan đến kiểm soát

3.5.1Mu chuẩn (reference material/reference sample)

Vật liệu hoặc chất có một hoặc nhiều đặc tính đồng nht và được thiết lập tốt dùng để hiệu chuẩn thiết bị, đánh giá phương pháp đo hoặc đ đánh giá vật liệu.

CHÚ THÍCH 1: Mẫu chuẩn có th do khách hàng cung cp đến phòng thử nghiệm hoặc do cơ quan có thm quyn chỉ định.

[Nguồn: TCVN 8890 (ISO Guide 30)]

[Nguồn: TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2006), định nghĩa 3.5.1, đã sửa đi – Chú thích 1 đã được b sung].

3.5.2Kiểm soát thử nghiệm (test control)

Một hoặc nhiều mẫu thực hiện tất cả hoặc một phần quá trình phân tích đã được thiết kế đối với các mẫu đích và có thể phát hiện các alen tương ứng của các marker được sử dụng, do đó việc phát tín hiệu sai số quá trình bất kỳ và cung cấp các alen đối chứng có thể tạo thuận tiện cho việc đọc kết quả.

3.6. Thuật ngữ liên quan đến các marker

3.6.1Cạnh tranh alen (allele competition)

Việc khuếch đại ưu tiên của một alen so với alen khác trong d hợp tử hoặc hỗn hợp.

3.6.2Tần s alen (allele frequency)

Đại lượng cho biết alen có thông dụng trong quần th hay không; tỷ l hoặc phần trăm tất cả số lần xuất hiện một locus được chiếm bởi alen xác định.

3.6.3Marker (marker)

Marker gen chỉ dùng cho các đoạn ADN phù hợp với locus đã định đ cho thông tin về kiểu gen của chất mang hoặc kiểu gen của các locus bên cạnh.

3.6.4Alen bt hoạt (Null allele)

<dùng trong PCR> trình tự biến đổi ngăn ngừa khuếch đại PCR của đích cụ thể, dẫn đến không có mặt sản phm PCR có thể phát hiện được.

3.6.5Vùng lặp (repeat region)

Vùng gen trong đó trình tự ADN hoặc ARN cụ thể xut hiện như nhiều bản sao

3.6.6Lặp trình tự đơn (simple sequence repeat/SSR)

Vùng ADN bao gồm trình tự ngắn (1 bp đến 6 bp) (đơn v lặp lại) được lặp lại nhiều lần liền nhau (điển hình từ 5 đến 50).

CHÚ THÍCH 1: Các SSR thưng được biết là các v tinh nhỏ.

CHÚ THÍCH 2: Số lượng các đơn vị lặp lại thì hiện SSR quy định, do đó tổng chiu dài của SSR thường khác nhau giữa các đơn v riêng r.

3.6.7Hiện tượng lặp lại của một nucleotid (single nucleotide polymorphism/SNP)

Sự biến đổi của một nucleotid trong trình tự gen mà có thể xuất hiện với tần suất lớn trong quần thể.

[Nguồn: ISO 25720:2009, định nghĩa 4.23, sửa đi].

4. Đảm bảo chất lượng các kết quả thử nghiệm

Các yêu cầu và các hướng dẫn nêu trong Bảng 1 được mã hóa như sau:

– C: bắt buộc;

– R: khuyến cáo.

Bảng 1 – Các yêu cầu và hướng dẫn về kết quả thử nghim

Nhân viên

Tt c nhân viên thực hiện nhiệm vụ cụ thể phải được đào tạo thích hợp, có kiến thc, có kinh nghiệm và/hoặc có kỹ năng thành thạo, phù hợp với yêu cầu
 

Tiêu chí

Yêu cầu (C hoặc R)

  Đào tạo sử dụng thiết bị

C

  Xử lý hóa chất

C

  Nhân viên chịu trách nhiệm đưa ra ý kiến và diễn giải phải hiu biết v các cu trúc gen khác nhau và các h thống sản xuất hạt đ cung cp cho khách hàng lời khuyên và/hoặc gợi ý đ diễn giải kết quả

