TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11219:2015 VỀ SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM SULFONAMIDE – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11219:2015

SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM SULFONAMIDE – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Raw bovine milk – Determination of multiple sulfonamide residues – Liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 11219:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 993.32 Multiple Sulfonamide Residues in Raw Bovine Milk. Liquid Chromatographic Method;

TCVN 11219:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM SULFONAMIDE – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Raw bovine milk – Determination of multiple sulfonamide residues – Liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định dư lượng bảy loại sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu, bao gồm sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfachloropyridazine, sulfamerazine, sulfadimethoxine và sulfaquinoxaline

Khoảng định lượng của phương pháp là từ 5 ng/ml đến 20 ng/ml.

2  Nguyên tắc

Sulfonamide trong các phần mẫu thử được chiết bằng cloroform-axeton. Sau khi làm bay hơi dung môi, phần còn lại được hòa tan trong dung dịch kali phosphat. Phần chất béo còn lại được chiết bằng hexan. Phần nước được lọc và phân tích bằng sắc ký lỏng (LC). Sulfonamide được xác định bằng đo độ hấp thụ UV ở bước sóng 265 nm. Bảy loại sulfonamide có thể được định lượng gồm bốn sulfonamide sử dụng 12% metanol và ba sulfonamide sử dụng 30% metanol trong pha động.

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích LC, trừ khi có quy định khác.

Tất cả các dung dịch LC có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng (24 °C ± 3 °C) đến 3 tháng, trừ khi có quy định khác.

3.1  Nước, đã được chưng cất và loại ion, có điện trở suất nhỏ hơn hoặc bằng 17 MΩ cm.

3.2  Dung dịch kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 0,1 M

Hòa tan 27,2 g kali dihydro phosphat vào nước đựng trong bình định mức 2 lít, thêm nước đến vạch, trộn và lọc qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 μm.

3.3  Dung môi, không có lẫn etanol đã được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh.

3.3.1  Metanol.

3.3.2  Hexan.

3.3.3  Axeton.

3.3.4  Cloroform.

CẢNH BÁO: Sử dụng cloroform trong tủ hút có thông gió. Tránh hít phải hoặc để tiếp xúc với mắt, da và áo quần. Cloroform có thể gây ung thư.

3.4  Dung môi pha động

3.4.1  Hệ dung môi pha động 12%, chuẩn bị từ metanol (3.3.1) và dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (3.2) theo tỷ lệ 12 : 88 (thể tích).

3.4.2  Hệ dung môi pha động 30%, chuẩn bị từ metanol (3.3.1) và dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (3.2) theo tỷ lệ 30 : 70 (thể tích).

Lọc metanol (3.3.1) qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 μm (4.6) trước khi trộn với dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (3.2). Nếu thiết bị LC được trang bị từ 2 bể trở lên thì bơm metanol và dung dịch kali dihydro phosphat tương ứng với các tỷ lệ phần trăm từ các bể riêng đối với hai điều kiện, nếu không, trộn trước các pha động.

3.5  Dung dịch rửa

3.5.1  Dung dịch metanol trong nước, 12% (thể tích).

3.5.2  Dung dịch metanol trong nước, 30% (thể tích).

3.5.3  Dung dịch metanol trong nước, 60% (thể tích).

Lọc metanol (3.3.1) qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 μm (4.6) trước khi trộn với nước.

3.6  Dung dịch chiết, hỗn hợp cloroform và axeton, theo tỷ lệ 2 : 1 (thể tích)

Chuẩn bị trong ngày sử dụng khoảng 100 ml cho mỗi mẫu. Đong lượng cloroform (3.3.4) và axeton (3.3.3) trong các ống đong chia vạch riêng rẽ, cho axeton vào cloroform và trộn đều. Để hỗn hợp cân bằng (từ 10 min đến 15 min) đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

