TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11133:2015 (ISO 22119:2011) VỀ VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM, THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE REAL-TIME (PCR REAL-TIME) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM – ĐỊNH NGHĨA VÀ YÊU CẦU CHUNG VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM, THỨC ĂN CHĂN NUÔI. PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE REAL-TIME (PCR REAL-TIME) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM. ĐỊNH NGHĨA VÀ YÊU CẦU CHUNG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11133:2015

ISO 22119:2011

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE REAL-TIME (PCR REAL-TIME) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM – ĐỊNH NGHĨA VÀ YÊU CẦU CHUNG

Microbiology of food and animal feeding stuffs – Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions

Lời nói đầu

TCVN 11133:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 22119:2011;

TCVN 11133:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

PCR là phương pháp nhanh, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Những tiến bộ về kỹ thuật của phương pháp PCR cho phép phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu thông qua quá trình khuếch đại. Nguyên lý chủ yếu dựa vào sự kích thích huỳnh quang trong quá trình PCR.

Tiêu chuẩn này nằm trong bộ tiêu chuẩn với tên chung là Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm:

TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính

TCVN 10781 (ISO/TS 13136) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực – Phát hiện Escherichia coli sinh độc tố Shiga (STEC) và xác định các nhóm huyết thanh O157, O111, O26, O103 và O145

TCVN 11131 (ISO/TS 20836), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Phép thử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt

TCVN 11132 (ISO 22118) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Đặc tính hiệu năng

TCVN 11133 (ISO 22119), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) để phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Định nghĩa và yêu cầu chung

TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Định nghĩa và yêu cầu chung

ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính].

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE REAL-TIME (PCR REAL-TIME) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM – ĐỊNH NGHĨA VÀ YÊU CẦU CHUNG

Microbiology of food and animal feeding stuffs – Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các thuật ngữ về việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm và các chủng phân lập được từ thực phẩm bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Tiêu chuẩn này cũng quy định các yêu cầu đối với việc khuếch đại và phát hiện các trình tự nucleotide (ADN và ARN sau khi phiên mã ngược) bằng phản ứng PCR real-time.

Những yêu cầu tối thiểu trong tiêu chuẩn này đưa ra các kết quả mang tính so sánh và lặp lại trong các phòng thử nghiệm riêng lẻ và giữa các phòng thử nghiệm khác nhau.

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm trong mẫu môi trường và mẫu thức ăn chăn nuôi.

CHÚ THÍCH: Các ví dụ đưa ra ở đây được dùng thường xuyên tại thời điểm xây dựng tiêu chuẩn này.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).

TCVN 7682 (ISO 20838) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính

TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Định nghĩa và yêu cầu chung.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1 

Phản ứng chuỗi polymerase real-time (Real-time polymerase chain reaction)

Quá trình enzym kết hợp phản ứng khuếch đại in vitro của các đoạn ADN đặc hiệu thông qua quá trình biến tính, bắt cặp của các mồi đặc hiệu và tổng hợp ADN bằng việc phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình khuếch đại.

CHÚ THÍCH 1: Nhìn chung hỗn hợp phản ứng khuếch đại chứa một hay nhiều mẫu dò ADN đặc hiệu cùng với một hoặc nhiều màu huỳnh quang. Bằng kỹ thuật này, tín hiệu được tạo ra sau quá trình lai đặc hiệu của các mẫu dò với trình tự nucleotide đích và phát huỳnh quang ở các bước sóng xác định.

CHÚ THÍCH 2: Việc sử dụng các chất huỳnh quang có gắn ADN không đặc hiệu có thể được dùng nếu các kết quả dương tính được kiểm tra theo TCVN 7682 (ISO 20838).

3.2 

Sản phẩm PCR (PCR product)

ADN được khuếch đại bằng PCR.

[TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), 3.4.5]

3.3 

Chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (fluorescence resonance energy transfer)

<phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm bằng PCR> Việc chuyển năng lượng phụ thuộc vào khoảng cách từ phân tử cho sang phân tử nhận khiến cho lượng huỳnh quang của phân tử nhận tăng lên sau khi phát ra bức xạ điện từ có bước sóng xác định.

CHÚ THÍCH: Có được từ Tài liệu tham khảo [2].

3.4 

Phân tử phát (Reporter)

<phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm bằng PCR> Phân tử huỳnh quang được sử dụng để phát hiện sự lai giống của các mẫu dò đặc hiệu bằng kích thích giải phóng ra điện từ bằng các bước sóng xác định.