C

Thiết b
Thực hiện các thao tác bảo dưng thiết bị, dụng cụ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các hệ thống hiệu chuẩn thiết bị thích hợp phải luôn sn sàng.
Bảo dưỡng thiết b chính Thiết bị được sử dụng đ chuẩn b mẫu

C

  Ví dụ: máy xay trộn

 

  Dụng cụ pipet

C

  Nồi hp áp lực dùng đ khử trùng dụng cụ phòng thử nghiệm, các dung dịch và các đệm khác nhau được sử dụng

C

  Tủ đông để bảo qun dịch chiết, sản phm, hỗn hợp v.v…

C

  Tủ lạnh/bộ phận làm lạnh để giữ mẫu chiết, dung dịch và các hóa chất

C

  Thiết b được sử dụng để thực hiện chu trình khuếch đại ADN (chu trình nhiệt, ni cách thủy v.v…)

C

  Hình ảnh amplicon và hệ thng ghi (sao chép hình ảnh, máy quét v.v…)

C

  Hệ thống điện di, máy phân tích gen

R

  Thang đo chính xác

C

  Máy đo pH

R

  Robot

R

Tiện nghi

  Các biện pháp cn thiết bảo vệ sức khỏe lao động và môi trường cn thực hiện

R

Dụng cụ pipet thực hiện thủ công hoặc tự động dùng cho từng khu vực

C

Hai khu vực làm vic riêng biệt

 

Trước PCR và sau PCR

C

Thuc thử

  Các sản phm được sử dụng không được có các nguồn có khả năng làm suy giảm chất lượng hoặc làm nhiễm bn ADN. Tt cả các thuốc thử phải được bảo quản và sử dụng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

C

5. Lựa chọn phương pháp

Phương pháp luận và marker được sử dụng để nhận biết giống phải đáng tin cậy và thực tế cho phép mỗi phòng thử nghiệm ghi chú lại các sơ đồ marker đơn giản và có độ tin cậy nhất.

Việc lựa chọn này yêu cầu áp dụng các tiêu chí chất lượng, như trong việc chọn các alen đối chng và hệ thống phát hiện/ghi lại alen; hệ thống phát hiện phải thích hợp với kích thước của các sản phẩm PCR.

Các phương pháp được sử dụng cn được chọn theo marker sẵn có đối với từng loài được nghiên cu.

Dưới đây là danh mục tiêu chí quan trọng nhất đ chọn phương pháp luận:

a) tính sẵn có;

b) độ tái lập của dữ liệu được đưa ra giữa các phòng thử nghiệm và nn tảng phát hiện (các loại thiết bị được dùng);

c) độ lặp lại;

d) khả năng phân biệt

6. Chọn marker

6.1. Tiêu chí chung

Tiêu chí chung để chọn bộ marker là:

a) mức độ phân biệt dựa theo các giống đối chng;

b) biến động về độ lặp lại và độ tái lập của bộ marker trong phòng thử nghiệm (xem 8.2.1 và 8.2.2);

c) tránh càng xa càng tốt các marker đưa ra các alen bt hoạt;

d) sự thuận tiện để ghi (scoring).

6.2. Chọn bộ marker

Để khẳng định việc nhận biết khi so sánh với một hoặc nhiu đối chứng (dòng b m, lai nhân tạo, vô tính), phòng thử nghiệm phải sử dụng bộ marker tạo ra s lượng đủ phân biệt của các alen để đáp ứng yêu cầu của khách hàng. Phòng thử nghiệm phải nêu rõ lý do bộ marker được chọn.

Các bộ marker cần được phân bố khắp toàn bộ gen khi sơ đ liên kết sẵn có. Mặc dù đây không phải là điều bắt buộc, nhưng rt bổ ích để hưng dẫn tránh việc chọn đối với các marker có khả năng liên quan.

