TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11370:2016 VỀ THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG ETHOXYQUIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP 2 LẦN KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11370:2016

THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG ETHOXYQUIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

Fish and fishery products – Determination of ethoxyquin residues – Chromatography tandem mass spectrometric method (LC-MS/MS)

Lời nói đầu

TCVN 11370:2016 do Trung tâm Chất lượng nông lâm thủy sản vùng 6 – Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và thủy sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG ETHOXYQUIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

Fish and fishery products – Determination of ethoxyquin residues – Chromatography tandem mass spectrometric method (LC-MS/MS)

CẢNH BÁO – khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng để xác định dư lượng ethoxyquin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS).

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 μg/kg.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

Dư lượng ethoxyquin trong mẫu thử được chiết bằng acetonitrile. Dịch chiết được làm sạch bằng magie sulfat, bột C18 và đưa vào phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ LC-MS/MS để xác định và định lượng hàm lượng ethoxyquin có trong mẫu.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác.

4.1  Chất chuẩn ethoxyquin, tinh khiết lớn hơn hoặc bằng 99 %.

4.2  Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho LC-MS.

4.3  Nước, loại dùng cho LC-MS.

4.4  Metanol (CH₃OH), loại dùng cho LC-MS.

4.5  Natri clorua (NaCI).

4.6  Chất hấp phụ amin (PSA – Primary secondary amin), cỡ hạt 40 μm.

4.7  Magie sulfat(MgSO₄), khan.

4.8  Axít formic (CH₂O₂), tinh khiết lớn hơn hoặc bằng 99 %.

4.9  4 – Hydroxybenzoic acid propyl ester (Propyl paraben), ≥ 99 %.

4.10  Chất hấp phụ C18, kích thước hạt 40 μm;

4.11  Dung dịch chất chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester gốc 1000 mg/l

Cân 10 mg chất chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester (4.9) vào bình định mức dung tích 10 ml (5.18). Hòa tan và định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 1 năm.

CHÚ THÍCH:

Tùy thuộc vào lượng cân, độ tinh khiết của chất chuẩn, tính toán lại nồng độ chuẩn thực tế. 4-hydroxybenzoic acid propyl ester được sử dụng là chất nội chuẩn.

4.12  Dung dịch chất chuẩn 4 – hydroxybenzoic acid propyl ester trung gian 100 mg/l

Hút 1 ml dung dịch chất chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester 1000 mg/l (4.11) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 1 năm.

4.13  Dung dịch chất chuẩn 4 – hydroxybenzoic acid propyl ester trung gian 10 mg/l

Hút 1 ml dung dịch chất chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester 100 mg/l (4.12) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitrll (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 6 tháng.

4.14  Dung dịch chất chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester trung gian 400 μg/l

Hút 0,4 ml dung dịch chất chuẩn trung gian có nồng độ 10 mg/l (4.13) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 1 tháng

4.15  Dung dịch chất chuẩn ethoxyquin gốc 1000 mg/l

Cân khoảng 20 mg chất chuẩn ethoxyquin (4.1) vào bình định mức dung tích 10 ml (5.18). Hòa tan và định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2)

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 1 năm.

CHÚ THÍCH:

Tùy thuộc vào lượng cân, độ tinh khiết của chất chuẩn, tính toán lại nồng độ chuẩn thực tế

4.16  Dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 100 mg/l

Hút 1 ml dung dịch chất chuẩn ethoxyquin gốc 1000 mg/l (4.15) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 6 tháng.

4.17  Dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 10 mg/l

Hút 1 ml dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 100 mg/I (4.16) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 3 tháng.

4.18  Dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 1 mg/l

Hút 1 ml dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 10 mg/l (4.17) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 3 tháng.

4.19  Dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 0,2 mg/l

Hút 2 ml dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 1 mg/l (4.18) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 1 tháng.

4.20  Dung dịch chất chuẩn ethoxyquin dùng để chuẩn bị mẫu kiểm soát 0,02 mg/l

Hút 1 ml dung dịch chất chuẩn ethoxyquin trung gian 0,2 mg/l (4.19) cho vào bình định mức 10 ml (5.18), định mức đến vạch bằng axetonitril (4.2).

Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.20) ở nhiệt độ phòng, dung dịch bền trong 1 tháng.

4.21  Dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn: Pha nội chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester trong axetonitril (4.2) ở nồng độ 10 μg/l và chuẩn ethoxyquin ở các nồng độ: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 μg/l, cụ thể như sau:

Lấy 6 bình định mức 10 ml (5.18) ký hiệu S1, S2, S3, S4, S5, S6 thêm vào mỗi bình 250 μl dung dịch nội chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester 400 μg/l (4.14.)

Thêm lần lượt 25; 50; 100; 200; 400 μl dung dịch chuẩn ethoxyquin trung gian 0,2 mg/l (4.19) vào các bình S2, S3, S4, S5, S6.

Định mức tới vạch bằng axetonitril (4.2).

Dung dịch được chuẩn bị mới mỗi lần phân tích.

4.22  Dung dịch axetonitril và nước tỉ lệ 20 : 80 (thể tích / thể tích)

Lấy 20 ml axetonitril (4.2) cho vào bình định mức 100 ml (5.18), định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều. Dung dịch pha trước khi sử dụng.

4.23  Dung dịch axit formic 0,1 % (thể tích / thể tích)

Hút 1 ml dung dịch axit formic (4.8) cho vào bình định mức 1000 ml (5.18) và định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều, lọc bằng bộ lọc dung môi thủy tinh (5.15) và đuổi khí bằng cách siêu âm dung dịch trong bể siêu âm (5.6) 5 min trước khi sử dụng.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:

5.1  Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS

– Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng;

– Đầu dò MS-MS;

– Máy tính và phần mềm phân tích;

– Cột sắc ký pha đảo C18 1,8 μm, 2.1 x 100 mm có gắn cột bảo vệ cùng loại.

5.2  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg.

5.3  Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.

5.4  Tủ lạnh đông, có thể hoạt động liên tục ở nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng âm 18 ^oC.

5.5  Máy ly tâm, tốc độ tối thiểu 4000 r/min, ly tâm được ống 15 ml và 50 ml.

5.6  Bể siêu âm.

5.7  Hệ thống làm khô dung môi, dùng khi nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ;

5.8  Máy lắc mẫu, tốc độ tối thiểu 3000 r/min.

5.9  Pipet pasteur, 150 mm, 3ml.

5.10  Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 10 ml.

5.11  Ống ly tâm nhựa, dung tích 15; 50 ml có nắp.

5.12  Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml có nắp và đệm PTFE.

5.13  Đầu tip, dung tích 100; 200; 1000; 5000 μl;

5.14  Máy xay mẫu;

5.15  Bộ lọc dung môi bằng thủy tinh;

5.16  Micropipet, dung tích 100; 200; 1000; 5000 μl;

5.17  Bộ lấy dung môi tự động, thể tích 25 ml, điều chỉnh được;

5.18  Bình định mức thủy tinh, cấp chính xác loại A, dung tích 10 ml, 100 ml và 1000 ml;

5.19  Cốc thủy tinh, dung tích 250; 500; 1000 ml.

5.20  Chai thủy tinh tối màu, dung tích 15; 250; 500; 1000 ml.

5.21  Chai nhựa tối màu, dung tích 250 ml.

5.22  Màng lọc dung môi, đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,2 μm bằng PTFE;

5.23  Đầu lọc mẫu dùng ngay, đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,2 μm, làm bằng PTFE;

5.24  Xy lanh tiêm, 1ml.

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này. Mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong quá trình vận chuyển, bảo quản.

Mẫu được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ nhỏ hơn âm 18 ^oC cho đến khi xử lý

7  Cách tiến hành

7.1  Yêu cầu chung

Toàn bộ quy trình phân tích cần được thực hiện trong ngày.

7.2  Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu trước khi đồng nhất phải được rã đông: Chuyển mẫu từ tủ đông để rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 min hoặc giữ nguyên bao gói kín xả dưới vòi nước trong 10 min.

Lấy phần ăn được của thủy sản và sản phẩm thủy sản cắt thành từng miếng nhỏ, đồng hóa mẫu bằng máy xay mẫu (5.14). Chuyển mẫu đã đồng nhất sang dụng cụ đựng mẫu, đậy nắp kín và lưu trữ ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng âm 18 ^oC. Khi thực hiện phân tích, phải đưa mẫu về nhiệt độ phòng.

Cân (2,0 ± 0,1) g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm nhựa 50 ml (5.11).

7.2.1  Chuẩn bị mẫu trắng và mẫu dựng đường chuẩn

Cân 07 mẫu, mỗi mẫu (2,0 ± 0,1) g mẫu trắng đã đồng nhất vào 07 ống ly tâm nhựa 50 ml (5.11).

7.2.2  Chuẩn bị mẫu kiểm soát 0,9 μg/kg

Cân (2,0 ± 0,1) g mẫu trắng đã đồng nhất vào ống ly tâm nhựa 50 ml (5.11), thêm 90 μl dung dịch ethoxyquin dùng để chuẩn bị mẫu kiểm soát 0,02 mg/l (4.20), trộn đều bằng máy lắc mẫu trong 2 min.

Thực hiện tối thiểu một mẫu kiểm soát trong một lô mẫu.

Độ thu hồi của mẫu kiểm soát tham khảo phụ lục A.

7.2.3  Bổ sung nội chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester

Thêm vào các ống ly tâm nhựa chứa mẫu phân tích, mẫu trắng, mẫu kiểm soát 50 μl dung dịch nội chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester 400 ng/ml (4.14). Lắc bằng máy lắc mẫu (5.8) trong 30 s, để 15 min trước khi tiến hành phân tích.

7.3  Chiết tách

7.3.1  Chiết mẫu

Cho 1 ml nước vào các ống chứa mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử và mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn, đậy nắp, lắc mạnh bằng tay và thêm 10 ml axetonitril (4.2).

Trộn đều bằng máy lắc mẫu (5.8) trong 1 min và siêu âm 15 min.

Thêm vào mỗi ống 1 g natri clorua (4.5), 2 g magie sulfat (4.7), đậy kín nắp, lắc mạnh bằng tay trong 1 min.

Ly tâm trong 4 min ở tốc độ 4000 r/min.

Dùng micropipet chuyển 5 ml lớp trên sang ống ly tâm nhựa 15 ml (5.11) có chứa sẵn 900 mg magie sulfat(4.7), 150 mg chất hấp phụ amin (4.6) và 100 mg chất hấp phụ C18 (4.10), đậy nắp, lắc mạnh bằng tay trong 2 min.

Ly tâm trong 4 min ở tốc độ 4000 r/min.

Hút 3 ml lớp trên vào ống ly tâm thủy tinh 10 ml (5.10). Bay hơi dung môi đến khô bằng bộ làm khô dung môi bằng khí nltơ ở nhiệt độ không quá 40 ^oC.

7.3.2  Xử lý dịch chiết

Đối với mẫu trắng, mẫu kiểm soát và mẫu thử hoà tan phần cặn bằng 1 ml dung dịch axetonitril và nước (4.22).

Đối với mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn thêm 1 ml các dung dịch chất chuẩn làm việc tương ứng (S1, S2, S3, S4, S5, S6) vào 6 ống ly tâm thủy tinh.

Lắc kỹ bằng máy lắc trong 30 s, lọc dịch chiết qua đầu lọc mẫu dùng ngay (5.23) bằng xylanh tiêm 1 ml (5.24). Thu dịch sau lọc vào lọ đựng mẫu (5.12), đậy kín nắp, phân tích trên LC-MS/MS.

7.4  Điều kiện phân tích của LC-MSMS

7.4.1  Yêu cầu chung

Đảm bảo các píc sắc ký có dạng phân bố Gauss, thời gian lưu (t_R) của ethoxyquin phải bằng hoặc lớn hơn hai lần thể tích chết của cột. Mỗi chất phân tích thu được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con. Không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.

7.4.2  Điều kiện phân tích với LC (tham khảo phụ lục B)

7.4.3  Điều kiện trên đầu dò MS/MS (tham khảo phụ lục C)

7.4.5  Trình tự bơm mẫu (tham khảo)

Dung môi (pha động); các dung dịch chuẩn; mẫu trắng; mẫu kiểm soát; mẫu thử. Sau 10 mẫu phải bơm lại một điểm chuẩn hoặc mẫu kiểm soát (7.2.2).

7.5. Xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn được xây dựng dưới dạng y = ax + b dựa trên tỉ số S_S/S_IS (y) theo C_S/C_IS (x) với:

S _S, C _S là diện tích píc và nồng độ của ethoxyquin;

S _IS, C _IS là diện tích píc và nồng độ chất nội chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester.

Giá trị hệ số chặn nên gần giá trị 0 và hệ số tương quan hồi quy (r²) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

8  Tính kết quả

8.1  Hàm lượng ethoxyquin trong mẫu thử

Hàm lượng ethoxyquin, X, biểu thị bằng microgam trên kilogam (μg/kg), được tính theo công thức:

X = X₀ x F

trong đó:

X₀ là nồng độ ethoxyquin trong mẫu thử được xác định theo đường chuẩn (7.5), tính bằng microgam trên kilogam (μg/kg);

F là hệ số pha loãng mẫu.

CHÚ THÍCH:

Khi pha loãng mẫu cần pha bằng dung dịch nội chuẩn 4-hydroxybenzoic acid propyl ester 10 μg/l.

8.2  Biểu diễn kết quả

Kết quả thử nghiệm được báo cáo với một chữ số thập phân, đơn vị tính là μg/kg.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– Kết quả thử nghiệm;

– Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– Phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– Tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm

1. Hệ số hồi quy tuyến tính (r²) của đường chuẩn:

Phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

2. Độ thu hồi của mẫu kiểm soát:

Độ thu hồi của mẫu kiểm soát phải nằm trong khoảng quy định trong bảng 1

Bảng 1 – Quy định về độ thu hồi

3. Độ lệch cường độ ion tương đối:

Độ lệch cường độ ion tương đối phải nằm trong giới hạn theo bảng 6

Bảng 2 – Giới hạn tối đa độ lệch cường độ ion tương đối

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Điều kiện phân tích trên LC

Bảng 3 – Điều kiện gradient cho hệ thống LC

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

Điều kiện phân tích trên đầu dò MS/MS

Bảng 4-Điều kiện phân mảnh MS-MS

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] AOAC 2007.01, Pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate. Gas chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography /tandem mass spectrometry.

[2] Journal of Agricultural and Food Chemistry 2010, 58, 5959-5972.

[3] Ethoxyquin and its oxidation products in fish meals, fish feeds and farmed fish” by Ping He and R GAckman Canadian Institute of Fisheries Technology, DalTech, Dalhousie University, Halifax, NS, B3J 2X4, Canada