3.7  Dung dịch axit clohydric (HCl), 1 M.

3.8  Chất chuẩn sulfonamide

3.8.1  Sulfadiazine (SDZ).

3.8.2  Sulfathiazole (STZ).

3.8.3  Sulfapyridine (SPD).

3.8.4  Sulfachloropyridazine (SCP).

3.8.5  Sulfamerazine (SMR).

3.8.6  Sulfadimethoxine (SDM).

3.8.7  Sulfaquinoxaline (SQX).

3.9  Các dung dịch chuẩn

3.9.1  Yêu cầu chung

Bảo quản các dung dịch chuẩn ở nhiệt độ nhỏ hơn 10 °C không quá 6 tháng. Sử dụng nước cất đã loại ion và lọc qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 μm để chuẩn bị dung dịch chuẩn sulfonamide. Để giảm thiểu nhiễm bẩn chéo, rửa dụng cụ thủy tinh trước khi sử dụng đầu tiên với dung dịch axit clohydric 1 M (3.7), sau đó tráng bằng nước cất đã loại ion (3.1) và sau đó bằng metanol (3.3.1). Tháo nắp phễu chiết để đảm bảo rửa kỹ.

3.9.2  Dung dịch chuẩn gốc

Cân khoảng 100 mg các chất chuẩn SDZ (3.8.1), STZ (3.8.2), SPD (3.8.3), SCP (3.8.4), SMR (3.8.5), SDM (3.8.6) và 10 mg chất chuẩn SQX (3.8.7) ở nhiệt độ phòng, chính xác đến 0,1 mg, chuyển định lượng sang các bình định mức 100 ml (4.14) riêng rẽ. Hòa tan trong metanol (3.3.1), siêu âm nếu cần, sau đó để dung dịch cân bằng đến nhiệt độ phòng và pha loãng bằng metanol đến vạch rồi trộn kỹ. Dung dịch gốc SQX chứa 100 μg/ml (vì ít hòa tan hơn trong metanol), các dung dịch gốc khác là 1 mg/ml.

3.9.3  Dung dịch chuẩn trung gian, 10 μg/ml

Dùng các pipet riêng rẽ (4.4) chuyển 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc SQX và 1,0 ml từng dung dịch chuẩn gốc còn lại (3.9.2) vào các bình định mức 100 ml (4.14) riêng rẽ, thêm nước (3.1) đến vạch rồi trộn kỹ.

3.9.4  Dung dịch thêm chuẩn, 1 μg/ml đối với mỗi sulfonamide

Dùng các pipet riêng rẽ (4.4) chuyển 10,0 ml mỗi dung dịch chuẩn trung gian (3.9.3) vào các bình định mức 100 ml riêng rẽ (4.14), thêm nước (3.1) đến vạch rồi trộn kỹ.

3.9.5  Dung dịch chuẩn sulfonamide

3.9.5.1  Dung dịch chuẩn sulfonamide, 200 ng/ml

Pha loãng 10,0 ml dung dịch thêm chuẩn (3.9.4) đựng trong bình định mức 50 ml (4.14) bằng nước (3.1) đến vạch và trộn kỹ.

3.9.5.2  Dung dịch chuẩn sulfonamide, 100 ng/ml

Pha loãng 10,0 ml dung dịch thêm chuẩn (3.9.4) đựng trong bình định mức 100 ml (4.14) bằng nước (3.1) đến vạch và trộn kỹ.

3.9.5.3  Dung dịch chuẩn sulfonamide, 50 ng/ml

Pha loãng 5,0 ml dung dịch thêm chuẩn (3.9.4) đựng trong bình định mức 100 ml (4.14) bằng nước (3.1) đến vạch và trộn kỹ.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Máy sắc ký lỏng (LC)

Gồm bộ bơm mẫu tự động, detector cố định bước sóng hoặc detector UV. Cột pha đảo C18 kích thước 250 mm x 4,6 mm với các pha đã khử hoạt tính (octadecyldimethylsilyl, đường kính lỗ 10 nm), cỡ hạt 5 μm, cột bảo vệ 2 cm được nhồi tương tự và bộ lọc tiền cột 0,5 μm.

Các điều kiện vận hành:

– nhiệt độ lò cột (cột C18 và cột bảo vệ): 35 °C ± 0,2 °C

– tốc độ dòng: 1,5 ml/min;

– thể tích bơm mẫu và chuẩn: 100 μl;

– thời gian chạy: 40 min;

– tốc độ ghi: 0,5 cm/min;

– bước sóng detector 265 nm.

CHÚ THÍCH: Nếu nhiệt độ phòng không ổn định thì làm ấm pha động bằng cách cho đi qua ống nối LC của bộ bơm trước qua bộ gia nhiệt cột để thu được thời gian lưu ổn định.