6.3. Marker SSR

Phép phân tích SSR đầy đủ và có hiệu quả khi chọn các marker chất lượng cao. Việc chọn marker do đó cần như sau:

a) phải ưu tiên cho các marker hin thị ít hoặc không có các băng vạch giả;

b) việc chọn các marker phải tính đến hệ thống tách và quan sát;

c) phải ưu tiên các marker không có mặt alen cạnh tranh và cần cố gắng để loại bỏ bất kỳ sự cạnh tranh giữa các marker trong các ln chạy PCR đa thành phần.

6.4. Nucleotid lặp lại đơn l (SNP)

Phải tránh các vùng lặp lại.

CHÚ THÍCH: Các vùng lặp lại có th dẫn đến các alen SNP chiếm ưu thế nếu xuất hiện vic phát hiện đồng thời vùng tương đng.

Bản chất của các SNP là chúng có hai trạng thái alen. Không nên chọn các SNP có nhiu hơn hai trạng thái alen.

Các SNP có thể được ghi lại đáng tin cậy và không phức tạp. Nên để phân tích một số lượng lớn các marker độc lập hoặc thông qua việc ghép để đạt được khả năng phân biệt tốt giữa các ging.

7. Mẫu phòng thử nghiệm

7.1. Mu

Cỡ mẫu và các điều kiện bảo quản trước khi phân tích phải phù hợp với phép phân tích được yêu cu.

Cần chú ý về việc nhận biết mẫu, mẫu con và phần mẫu th, theo quy định trong 5.8.2 của TCVN ISO/IEC 17025:2005 để đảm bảo việc truy xuất nguồn gốc.

7.2. C mẫu

Để phân tích chất chuẩn, cn bao gồm một lượng đủ các mẫu riêng lẻ để đặc trưng cho đa hình thái giống nội, có tính đến các đặc tính tái lập (xem 7.3) và sự hiểu biết khác của các yếu tố đặc thù của giống và/hoặc trồng trọt. Đối với các mẫu thử, khi có thể, nên phân tích vài mẫu riêng lẻ hoặc nhiều mẫu chung.

7.3. Mẫu đối chứng

Phải sử dụng mẫu đối chứng (xem 3.5.1) được xử lý theo cùng một phương pháp như đối với mẫu thử. Nếu mẫu đối chứng là khuôn mẫu ADN, thì thực hiện các bưc tương tự sau khi tách ADN.

Sơ đ phân tử thu được trước trong các điu kiện tương tự như áp dụng cho sơ đồ phân tử đối chứng.

Các sơ đ marker của mẫu đối chứng có th được sử dụng đ xây dựng cơ sở dữ liệu trong mỗi phòng thử nghiệm và sau đó được sử dụng cho các phép phân tích thông dụng.

– Các giống lai tạo thực vật (vegetatively reproducing varieties): nhìn chung, các phép phân tích trên các giống lai tạo thực vật có thể thực hiện sử dụng chỉ một giống, như nhau cho tất cả các giống riêng lẻ;

– Các giống tự giao hoặc tự giao ban đu (primarily autogamous varieties or primarily autogamous varieties): các giống tự giao hoặc tự giao ban đầu không nht thiết phải đơn hình tại tất cả các locus, kể c locus SSR hoặc locus SNP. Thông thường nên phân tích một số hạt hoặc cây riêng lẻ để đặc trưng cho tính đa dạng trong một giống cây trồng. Tuy nhiên, một lượng ln các mẫu riêng lẻ có thể được sử dụng để đại diện cho giống.

– Các giống trong một qun th: nên phân tích các hạt hoặc các cây riêng r để xác định sơ đồ tần số alen đặc trưng cho mỗi giống trong qun thể. Phải sử dụng c mẫu đại diện cũng như cách tiếp cận thống kê để xác định mức độ tin cậy của các kết quả phù hợp với 9.4. Trong trường hợp này, phải sử dụng mẫu đối chứng cho mỗi giống trong qun thể.