3.5

Phân tử dập tắt (Quencher)

<phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm bằng PCR> Phân tử huỳnh quang được coi như là một chất hấp thụ năng lượng và dập tắt các tín hiệu huỳnh quang của các thể cho.

3.6

Phân tử dập tắt không có chất huỳnh quang (dark quencher)

Phân tử được coi là nhận, không phát ra năng lượng trong dải quang phổ được phát hiện bằng quang học của máy real-time PCR.

3.7 

Hoạt tính enzym 5’-3’exonuclease (enzym 5’-3’exonuclease activity)

Khả năng một enzym có thể tách phân tử axit nucleic lai theo hướng 5’-3’, ví dụ polymerase axit nucleic.

CHÚ THÍCH: Hoạt tính của enzym 5’-3’exonuclease là ADN sợi đôi đặc hiệu, phụ thuộc vào loại enzym và có thể có mặt trong Taq-, Tth- và Tfl-polymerase.

3.8 

Mẫu dò huỳnh quang (fluorescent probe)

Các olinucleoitide hoặc analogon oligonucleotide của một trình tự xác định bắt cặp với một hoặc nhiều phân tử huỳnh quang.

CHÚ THÍCH: Bất cứ hệ thống phát tín hiệu huỳnh quang nào sau khi lai đặc hiệu với trình tự axit nucleic đích có thể được phát hiện bằng thiết bị đặc hiệu được dùng như một mẫu dò huỳnh quang.

3.9 

Mẫu dò thủy giải (hydrolysis probe)

Mẫu dò huỳnh quang bắt cặp với hai phân tử huỳnh quang được chia tách trong không gian bởi hoạt tính của enzym 5’-3’exonuclease trong quá trình khuếch đại.

CHÚ THÍCH: Nguyên lý của mẫu dò thủy giải được minh họa ở Hình 1.

a) Mẫu dò chưa được lai trong dung dịch              b) Sự phân tách của mẫu dò đã được lai

c) Mẫu dò đã tách (cleaved probe) tạo thành trong phân tử phát huỳnh quang sau khi kích thích

CHÚ DẪN:

1  Cơ chất ADN                                                             3  Phân tử dập tắt

2  Phân tử huỳnh quang (phân tử phát)                           4  Enzym

Hình 1 – Nguyên tắc của mẫu dò thủy giải

3.10 

Mẫu dò lai (hybridization probe)

Hệ thống gồm hai mẫu dò huỳnh quang bắt cặp với một phân tử huỳnh quang, trong đó một phân tử là huỳnh quang cho và một phân tử làm huỳnh quang nhận.

CHÚ THÍCH: Nguyên tắc của mẫu dò lai được minh họa trong Hình 2.

a) Mẫu dò chưa được lai trong dung dịch

b) Mẫu dò đã được lai tạo thành trong huỳnh quang nhận

CHÚ DẪN:

1  Cơ chất ADN

2  Phân tử nhận

3  Phân tử cho

Hình 2 – Nguyên tắc của mẫu dò lai

3.11 

Mẫu dò dạng kẹp tóc (molecular beacon)

Mẫu dò huỳnh quang bao gồm ba phần khác nhau: phần trung tâm bổ sung trình tự acid nucleic đích, cộng với đầu 5’ và đầu 3’ là bổ sung, phân tử phát và phân tử dập tắt được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò.

CHÚ THÍCH: Nguyên lý của tín hiệu phân tử được minh họa ở Hình 3.

a) Mẫu dò dạng kẹp tóc không lai trong dung dịch

b) Mẫu dò dạng kẹp tóc tạo thành trong phân tử phát huỳnh quang

CHÚ DẪN:

1  Cơ chất ADN

2  Phân tử huỳnh quang (phân tử phát)

3  Phân tử dập tắt

Hình 3 – Nguyên tắc của mẫu dò dạng kẹp tóc

3.12  Mẫu dò phát hiện trình tự ADN vi sinh vật gây bệnh đặc hiệu (probe for detection of a specitic pathogen DNA sequence)

Mẫu dò với một trình tự bổ sung vào ADN vi sinh vật gây bệnh có phân tử phát ra tín hiệu với bước sóng xác định và được phát hiện bằng hệ thống phát hiện quang học.