Làm sạch hệ thống và cột LC bằng dung dịch rửa (3.5) dùng cho pha động. Rửa cột trên 15 min với tốc độ 1,5 ml/min hoặc với tốc độ dòng thấp để qua đêm. Nếu hệ thống không sử dụng trong 1 tuần thì rửa cột bằng dung dịch metanol trong nước (3.5.3). Để phân tích tốt hơn với hệ thống sử dụng dung dịch rửa metanol trong nước, có thể để cân bằng qua đêm, nếu cần.

4.2  Bộ cô quay.

4.3  Ống nghiệm polypropylen, dung tích 50 ml, có nắp đậy kín.

4.4  Pipet, dung tích 10 ml, 1 ml và 100 μl.

4.5  Giấy lọc gấp nếp, đường kính 12,5 cm, đã được gấp nếp, loại 588, bề mặt trơn, giữ được các hạt thô, bề dày 0,215 mm, với tốc độ chảy nhanh.

4.6  Bộ lọc nylon, cỡ lỗ 0,45 μm, 47 mm và các bộ lọc đầu pipet 2 μm.

4.7  Máy trộn vortex.

4.8  Tủ lạnh đông, duy trì được nhiệt độ – 80 °C + 2°C.

4.9  Phễu cân nhỏ, khớp với bình định mức 100 ml.

4.10  Pipet định mức, dung tích 1 ml, 2 ml, 5 ml và 10 ml.

4.11  Phễu chiết, dung tích 125 ml, có nắp đậy bằng thủy tinh mài.

4.12  Phễu, cuống ngắn, đường kính 75 mm.

4.13  Bình quả lê, dung tích 100 ml, bằng thủy tinh có cổ hình côn chuẩn 24/40, có nắp.

4.14  Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml và 2 lít, loại A.^[2]

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707)^[1].

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Mẫu thử được bảo quản lạnh ở nhiệt độ dưới 10 °C. Nếu mẫu chưa được phân tích trong vòng 2 ngày đến 3 ngày thì bảo quản đông lạnh ở – 80 °C trong các ống nghiệm polypropylen (4.3) với các lượng nhỏ. Nếu không, bảo quản các phần mẫu thử đông lạnh trong tủ lạnh đông (4.8) ở nhiệt độ càng thấp càng tốt. Rã đông mẫu dưới vòi nước ấm trong ngày phân tích và lắc trộn kỹ mẫu sữa trước khi lấy để phân tích.

Khi bảo quản ở – 80°C, sữa và các dư lượng sulfonamide có thể bền được khoảng 12 tháng khi được bảo quản ở – 15°C có thể bền được khoảng 3 tháng đến 4 tháng.

6  Cách tiến hành

6.1  Chiết

Đặt giấy lọc gấp nếp (4.5) vào phễu (4.12), dùng 5 ml dung dịch chiết (3.6) để rửa bộ lọc và loại bỏ nước rửa. Dùng pipet lấy 10 ml (4.10) mẫu thử cho vào phễu chiết (4.11).

CHÚ THÍCH: Khi cần thực hiện phép thử độ thu hồi, thêm chuẩn vào các phần thử trắng bằng cách thêm 50 μl, 100 μl, hoặc 200 μl dung dịch thêm chuẩn vào 10 ml sữa đựng trong phễu chiết (4.11) (thu được các mẫu trắng thêm chuẩn chứa 5 ng/ml, 10 ng/ml hoặc 20 ng/ml).

Bổ sung 50 ml dung dịch chiết vào phần mẫu thử đựng trong phễu chiết (4.11), đậy nắp, lắc mạnh 1 min, mở hé nắp cẩn thận. Không mở van khóa vì chất khô sữa có thể làm tắc nghẽn khóa dẫn đến việc mất mẫu.

Lắc thêm 1 min, mở hé nắp và để tách pha 1 min. Lặp lại thao tác lắc liên tục và để tách pha trong 5 min. Tháo dung dịch chiết, lọc qua giấy lọc gấp nếp (4.5) và thu vào bình quả lê (4.13).

CHÚ Ý: Cẩn thận không để sữa đi vào van khóa.

Cho 25 ml dung dịch chiết vào phễu chiết (4.11) và lặp lại chính xác như trên. Sau khi lọc dịch chiết lần thứ hai vào cùng một bình quả lê (4.13), rửa sạch bộ lọc hai lần bằng 5 ml dung dịch chiết, thu lấy nước rửa vào cùng một bình quả lê nêu trên.

6.2  Chuẩn bị phần mẫu thử

Cẩn thận làm bay hơi dung dịch chiết vừa đến khô trên bộ cô quay (4.2) ở 32 °C ± 2 °C. Trong vài phút đầu tiên, điều tiết chân không để tránh tạo bọt.

Hòa tan phần còn lại trong 1 ml dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (3.2), bằng cách lắc trộn mạnh 1 min trên máy trộn Vortex (4.7).

Thêm ngay 5 ml hexan (3.3.2) và trộn 1 min trên máy Vortex (4.7). Để tách pha trong 2 min, sau đó trộn ngay thêm 1 min trên máy Vortex (4.7). Để tách pha ít nhất 15 min trước khi lấy lớp nước (phía dưới) ra.

Sử dụng pipet 1 ml (4.10), tháo ngay lớp nước và đặt ngay bộ lọc đầu tip pipet nylon lên đầu tip pipet.

CHÚ THÍCH: Lớp nước sẽ đồng nhất, vì vậy không cần thiết loại bỏ 100%, chỉ cần 50% đến 75% lớp nước là đủ cho 2 hai lần bom.

Lọc lớp nước vào ống nghiệm thủy tinh hoặc lọ bơm mẫu tự động (hoặc chia nhỏ thành 2 lọ nếu sử dụng 2 hệ thống sắc ký lỏng).

Các phần mẫu thử đã chuẩn bị có thể được bảo quản trong lọ bơm mẫu tự động ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc đựng trong các lọ bơm kín giữ ở nhiệt độ nhỏ hơn 10 °C đến 24 h trước khi bơm.

6.3  Hệ thống sắc ký

Sử dụng hai hệ thống pha động để phân giải bảy loại sulfonamide:

– Hệ dung môi pha động 12% (3.4.1) đối với SDZ, STZ, SPD, SMR.

– Hệ dung môi pha động 30% (3 4.2) đối với SCP, SDM và SQX.

Thiết lập 2 hệ thống LC riêng biệt cho 2 pha động hoặc nếu chỉ có sẵn một hệ thống LC thì phân tích các dịch mẫu dịch chiết sử dụng hệ dung môi pha động 12% đầu tiên, sau đó cân bằng 1 h với hệ dung môi pha động 30% và phân tích các phần mẫu thử chiết còn lại. Cân bằng lại hệ dung môi pha động 12% trong vài giờ hoặc qua đêm với tốc độ dòng giảm. Để tối ưu hóa độ phân giải cho các cột LC và máy bơm khác nhau, thay đổi nồng độ metanol trong pha động trong khoảng từ 10% đến 30%.

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng các hệ dung môi pha động 12% và 30% làm giảm thiểu ảnh hưởng nền và cung cấp độ phân giải đầy đủ cho tất cả bảy sulfonamide, nhưng không nhất thiết phải phản ánh độ phân giải tốt nhất cho từng sulfonamide.

6.4  Đường chuẩn

Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống trước khi xác định bằng cách bơm 100 μl các dung dịch chuẩn sulfonamide nồng độ 5, 10 và 20 ng/ml lặp lại theo cả hai điều kiện LC. Chuẩn bị bảy đường chuẩn sử dụng chiều cao pic.

6.5  Xác định mẫu

Bơm lặp lại hai lần 100 μl dịch chiết phần mẫu thử đã hòa tan lại (5.3) vào hệ thống LC.

7  Tính kết quả

Tính hệ số hồi quy tuyến tính, sử dụng hồi quy bình phương nhỏ nhất cho mỗi sulfonamide cần xác định (nồng độ với chiều cao pic) sử dụng công thức sau:

Y = mX + b

Sau đó, xác định nồng độ mỗi sulfonamide có trong mẫu thử, X, từ phương trình, trong đó Y là chiều cao pic tại thời gian lưu sulfonamide của dịch chiết mẫu tương ứng.

CHÚ THÍCH: Phần cặn khô chiết được từ 10 ml các phần mẫu thử được hòa tan lại trong thể tích cuối cùng 1 ml, do đó, việc phân tích dịch chiết cuối cùng 100 ng/ml là tương đương với chất phân tích nồng độ 10 ng/ml.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn và các chi tiết bất thường khác có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 đưa ra các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về chấp nhận phương pháp.

Bảng A.1 – Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu

[2] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức