TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11493:2016 VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRANS-GALACTOOLIGOSACARID (TGOS) – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11493:2016

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRANS-GALATOOLIGOSACARID (TGOS) – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Foodstuffs – Determination of trans-galactooligosaccharides (TGOS) – Ion-exchange chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 11493:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2001.02 Determination of trans-galactooligosaccharides (TGOS) in selected food products. Ion-exchange chromatography;

TCVN 11493:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRANS-GALATOOLIGOSACARID (TGOS) – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Foodstuffs – Determination of trans-galactooligosaccharides (TGOS) – Ion-exchange chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký trao đổi ion để xác định hàm lượng trans-galactooligosacarid (TGOS) được bổ sung vào thực phẩm.

2  Nguyên tắc

Trans-galactooligosacarid (TGOS) và lactose được chiết ra khỏi phần mẫu thử bằng dung dịch đệm phosphat nóng. Dịch chiết được xử lý với β-galactosidase để thủy phân TGOS và lactose. Phân tích cả dung dịch ban đầu và dung dịch đã xử lý, sử dụng sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao có detector xung ampe (HPAEC-PAD). Trong phép thử đầu tiên, galactose và lactose tự do được xác định trong dung dịch thử ban đầu. Trong phép thử thứ hai, hàm lượng galactose tổng số được giải phóng ra khỏi TGOS và lactose được xác định trong dung dịch đã xử lý. TGOS được tính từ nồng độ của lactose và galactose.

3  Thuốc thử

Trong suốt quá trình phân tích, chỉ sử dụng các loại thuốc thử đạt chất lượng phân tích và chỉ sử dụng nước ít nhất là loại 3 TCVN 4851:1999 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử, trừ khi có quy định khác.

3.1  Dung dịch đệm phosphat, 0,2 M, pH 6,0.

Hòa tan 22,0 g dikali hydrophosphat (KH₂PO₄) và 6,0 g dikali hydrophosphat ngậm ba phân tử nước (K₂HPO₄.3H₂O) trong nước và thêm nước đến 1 lít. Khử trùng 30 min ở 120 °C trong nồi hấp áp lực.

3.2  Dung dịch axit clohydric (HCl), 1 M.

Pha loãng 8,3 ml axit clohydric đặc (nồng độ 36,5 % đến 38 %) bằng nước đến 1 lít.

3.3  Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 50 %, không chứa cacbonat, tỷ trọng 1,54 kg/lít.

Thêm 100 ml nước vào bình chứa 100 g natri hydroxit chứa natri cacbonat (Na₂CO₃) nồng độ nhỏ hơn 1 %. Đậy nắp bình và lắc cho đến khi dung dịch hòa tan hết. Để yên cho đến khi natri cacbonat lắng lại, để cho dung dịch trong (khoảng 10 ngày). Đậy kín bình khi không sử dụng.

3.4  Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 1 M.

Pha loãng 54 ml dung dịch natri hydroxit (3.3) đến 1 lít bằng nước không chứa cacbonic.

3.5  Dung dịch β-galactosidase, 2000 U/ml 1).

Hòa β-galactosidase khoảng 50 000 U/g có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus oryzae trong dung dịch đệm phosphat (3.1) để thu được hoạt độ cuối cùng 2000 U/ml. Mỗi đơn vị β-galactosidase thủy phân 1,0 μmol o-nitrophenyl-β-D-galactoside thành o-nitrophenol và D-galactose ở pH 4,5, nhiệt độ 25 °C. Bảo quản huyền phù trong tủ lạnh khi chưa sử dụng. Khuấy kỹ huyền phù trước khi sử dụng. Sử dụng huyền phù enzym trong vòng 8 h kể từ khi chuẩn bị.

3.6  Axetonitril, loại dùng cho LC.

3.7  Dung dịch axetonitril, 20 % (tính theo thể tích).

Pha loãng 200 ml axetonitril (3.6) bằng nước đến 1 lít.

3.8  Dung dịch axetonitril, 3 % (tính theo thể tích).

Pha loãng 30 ml axetonitril, (3.6), bằng nước đến 1 lít.