– Lai đơn c định b m (F1): v nguyên tắc, có thể phân tích chỉ một cá th tương tự cho tất c các cá th. Có thể không đồng nhất, ví dụ: t dị hợp tử còn lại của ít nht một dòng bố m, sự thụ phấn chéo hoặc trộn lẫn về vật lý. Do đó, việc hướng dẫn là phân tích vài cá thể để đại diện sơ đồ ADN của giống xác định.

– Lai ba (3-way hybrids): Cu trúc gen của loại lai này cho thấy ba loài khác nhau lai nhau cần thực hiện các phép phân tích trn hỗn hợp của một số lượng cá th thích hợp (ít nht là 20).

– Giao phi cùng giống hoặc các giống giao phối cùng giống chính: Nên phân tích một lượng hạt hoặc cây trồng riêng lẻ để đặc trưng cho tính đa hình mà có thể có trong giao phối cùng giống hoặc giao phối cùng giống chính. Tuy nhiên, mẫu chung của các cá thể cũng có th được sử dụng để đại diện cho giống.

8. Đánh giá xác nhận phòng thử nghiệm

8.1. Yêu cầu chung

Mỗi phòng thử nghiệm sử dụng phương pháp đã được xác nhận bằng nghiên cứu liên phòng hoặc không thì bằng nghiên cứu nội bộ phòng thử nghiệm.

Trong lĩnh vực nhận biết giống marker phân tử trung gian, việc đánh giá phương pháp tương đương với đánh giá xác nhận bộ marker.

Phương pháp được đánh giá xác nhận marker bằng marker đối với một loài xác định. Diễn giải và đánh giá xác nhận các kết quả được thực hiện theo Điều 9.

Bộ marker phải cung cấp đủ khả năng phân biệt đáp ứng yêu cầu của khách hàng. Phương pháp được đánh giá xác nhận qua toàn bộ quá trình phân tích (trên từng nền mẫu của mỗi loài).

8.2. Tiêu chí đánh giá xác nhận nội bộ phòng thử nghim

Việc đánh giá xác nhận bao trùm bộ marker được chọn bởi phòng thử nghiệm theo các tiêu chí nêu trong Điều 6.

Việc đánh giá xác nhận phải bao gồm một số lượng thích hợp các giống khác nhau (ít nhất là năm, nếu có thể).

Đối với các loài có mặt các giống lai thì nên sàng lọc alen cạnh tranh sử dụng các dị hợp tử (cây lai hoặc hỗn hợp ADN bố mẹ) và các dòng bố mẹ, nếu có thể.

8.2.1. Độ lặp lại

Mỗi marker được sử dụng phải cho độ lặp lại. Mục đích là để kiểm tra độ chụm trong các điều kiện giống nhau.

Mỗi marker phải được kiểm tra về độ lặp lại trên một lần chiết axit nucleic cho mỗi giống và ba PCR cho mỗi lần chiết.

Marker được coi là lặp lại nếu ba kết quả giống nhau cho mỗi giống được kiểm tra.

8.2.2. Các điều kiện tái lập (hoặc độ chụm trung gian)

Mỗi marker được sử dụng phải cho độ tái lập. Mục đích là để kiểm tra độ chụm trong các điều kiện khác nhau.

Mỗi marker được kiểm tra về độ tái lập bằng cách cho chạy ba phép thử không đồng thời cho mỗi giống, với một PCR cho ADN chiết được. Mỗi phép thử cn có một số lượng đ các cá thể riêng lẻ hoặc nhiều cá thể trên mỗi giống để công nhận ging nội lặp lại. Các giống đã biết  các biến thể không bình thường cần loại ra khỏi các phép thử tái lập.

Không đồng thời có nghĩa là mỗi phép thử phải được thực hiện các điu kiện khác nhau (người thực hiện, thiết bị, thời gian, thuốc thử v.v…).

Marker được coi là tái lập nếu cho các kết quả giống nhau cho mi giống qua ba phép thử.

8.2.3. Phân biệt

Việc sử dụng bộ marker đã đánh giá xác nhận được giới hạn đến các giống có thể phân biệt được.

Có một s trưng hợp các giống thu được từ các nhà sản xut, như chọn lọc tự nhiên hoặc đột biến gây ra hoặc lai lặp lại thì có th không phân biệt được từ giống ban đu khi sử dụng một bộ marker cho tất c các mục đích. Trong những trường hợp này có thể cần đến các bộ marker bổ sung đặc hiệu hoặc biện pháp bổ sung khác để nhận biết rõ các giống. Những hạn chế đã biết của bộ marker phải được hiểu rõ.

8.2.4. Đánh giá xác nhận khi thay đổi thiết bị hoặc nền mẫu thực vật

CHÚ THÍCH: Thiết bị bao gồm chu trình nhiệt, pipet tự động, hệ thống tách và phát hiện.

Trưng hợp có s thay đi thiết bị định kiểu gen, thì bộ marker đã được đánh giá phải thể hiện lại các đặc tính sử dụng ADN từ các giống đã được sử dụng trước đó để đánh giá.

Mỗi marker được thử nghiệm qua 1 PCR trên 1 ADN trên ít nht năm giống khác nhau, nếu  thể.

Cho dù có những khác nhau v các thông số, như kích thước alen suy ra được khi xác định bằng các bộ thiết b khác nhau, thì các kết luận được rút ra đối với việc nhận biết giống không được thay đổi.

8.3. Các tu chí đánh giá liên phòng thử nghim

8.3.1. Yêu cầu chung

Việc đánh giá xác nhận chỉ liên quan đến kết quả. Mỗi phòng thử nghiệm tham gia tự do lựa chọn quy trình phân tích (chiết ADN, tinh sạch axit nucleic, cách thức PCR, thiết bị v.v…) trong quá trình thử nghiệm đánh giá liên phòng. Việc tự do lựa chọn này không áp dụng cho việc s dụng marker.

8.3.2. Đánh giá xác nhận bằng phép thử nghiệm liên phòng

8.3.2.1. Yêu cầu chung

Đánh giá xác nhận bng phép thử nghiệm liên phòng này phi xác định tiếp quy trình lựa chọn bộ marker mạnh nhất có th trong số các marker được đánh giá trong quá trình đánh giá nội bộ phòng trước đó (xem 8.2).

8.3.2.2. Số lượng tối thiểu các phòng thử nghiệm tham gia

Việc đánh giá xác nhận mức quốc gia phải ít nhất bốn phòng tham gia (nếu có th) hoặc ít nhất tám phòng đối với đánh giá ở mức quốc tế.

8.3.2.3. Vật liệu sinh học

Phép thử phải thc hiện trên một lượng đủ các giống (ít nht là năm, nếu có thể) khi thực hiện đánh giá  mức quốc gia (hoặc quốc tế)Số lượng cá thể hoặc các cá thể trên mỗi giống được kiểm tra trên mỗi phòng thử nghiệm tham gia cần đủ đ công nhận sự đa hình của giống nội. Các giống được biết có các biến th bất thường không được đưa vào sử dụng trong phép thử đánh giá liên phòng.

CHÚ THÍCH: Vật liệu sinh học có th là hạt, tế bào thực vật, bột. Nếu sử dụng bột, thì bột phải có xuất xứ t một ging.

8.3.2.4. Nguyên tắc làm việc

Nguyên tắc làm việc, bao gm cả các yêu cầu cơ bn đối với PCR, như mồi và trình tự dò, kể cả chất nhuộm màu huỳnh quang, chất làm tắt, chất gắn kết rãnh nhỏ và/hoặc các phần thúc đy đặc hiệu khác, cũng như các điều kiện khuếch đại PCR được khuyến cáo, phải được cung cp.