3.13  Mẫu dò phát hiện trình tự axit nucleic kiểm soát bên trong (probe for detection of an internal control nucleic acid sequence)

Mẫu dò với phân tử phát huỳnh quang được thiết kế để xác nhận quá trình khuếch đại

CHÚ THÍCH 1: Mẫu dò phát ra tín hiệu sẽ phân biệt được rõ với tín hiệu của mẫu dò được thiết kế cho việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh cụ thể.

CHÚ THÍCH 2: Việc áp dụng nội kiểm cần phải sử dụng một thiết bị có thể phát hiện được tín hiệu có bước sóng khác nhau.

3.14 

Chuẩn tham chiếu (passive reference)

Các phân tử huỳnh quang có mặt trong hỗn hợp phản ứng được dùng để chuẩn hóa tín hiệu

CHÚ THÍCH: Là khi các phân tử huỳnh quang bắt cặp với các trình tự acid nucleic hoặc các phân tử khác không tham gia vào phản ứng.

3.15 

Mức độ phát hiện huỳnh quang nền (baseline fluorescence detection level)

Đường nền “baseline”

Điểm mà phản ứng đạt được mức độ huỳnh quang trên mức nền.

3.16 

Huỳnh quang nền (background fluorescence)

Nền “background”

Mức độ huỳnh quang nội tại được tạo ra từ thuốc thử và vật liệu phụ đang dùng.

3.17 

Điểm cắt của chu kỳ ngưỡng (threshold cycle crossing point)

Điểm trên đường cong khuếch đại khi tín hiệu huỳnh quang tăng lên cao hơn mức ban đầu hoặc cắt tại một ngưỡng đã xác định trước.

4  Nguyên tắc

4.1  Yêu cầu chung

Phân tích real-time PCR nhìn chung bao gồm:

a) Khuếch đại trình tự đích đặc hiệu bằng PCR với sự có mặt của mẫu dò huỳnh quang

b) Gắn mẫu dò huỳnh quang trong mỗi chu trình khuếch đại

c) Tạo ra tín hiệu huỳnh quang bằng sự kích thích trong mỗi chu trình

d) Phát hiện tín hiệu huỳnh quang bằng hệ thống phát hiện huỳnh quang

e) Phân tích số liệu

CHÚ THÍCH: Đối với mục đích sàng lọc, có thể dùng tín hiệu huỳnh quang từ cơ chất gắn với ADN sợi đôi.

4.2  Mẫu dò dùng cho real-time PCR

4.2.1  Sử dụng mẫu dò thủy giải

Mẫu dò thủy giải là một oligonucleotide đặc hiệu có mặt trong phản ứng PCR cùng với các cặp mồi PCR. Một đầu của mẫu dò này mang phân tử phát huỳnh quang (reporter) với phổ phát xạ mà bị dập tắt bằng phân tử thứ hai (quencher) nằm tại một đầu còn lại.

Mẫu dò này lai với trình tự acid nucleic đích. Trong bước kéo dài, enzym polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease bám kết mẫu dò lai. Sau khi gắn kết, reporter sẽ tách ra khỏi quencher, làm tăng cường độ huỳnh quang của reporter. Tín hiệu huỳnh quang tạo thành tỷ lệ thuận với việc tạo thành sản phẩm PCR đặc hiệu.

Đầu 3’ của mẫu dò cần đóng để tránh bị kéo dài trong quá trình chạy PCR.

4.2.2  Sử dụng mẫu dò lai

Người ta dùng 2 mẫu dò lai có mặt trong phản ứng PCR theo các oligonucleotide đặc hiệu thêm vào các mồi PCR. Mỗi mẫu dò này chứa một phân tử huỳnh quang, một làm phát huỳnh quang (donor) và một làm chất nhận huỳnh quang (acceptor) lai với các trình tự axit nucleic đích. Sau khi lai, cả hai chất ở trong một khoảng cách gần sao cho việc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xảy ra trên bước sóng kích thích và chất nhận huỳnh quang phát hiện được tín hiệu. Tín hiệu huỳnh quang tạo ra tỷ lệ thuận với sản phẩm PCR đặc hiệu.

Đầu 3’ của các mẫu dò cần đóng để tránh bị kéo dài trong quá trình chạy PCR.

4.2.3  Sử dụng mẫu dò dạng kẹp tóc

Mẫu dò dạng kẹp tóc là một oligonucleotide đặc hiệu có mặt trong phản ứng PCR cùng với các cặp mồi PCR.