3.9  Natri axetat (NaCH₃COO), khan.

3.10  Pha động A, dung dịch natri hydroxit 12,5 mM, không chứa cacbonat.

Khử khí 2 lít nước trong lọ, dùng bộ khử khí, trong ít nhất 15 min bằng khí heli (3.15) hoặc đặt bình lọc chứa đầy 2 lít nước vào bể siêu âm với chân không trong 10 min. Không lắc hoặc trộn, dùng pipet lấy 1,30 ml dung dịch natri hydroxit 50 % (3.3) cho vào nước đã khử khí. Tiếp tục khử khí dung dịch trong 30 min trước khi sử dụng.

3.11  Pha động B, dung dịch natri hydroxit, 125 mM, Không chứa cacbonat.

Chuẩn bị như trong (3.10), nhưng thêm 13,9 ml natri hydroxit 50 % (3.3) vào 2 lít nước đã khử khí thay vì thêm 1,30 ml dung dịch natri hydroxit. Khử khí dung dịch trong 30 min trước khi sử dụng.

3.12  Pha động C, dung dịch natri hydroxit (NaOH), 125 mM, không chứa cacbonat, và natri axetat 500 mM.

Hòa tan 82,04 g natri axetat (3.9) trong 2 lít nước đã khử khí và lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,2 μm (4.17). Thêm 13,9 ml natri hydroxit 50 % (3.3) vào dịch lọc. Khử khí dung dịch 30 min trước khi sử dụng.

3.13  Galactose, khan.

3.14  Lactose, ngậm một phân tử nước (bền ở 103 °C).

3.15  Khí heli, độ tinh khiết 99,996 %.

3.16  Dung dịch chuẩn gốc đường

Sấy các chất chuẩn galactose và lactose ngậm một phân tử nước trong khoảng 4 h ở 103 °C trong tủ sấy (4.18) có đối lưu đến khối lượng không đổi.

Cân chính xác 80 mg galactose (3.13) (S₁) và chuyển vào bình định mức 100 ml. Hòa tan trong nước và thêm nước đến vạch (nồng độ galactose là 0,8 mg/ml).

Chuẩn bị tương tự đối với dung dịch gốc lactose (nồng độ lactose khan là 1,425 mg/ml) bằng cách cân 150 mg lactose (S’₂) ngậm một phân tử nước (3.14). Nhân S’₂ với 0,95 để có khối lượng lactose khan (S₂).

3.17  Dung dịch chuẩn làm việc

Pha loãng 5,00 ml cả dung dịch chuẩn gốc galactose và lactose trong bình định mức bằng nước đến 1 lít (WS₁). Lặp lại thao tác này với 10,00 ml (WS₂), 15,00 ml (WS₃), và 20,00 ml (WS₄) của dung dịch chuẩn gốc S₁ và S₂ tương ứng để tạo được 1 lít từng dung dịch chuẩn làm việc, xem Bảng 1.

Bảng 1 – Các dung dịch chuẩn làm việc

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Máy sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao (HPAEC), gồm có các bộ phận:

– Bơm gradient dùng cho sắc ký lỏng;

– Bộ khử khí;

– Van bơm micro;

– Detector điện hóa xung ampe (điện cực bằng vàng đường kính 1,0 mm và điện cực chuẩn kết hợp bạc-bạc clorua (Ag-AgCI), thân của cuvet bằng titan làm điện cực máy đối) làm việc ở chế độ detector xung ampe (PAD);

– Bộ bơm mẫu tự động;

– Bộ phân tích dữ liệu.

4.2  Cột sắc ký, bằng nhựa trao đổi ion CarboPac PA-1 Pellicular, dài 250 mm, đường kính trong 4 mm, có cột bảo vệ dài 50 mm, đường kính trong 4 mm, được nhồi các hạt gồm ethylvinylbenzen- divinylbenzen sulfonat hóa hoặc loại tương đương.