Các phòng thử nghiệm tham gia có thể điều chỉnh các điều kiện này cho thích hợp với thiết bị được sử dụng. Việc bổ sung hoặc loại bớt sự m rộng trình tự mồi 5’ hoặc thay đi các chất nhuộm màu huỳnh quang là cho phép; tuy nhiên không được thay đi đoạn trình tự mồi đặc hiệu đối với trình tự đích.

8.3.2.5. Chú thích về các kết quả

Xem 9.2.

8.3.2.6. Đánh giá xác nhận các marker riêng r

Marker được đánh giá xác nhận khi tt cả các kết quả giống nhau giữa các phòng thử nghiệm đối với tất cả các giống được thử nghiệm.

Đối với các marker vệ tinh nhỏ, các kích thước tương đối của alen đối với bộ giống đã cho phải thống nhất giữa các phòng thử nghiệm.

8.3.2.7. Đánh giá xác nhận phương pháp của phòng thử nghiệm

Phương pháp được đánh giá xác nhận khi một lượng đủ các marker tái lập thu được. Phòng thử nghiệm phải xác định số lượng đ các marker. Số lượng marker phụ thuộc vào kiểu marker được sử dụng, các loài và việc ứng dụng.

Cần đánh giá phương pháp với hệ thống phát hiện được sử dụng trong mỗi phòng thử nghiệm tham gia.

8.3.3. Chuyn đổi phương pháp

Nếu phòng thử nghiệm muốn sử dụng bộ marker đã được phòng thử nghiệm khác đánh giá, thì phải đăng ký trong quy trình đánh giá nội bộ phòng thử nghiệm (xem 8.2).

8.3.4. Thay đổi nn mẫu

Mọi thay đổi nền mẫu tiềm năng ch phải đánh giá nội phòng thử nghiệm.

CHÚ THÍCH: Thay đổi nn mu nghĩa là thay đổi một phần bt kỳ của tế bào  giai đoạn bt k.

9. Diễn giải và biểu thị kết quả

9.1. Yêu cu chung

Nên sử dụng các phép thử kiểm chứng là để hỗ trợ cho việc phát hiện các sai số đọc hoặc sai số thực nghiệm.

9.2. H thng chú thích dữ liệu

Khi làm việc với các marker có kích thước cơ bản như SSR, thì nên dùng thang ADN thích hợp (chuẩn khối lượng phân tử) để thuận tiện cho việc chú thích dữ liệu. Không sử dụng thang ADN để thay thế phép thử kiểm chứng (xem 3.5.2).

Cần quan sát kiểm tra nếu dữ liệu được đọc bằng hệ thống tự động.

Việc chú thích tốt nht là theo định dạng locus alen.

Các alen có thể được chú thích sử dụng mã số thông dụng đối với SSR, ví dụ: A, B, C, D v.v…trong đó A là alen nhỏ nht v.v…

Đối với các marker có kích thước cơ bản, như SSR, thì các kết quả được báo cáo phải bao gồm kích thước dự kiến của mỗi marker.

Khi làm việc với các SNP, thì các kết quả cần được biểu th theo ba định dạng như sau:

– đồng hợp tử 1 (huỳnh quang 1 hoặc băng 1), viết là A;

– đồng hợp tử 2 (huỳnh quang 2 hoặc băng 2), viết là B;

– đồng hợp tử 1 và 2 (huỳnh quang 1 và 2 hoặc băng 1 và 2), viết là AB.

Phòng thử nghiệm trả các kết quả theo kiểu huỳnh quang hoặc dải huỳnh quang.

9.3. Phân tích kết quả

Các kết quả có thể biểu thị theo Bảng 2.

Bảng 2 – Ví dụ v biểu th kết qu

 

Marker 1

Marker 2

Marker 3

SSR Kích thước dự kiến Kích thước dự kiến Kích thước dự kiến
SNP

A, B, AB

A, B, AB

A, B, AB

Mẫu 1

Chất chuẩn 1

Mẫu 2

Chất chuẩn 2

9.4. Biểu thị kết quả

9.5. Kiểm tra việc nhận biết

9.6. Sự tương hp giữa mẫu cần phân tích và mẫu đi chứng

Nếu bộ dữ liệu xác định được đối với mẫu trùng khp chính xác hình dạng quan sát được sử dụng cùng bộ marker trong mẫu đối chứng, thì báo cáo phải nêu rõ:

Mu X giống hệt mẫu chuẩn Y liên quan đến hình dạng phân tử xác định được s dụng các marker ADN Z; trong đó X là ký hiệu nhận dạng mẫu, Y là ký hiệu nhận dạng mẫu đối chứng và Z là tổng số marker được sử dụng.

9.4.1.2. Sự không tương hợp giữa mẫu cần phân tích và mẫu đối chứng

Nếu dữ liệu marker xác định được đi với mẫu khác với một hoặc nhiều marker từ hình dạng quan sát được sử dụng cùng bộ marker trong mẫu đối chứng, thì báo cáo phải nêu rõ:

Mu X khác với mẫu chuẩn Y tại n marker ngoài các marker ADN được xác định; trong đó X là ký hiệu nhận dạng mẫu, Y là ký hiệu nhận dạng mẫu đối chng và n là số lượng marker mà  đó mẫu X khác với mẫu đối chứng Y và Z là tổng s marker được sử dụng.

9.4.2. Hình dạng phân tử của các giống

Các kết quả có thể được biểu thị theo Bảng 2 (xem 9.3).

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết đ nhận biết đầy đủ và mẫu thử;

b) phương pháp ly mẫu đã sử dụng (nếu biết);

c) ngày nhận mẫu;

d) ngày phân tích mẫu;

e) ngày báo cáo kết quả;

f) phương pháp sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

g) mọi điều kiện thao tác không quy đnh trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hưng đến kết quả;

h) kết quả thu được (xem 9.4);

i) nếu kiểm tra lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4995 (ISO 5527), Ngũ cốc – Thuật ngữ và định nghĩa

[2] TCVN 9990:2013 (ISO 7563:1998), Rau quả tươi- Thuật ngữ và định nghĩa

[3] TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), Vi sinh vt trong thực phm và thức ăn chăn nuôi – Phản ng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện và định lượng sinh vật gây bệnh từ thc phm – Định nghĩa và yêu cầu chung

[4] TCVN 7608 (ISO 24276), Thực phẩm – Phương pháp phân tích đ phát hiện sinh vật biến đổi gen và sn phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Yêu cu chung và định nghĩa

[5] ISO 25720:2009, Health informatics – Genomic Sequence Variation Markup Language (GSVML)

[6] TCVN 8890 (ISO Guide 30), Terms and definitions used in connection with reference materials

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10990:2015 (ISO 13495:2013) VỀ THỰC PHẨM – NGUYÊN TẮC LỰA CHỌN VÀ TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ XÁC NHẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN BIẾT GIỐNG SỬ DỤNG AXIT NUCLEIC ĐẶC THÙ
Số, ký hiệu văn bản TCVN10990:2015 Ngày hiệu lực 31/12/2015
Loại văn bản Tiêu chuẩn Việt Nam Ngày đăng công báo
Lĩnh vực Khoa học - Công nghệ
An toàn thực phẩm
Ngày ban hành 31/12/2015
Cơ quan ban hành Bộ khoa học và công nghê
Tình trạng Còn hiệu lực

Các văn bản liên kết

Văn bản được hướng dẫn Văn bản hướng dẫn
Văn bản được hợp nhất Văn bản hợp nhất
Văn bản bị sửa đổi, bổ sung Văn bản sửa đổi, bổ sung
Văn bản bị đính chính Văn bản đính chính
Văn bản bị thay thế Văn bản thay thế
Văn bản được dẫn chiếu Văn bản căn cứ

Tải văn bản