Khi các mẫu dò dạng kẹp tóc liên kết với trình tự đích bổ sung tại nhiệt độ lai, chúng trải qua quá trình chuyển đổi thích nghi làm tách ra xa. Điều này dẫn đến quá trình lai-đích-mẫu dò dài hơn và ổn định hơn so với thân. Sự phân tách reporter và quencher làm cho reporter phát tín hiệu (xem Tài liệu tham khảo [3]). Tín hiệu huỳnh quang tạo ra tỷ lệ thuận với sản phẩm PCR đặc hiệu.

5  Yêu cầu chung trong phòng thử nghiệm

Yêu cầu chung đối với phòng thử nghiệm được quy định trong TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).

6  Thuốc thử và vật liệu thử

6.1  Yêu cầu chung

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước tinh khiết tương đương không có axit nucleic và nuclease thích hợp cho phân tích sinh học phân tử.

Không sử dụng các thuốc thử, ví dụ các thành phần của canh thang tăng sinh, những chất này có thể ảnh hưởng đến việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang của máy.

Những yêu cầu cụ thể áp dụng cho từng loại thuốc thử cụ thể được nêu trong 6.2 đến 6.6.

6.2  ADN polymerase và chất đệm cho phản ứng

6.2.1  ADN polymerase

Sử dụng polymerase chịu nhiệt (có thể có hoạt tính phiên mã ngược) cho PCR. Enzym này nên được dùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

CHÚ THÍCH: Enzym này có thể là tự nhiên hoặc là enzym tái tổ hợp về mặt di truyền, đã được tinh sạch.

Nếu dùng mẫu dò thủy giải, thì ADN polymerase cần có hoạt tính exonuclease 5’-3’. Trong phân tích ARN, cần sử dụng hỗn hợp phiên mã ngược và enzym ADN polymerase hoặc ADN polymerase với hoạt tính phiên mã ngược.

Mỗi ADN polymerase cần có những điều kiện thực nghiệm khác nhau.

6.2.2  Chất đệm phản ứng

Chất đệm phản ứng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).

6.3  Deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP) dùng cho phản ứng PCR

Các dNTP được sử dụng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).

6.4  Mồi

Các cặp mồi được dùng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).

6.5  Mẫu dò huỳnh quang dùng cho real–time PCR

Các oligonucleotide phải có chất lượng phù hợp, được thiết kế để phát hiện trình tự có mặt trong sản phẩm PCR đặc hiệu. Trình tự mẫu dò cần được bổ sung phù hợp với trình tự của ADN đích.

6.6  Kiểm soát khuếch đại bên trong

Hiệu quả khuếch đại của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung vào bình phản ứng như phần chiết ADN của mẫu thử. Có thể dùng cùng một cặp mồi để khuếch đại của đoạn ADN kiểm chứng và khuếch đại của đích ADN (kiểm soát khuếch đại bên trong đồng đẳng) hoặc một cặp mồi khác (kiểm soát khuếch đại bên trong không đồng đẳng). Hệ thống đích và hệ thống kiểm soát khuếch đại bên trong cần có hiệu quả khuếch đại giống nhau. Nồng độ đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung nên càng thấp càng tốt để có thể phát hiện được hàm lượng chất ức chế nhỏ nhất và cho kết quả dương tính tương tự. Ngoài ra, cần biết chắc rằng kiểm soát khuếch đại bên trong không ảnh hưởng đến mức phát hiện của đoạn gen đích. Những lý do sau làm giảm những tương tác không tốt đến mức độ phát hiện

– Hiệu quả khuếch đại của đối chứng khuếch đại bên trong đồng đẳng hơi thấp hơn ADN đích;

– Nồng độ mồi đối với kiểm soát khuếch đại bên trong không đồng đẳng được giảm.

Chất kiểm soát khuếch đại bên trong có thể được đưa vào mẫu ở giai đoạn đầu của phép phân tích và ở cùng thời gian hoạt động để kiểm soát quy trình tách chiết.

6.7  Thuốc thử để ngăn ngừa lây nhiễm chéo

Ngăn ngừa nhiễm chéo theo TCVN 7682 (ISO 20838).

7  Thiết bị, dụng cụ

7.1  Yêu cầu chung

Trang thiết bị phần cứng được dùng theo TCVN 11134 (ISO 22174).

Phòng thử nghiệm cần sử dụng trang thiết bị phù hợp với các phương pháp sử dụng.

7.2  Các thiết bị, dụng cụ cụ thể

Ngoài các trang thiết bị của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ nêu trong TCVN 11134 (ISO 22174), cần sử dụng các thiết bị cụ thể như sau:

7.2.1  Máy chu trình nhiệt, được trang bị

a) nguồn năng lượng phù hợp để giải phóng các phân tử huỳnh quang

b) hệ thống phát hiện thích hợp để phát hiện tín hiệu huỳnh quang được sinh ra trong quá trình PCR

Việc sử dụng các kiểm chứng bên trong cần phải có những thiết bị có thể phát hiện được những tín hiệu với bước sóng khác nhau.

7.2.2  Bình phản ứng, nắp đậy phải chịu được việc gia nhiệt lặp lại ở nhiệt độ 100 °C sau đó làm lạnh xuống 4 °C mà không ảnh hưởng đến tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong quá trình khuếch đại.

8  Mẫu phòng thử nghiệm

Chất chiết có chứa các axit nucleic tách được từ nền mẫu thích hợp với phạm vi áp dụng phù hợp với mẫu phòng thử nghiệm với điều kiện đảm bảo không gây ức chế phản ứng PCR hay ảnh hưởng đến việc phát ra tín hiệu huỳnh quang.

9  Cách tiến hành

9.1  Chuẩn bị mẫu

Việc tách chiết và/hoặc tinh sạch axit nucleic của mẫu thử cần thực hiện theo các phương pháp thích hợp, ví dụ ISO 20837.

Dung dịch axit nucleic được tạo ra cần có đủ lượng axit nucleic đích cho phân tích định lượng và có thể phát hiện được từ 1 đến 10 vi sinh vật đích hoặc đương lượng di truyền virus trong mẫu thử. Phương pháp làm giàu hoặc phương pháp cô đặc virus hoặc vi sinh vật đích dùng cho phương pháp định lượng chỉ cần một lượng nhỏ các đích trong mẫu thử.

Dung dịch axit nucleic được tạo nên chứa ít chất ức chế mà ảnh hưởng đến phản ứng PCR và các chất này không ảnh hưởng đến sự phát ra của tín hiệu huỳnh quang

CHÚ THÍCH: Huỳnh quang thường được giữ trong bình phản ứng tối màu cùng với một số chất phù hợp.

Phân tích định lượng cần có quy trình chuẩn bị mẫu để đảm bảo đủ số lượng axit nucleic của virus hoặc vi sinh vật đích có trong dung dịch axit nucleic được tạo ra được sao chép cao.

9.2  Khuếch đại

9.2.1  Yêu cầu chung

Việc khuếch đại axit nucleic đặc hiệu được thực hiện in vitro trong phòng thí nghiệm thông qua phản ứng chuỗi trùng hợp ADN polymerase với sự có mặt của các cặp mồi, oligonucleotide, chất đệm phản ứng và mẫu dò huỳnh quang trong chất đệm phản ứng xác định.

Đối với phương pháp PCR cổ điển, không cần thiết phải dùng đầu côn và ống phản ứng có màu đối với các hỗn hợp phản ứng, chỉ cần tránh nhiễm chéo do các hạt bên ngoài các bình phản ứng.

Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong quá trình khuếch đại.

ARN có thể được phát hiện khi dùng kỹ thuật real-time PCR nếu trình tự được chuyển thành trình tự ADN bổ sung bằng phương pháp phiên mã ngược.

9.2.2  Các tham số của chu trình

9.2.2.1  Mẫu dò thủy giải

Về cơ bản, quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 2 bước bao gồm bước biến tính, gắn mồi, bắt cặp với mẫu dò và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp và kéo dài

9.2.2.2  Mẫu dò lai

Quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 3 bước bao gồm bước biến tính, bắt cặp mồi và mẫu dò và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp

9.2.2.3  Mẫu dò dạng kẹp tóc

Về cơ bản, quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 3 bước bao gồm bước biến tính, gắn mồi và mẫu dò dạng kẹp tóc và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp.

9.3  Mẫu kiểm chứng

Các mẫu kiểm chứng được nêu trong TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).

Real-time PCR cho phép phát hiện cùng một lúc tín hiệu huỳnh quang của vi sinh vật gây bệnh cụ thể và của mẫu kiểm soát khuếch đại bên trong. Do đó, khi thực hiện phương pháp này cần có mẫu kiểm soát khuếch đại bên trong.