4.3  Máy đo pH

4.4  Lọ nhỏ bằng chất dẻo, dung tích 50 ml, có nắp vặn, bền với nhiệt độ đến 100 °C.

4.5  Nồi cách thủy, có bộ phận lắc, duy trì ở 60 °C ± 2 °C và 80 °C ± 2 °C.

4.6  Bể đá lạnh.

4.7  Xyranh, dung tích 10 ml, tạo áp suất thấp, dùng cho bộ lọc màng cỡ lỗ 25 mm, có màng lọc cỡ lỗ 0,2 μm.

4.8  Pipet, có các dung tích 20 μl, 100 μl, và 1000 μl có đầu tip dùng một lần.

4.9  Pipet pasteur dùng một lần, kích thước 146 mm.

4.10  Máy li tâm phòng thử nghiệm, để giữ các ống nghiệm nhỏ; vận hành ở gia tốc 11 000 x g.

4.11  Máy li tâm, để giữ các ống dung tích 30 ml; vận hành ở gia tốc 1 000 x g.

4.12  Máy pha loãng, có thể phân phối dung dịch lặp lại với độ chính xác ± 1 %.

4.13  Ống nghiệm nhỏ (microtubes), bằng polypropylen, dung tích 1,5 ml, có nắp vặn.

4.14  Ống nghiệm, bằng chất dẻo, dung tích 15 ml, có nắp vặn.

4.15  Máy làm sạch bằng siêu âm, có khả năng khử khí.

4.16  Máy trộn Vortex.

4.17  Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,2 μm.

4.18  Tủ sấy.

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

6  Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm dạng lỏng ngay trước khi phân tích. Cắt nhỏ hoặc nghiền nhỏ mẫu cứng sao cho lọt qua sàng cỡ lỗ 1 mm² (sàng số 18).

7  Cách tiến hành

7.1  Các điều kiện vận hành HPAEC

Các điều kiện vận hành sau đây cho thấy thích hợp:

– Nhiệt độ cột, từ 20 °C đến 30 °C, sai số cho phép ± 0,5 °C, tốt nhất là (20 ± 0,5) °C;

– Tốc độ dòng 1,0 ml/min;

– Thể tích bơm: 20 μl;

– Độ nhạy detector, dải từ 1 μC đến 3 μC.

Xem Bảng 2 đối với gradient rửa giải và Bảng 3 đối với chương trình thời gian của detector. Các thông số có thể thay đổi để tối ưu hóa sắc ký.

Bảng 2 – Gradient rửa giải dùng cho phép phân tích HPAEC-PAD

Bảng 3 – Chương trình detector đối với phép phân tích HPAEC-PAD

7.2  Chiết

Xem Hình 1 về sơ đồ chiết và thủy phân.

Mẫu thử

Tổng TGOS + lactose khoảng 0,1 g đến 0,3 g

Hòa tan chất chiết

Dung dịch đệm phosphat nóng (khoảng 80 °C), 40 ml, pH 6,0 trong 30 min ở 80 °C

Hình 1 – Sơ đồ phương pháp TGOS sử dụng enzym

Cân lọ bằng chất dẻo rỗng, dung tích 50 ml có nắp vặn (M₁), chính xác đến 1 mg. Cân lượng mẫu thử, tương ứng với khoảng 0,1 g đến 0,3 g tổng TGOS và lactose, nhưng không được quá 10 g phần mẫu thử, chính xác đến 1 mg, cho vào lọ này (M₂ chỉ gồm khối lượng tịnh của phần mẫu thử). Thêm khoảng 40 ml dung dịch đệm phosphat nóng (khoảng 80 °C) (3.1), đậy nắp lọ và trộn đều. Giữ lọ ở 80 °C ± 2 °C trong nồi cách thủy (4.5) có khuấy liên tục trong 30 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng trong bể đá lạnh (4.6). Đo và chỉnh pH khoảng từ 5,7 đến 6,3 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M (3.4) hoặc dung dịch axit clohydric 1 M (3.2), nếu cần. Pha loãng dung dịch thử đến khoảng 50 ml bằng dung dịch đệm phosphat (3.1). Cuối cùng, cân lọ gồm cả nắp và dung dịch (M₃), chính xác đến 1 mg, sau đó xác định khối lượng tịnh của chất chiết thử nghiệm.

7.3  Thủy phân bằng enzym

7.3.1  Dung dịch đã xử lý

Cân lọ bằng chất dẻo rỗng gồm cả nắp vặn (M₄), chính xác đến 1 mg. Chuyển 20 g chất chiết thử nghiệm từ 7.2 vào lọ và xác định khối lượng tịnh của chất chiết thử nghiệm (M₅). Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch β-galactosidase (3.5) cho vào lọ này, đậy nắp và trộn đều nhẹ.

7.3.2  Dung dịch thử ban đầu

Cân lọ bằng chất dẻo rỗng gồm cả nắp vặn (M₇), chính xác đến 1 mg. Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch β-galactosidase (3.5) và 1 ml dung dịch đệm phosphat (3.1), cho vào lọ này. Khử hoạt tính enzym bằng cách đun nóng 10 min trong nồi cách thủy ở khoảng 100 °C. Làm nguội và cân 20 g chất chiết thử nghiệm (7.2) vào lọ (M₈, chỉ gồm khối lượng tịnh của dung dịch thử), đậy nắp và trộn đều.

7.3.3  Ủ ấm cả enzym hoạt tính và enzym bất hoạt chứa các chất chiết trong 30 min ở 60 °C ± 2 °C có khuấy nhẹ liên tục, đo thời gian từ khi làm ấm đến khi hỗn hợp đạt 60 °C. Tránh hình thành bọt hoặc bọt khí trong khi lắc. Dùng bể đá lạnh (4.6) để làm nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 5 ml axetonitril 20 % (3.7) vào dung dịch đã xử lý chứa enzym hoạt tính, trộn đều và cân lọ đã đậy kín (M₆). Thêm 4 ml axetonitril 20 % (3.7) vào dung dịch thử ban đầu chứa enzym bất hoạt, trộn đều và cân lọ đã đậy kín (M₉). Ly tâm tất cả các dung dịch ở 10 000 g trong 10 min và lọc dịch nổi phía trên qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,2 μm (4.17). Dùng dịch lọc để đo nồng độ. Các chất chiết chứa enzym bất hoạt được gọi là A₁ và các chất chiết thủy phân được gọi là A₂.

7.4  Xác định lactose và galactose

7.4.1  Chuẩn bị dung dịch thử để phân tích HPAEC-PAD

Pha loãng dịch lọc đã ly tâm (7.3) bằng axetonitril 3 % (3.5) sao cho hàm lượng galactose và lactose trong phạm vi dải nồng độ dung dịch chuẩn làm việc. Có thể cần sử dụng 3 hệ số pha loãng khác nhau, phụ thuộc vào bản chất của mẫu thử. Các giá trị hướng dẫn và ký hiệu về độ pha loãng được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 – Các giá trị hướng dẫn đối với độ pha loãng dùng cho phép phân tích HPAEC-PAD

7.4.2  Xác định

Sử dụng cùng một dạng tích phân đối với dung dịch thử và các dung dịch chuẩn làm việc bằng cách chọn cùng chiều rộng pic, cùng ngưỡng thiết lập và cùng các thông số tích phân khác. Kiểm soát cẩn thận việc lựa chọn đường nền bằng cách kéo dài đường nền đến pic. Dùng diện tích pic để định lượng.

Đầu tiên chạy 4 dung dịch chuẩn hiệu chuẩn của từng loại đường để thiết lập tuyến tính. Sau đó lặp lại với 4 dung dịch chuẩn. Cứ giữa hai bộ dung dịch chuẩn, thì chạy 9 dung dịch thử [ví dụ, WS₁, WS₂, WS₃, WS₄, dung dịch thử ban đầu 1A₁ (hệ số pha loãng D₁), dung dịch thử ban đầu 1A₁ (hệ số pha loãng D₃), dung dịch đã xử lý 1A₂, dung dịch thử ban đầu 2A₁ (hệ số pha loãng D₁), dung dịch thử ban đầu 2A₁ (D₃), dung dịch đã xử lý 2A₂, dung dịch thử ban đầu 3A₁ (D₁), dung dịch thử ban đầu 3A₁ (D₃), dung dịch đã xử lý 3A₂, WS₁, WS₂, WS₃, WS₄, dung dịch thử ban đầu 4A₁ (D₁), dung dịch thử ban đầu 4A₁ (D₃), dung dịch đã xử lý 4A₂, v.v…]. Tiếp tục quy trình này cho đến khi tất cả các dung dịch thử được phân tích. Sử dụng hệ số đáp ứng trung bình từ các dung dịch chuẩn cũng như dung dịch thử để tính nồng độ đường trong từng dung dịch thử.