9.4  Phân tích số liệu huỳnh quang

9.4.1  Đường khuếch đại

9.4.1.1  Yêu cầu chung

Trong quá trình khuếch đại, số sản phẩm PCR phát hiện được tăng lên. Việc tăng tín hiệu huỳnh quang liên quan đến tăng các sản phẩm PCR. Điều này được hiển thị trên đường cong khuếch đại (xem Hình 4).

Đường cong khuếch đại điển hình gồm ba giai đoạn đặc trưng cho quy trình PCR.

CHÚ DẪN:

N_c số phân tử được khuếch đại

v số lượng chu trình khuếch đại

1  Pha hàm số mũ

2  Pha tuyến tính

3  Pha ổn định

Hình 4 – Đường khuếch đại

9.4.1.2  Pha 1: Pha hàm mũ

Pha hàm mũ có dải chu trình độ chụm cao đặc trưng bởi hiệu quả khuếch đại cao và không đổi. Trong pha hàm mũ, mối tương quan giữa sản phẩm PCR với nhiệt độ ban đầu được thể hiện theo Công thức (1):

N_c = N (1 + η)^v                                                                           (1)

Trong đó:

N_c là số phân tử được khuếch đại

N là số phân tử đích ban đầu

η là hiệu quả của hệ thống

v là số chu trình khuếch đại.

9.4.1.3  Pha 2: Pha tuyến tính

Pha tuyến tính đặc trưng bởi mức độ ảnh hưởng mà độ dốc của đường khuếch đại giảm đến độ ổn định. Ở thời điểm này một hoặc nhiều thành phần giảm xuống dưới nồng độ tới hạn và hiệu quả khuếch đại bắt đầu giảm. Pha được gọi là tuyến tính vì khuếch đại xấp xỉ cấp số cộng chứ không phải là cấp số nhân.

9.4.1.4  Pha 3: Pha ổn định

Ở giai đoạn này, việc khuếch đại PCR sẽ không còn và tín hiệu huỳnh quang duy trì ở trạng thái ổn định (xem Tài liệu tham khảo [4]).

9.4.2  Đánh giá dữ liệu huỳnh quang

Mẫu phân tích tạo ra đồ thị khuếch đại với ít nhất pha 1 của đường cong khuếch đại điển hình. Đường cong khuếch đại của các mẫu cắt ngang một ngưỡng xác định được thiết lập sau số chu trình nhất định. Mẫu với tính hiệu huỳnh quang trên ngưỡng được coi là dương tính.

9.4.3  Phân tích định lượng

9.4.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp định lượng xác định tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số lượng trình tự axit nucleic đích được tạo ra trong pha khuếch đại của phản ứng PCR. Phương pháp này được dùng để xác định lượng hoặc axit nucleic đích ban đầu trong mẫu

Axit nucleic đích được định lượng dựa trên đường chuẩn (stADNard curve)

Có thể dùng các phương pháp định lượng khác nếu giá trị của chúng được xác định.

9.4.3.2  Phương pháp đường chuẩn dùng cho định lượng

Có thể sử dụng gốc ADN hoặc ARN đích tinh sạch và ổn định với nồng độ đã biết để chuẩn bị đường chuẩn bằng một dãy pha loãng. Hiệu quả khuếch đại của đường cong chuẩn và axit nucleic đích phải gần giống nhau. ADN plasmid và ARN sao chép in vitro được dùng phổ biến khi xây dựng đường chuẩn.

Nồng độ đích cần nằm trong dải đường chuẩn.

Có thể áp dụng một số điểm hiệu chuẩn thích hợp và lặp lại bao trùm dải định lượng [ví dụ: có ít nhất bốn điểm với hai điểm lặp lại (tổng của các giá trị 4×2) hoặc sáu điểm hiệu chuẩn với một phép đo tại mỗi điểm (tổng là sáu giá trị)].

10  Đánh giá và tài liệu

Việc đánh giá dựa vào các kết quả thu được cùng với các mẫu chứng được quy định trong 9.3 phải chính xác.

Các kết quả PCR được liệt kê trong Bảng 2 của TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính]

[2] Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Ann. Phys. 1948, 2, p.55–75

[3] Bustin, S.A. Quantification of mARN using real-time RT-PCR: Trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 2002,29, p.23-39

[4] APPLIED BIOSYSTEMS, ABI Prism® 7900HT Sequence Detection System use’s manual. Applied Biosystems, Foster City, CA, 2001.