7.4.3  Khả năng gây nhiễu

Galactose là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hàm lượng TGOS trong sản phẩm. Sự không chính xác trong phép xác định galactose sau khi thủy phân bằng enzym trong mẫu thử có hàm lượng lactose cao như các sản phẩm ngũ cốc và các sản phẩm dạng bột chứa sữa có thể ảnh hưởng đến phép đo galactose được giải phóng từ TGOS. Thủy phấn không chọn lọc các alpha-galactan (ví dụ: bột carob) bằng β-galactosidase cũng có thể xảy ra làm cho kết quả không ổn định. Chỉ sử dụng chế phẩm enzym mới.

8  Tính kết quả

8.1  Hàm lượng galactose ban đầu (galactose tự do)

Hàm lượng galactose ban đầu (galactose tự do) trong mẫu thử, G_b, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), được tính bằng Công thức (1):

                                            (1)

Trong đó

D₁  là hệ số pha loãng của galactose trong phép phân tích A₁;

C_Gb  là số miligam galactose trong một kilôgam trong dung dịch thử ban đầu A₁;

M₇ là khối lượng của lọ rỗng và nắp (7.3.2) tính bằng gam (g);

M₈ là khối lượng của dung dịch thử, tính bằng gam (g);

M₉ là khối lượng lọ chứa dung dịch thử ban đầu và nắp sau khi bổ sung axetonitril (7.3.2), tính bằng gam (g);

F là hệ số được tính bằng Công thức (2):

                                                               (2)

Trong đó

M₁  là khối lượng lọ rỗng cùng với nắp (7.2), tính bằng gam (g);

M₂  là khối lượng tịnh của phần mẫu thử (7.2), tính bằng gam (g);

M₃  là khối lượng tịnh của chất chiết (7.2), tính bằng gam (g).

8.2  Hàm lượng lactose

Hàm lượng lactose trong mẫu thử, L_b, tính bằng gam trên 100 g, được tính bằng Công thức (3):

                                            (3)

Trong đó

C_Lb  là số miligam lactose trong một kilôgam dung dịch thử ban đầu trong phép phân tích A₁;

D₃  là hệ số pha loãng của lactose trong phép phân tích A1.

Xem thêm các giải thích trong 8.1.

8.3  Hàm lượng galactose tổng số

Hàm lượng galactose tổng số của dung dịch thủy phân A₂, G_t, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), được tính bằng Công thức (4):

                                             (4)

Trong đó

C_Gt  là số miligam galactose trong một kilôgam dung dịch đã được xử lý trong phép phân tích A₂;

F  là hệ số được tính bằng Công thức (2);

D₂  là hệ số pha loãng của galactose trong phép phân tích A2;

M₄  là khối lượng của lọ rỗng và nắp (7.3.1) tính bằng gam (g);

M₅  là khối lượng tịnh của chất chiết thử nghiệm (7.3.1), tính bằng gam (g);

M₆ là khối lượng lọ chứa dung dịch xử lý và nắp (7.3.3), tính bằng gam (g).

8.4  Hàm lượng galactose được giải phóng

Hàm lượng galactose trong mẫu thử được giải phóng ra khỏi TGOS, G_g, tính bằng gam trên 100 g, được tính bằng Công thức (5):

                                                         (5)

Trong đó

G_t  là hàm lượng galactose tổng số trong mẫu thử tính được từ Công thức 4, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g);

G_b  là hàm lượng galactose (tự do) ban đầu, tính được từ Công thức 1, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g);

G₁  là hàm lượng galactose được giải phóng ra khỏi lactose, tính được từ Công thức (6), tính bằng gam trên 100 g (g/100 g).

                                                                       (6)

Trong đó, L_b là hàm lượng lactose tính được từ Công thức (3).

8.5  Hàm lượng TGOS

Hàm lượng TGOS trong mẫu thử tính bằng gam trên 100 g, được tính bằng Công thức (7):

  (7)

Trong đó

G_g  là hàm lượng galactose tính được từ Công thức (5):

n  là số nhóm chức galactose trung bình trong phân tử TGOS.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu

Bảng A.1 – Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm