TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11603:2016 VỀ THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NICARBAZIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG – PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11603:2016

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NICARBAZIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG- PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN

Meat and meat products – Determination of nicarbazin residues – Liquid chromatography with tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method

Lời nói đầu

TCVN 11603:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2013.07 Determination and confirmation of nicarbazin in chicken tissues. Liquid chromatography with tandem mass spectrometry;

TCVN 11603:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NICARBAZIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG- PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN

Meat and meat products – Determination of nicarbazin residues – Liquid chromatography with tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method

CẢNH BÁO: Bảo quản các dung môi trong buồng bảo quản chất lỏng dễ cháy. Các dung môi này gây nguy hiểm nếu hít, nuốt hoặc tiếp xúc qua da. Sử dụng thiết bị bảo vệ cá nhân thích hợp như kính an toàn và găng tay cao su, các thao tác sử dụng dung môi phải thực hiện trong tủ hút. Thải bỏ các vật liệu theo quy định.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng-phổ khối lượng hai lần (LC–MS/MS) để xác định dư lượng nicarbazin [tính theo 4,4 dinitrocarbanilide (DNC)] trong sản phẩm gia cầm.

Phương pháp này đã được thử nghiệm trên: gan, thận, thịt, da dính mỡ và trứng của gà. Kết quả thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2  Nguyên tắc

Mẫu thử được đồng hóa đông lạnh sâu với natri sulfat dạng rắn và sau đó được chiết hai lần bằng axetonitril. Hỗn hợp dịch chiết được lọc và pha loãng phù hợp với các giới hạn quy định và nồng độ làm việc của các chất chuẩn được dùng để phân tích LC-MS/MS. Khẳng định việc nhận biết bằng cách so sánh các ion sản phẩm đo được trong mẫu với các ion có mặt trong các lần bơm chất chuẩn, tính theo khối lượng, tỷ lệ ion xác định của độ đáp ứng chuẩn và so sánh thời gian lưu trên sắc ký đồ giữa mẫu và chất chuẩn. Xác định và khẳng định nicarbazin dựa vào phần DNC theo các giới hạn và dung sai quy định. Nồng độ nicarbazin được xác định bằng LC-MS/MS, sử dụng đường chuẩn so sánh nền mẫu và chất nội chuẩn DNC-d₈.

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

3.1  Metanol (CH₃OH).

3.2  Nước, nước cất hoặc nước đã khử ion.

3.3  Axetonitril (C₂H₃N), loại dùng cho HPLC.

3.4  Natri sulfat (Na₂SO₄), dạng hạt khô.

3.5  Amoni axetat.

3.6  Axit formic (CH₂O₂), đậm đặc.

3.7  N,N′-dimethyl formamid.

3.8  Chất chuẩn đối chứng nicarbazin, bảo quản ở 15 °C đến 30 °C.

3.9  Chất nội chuẩn DNC-d₈.

3.10  Dung dịch pha động A

Cho 1,0 ml axit formic (3.6) và 0,38 g ± 0,04 g amoni axetat (3.5) vào bình định mức 1 000 ml, thêm nước đến vạch và trộn kỹ.

3.11  Dung dịch pha động B

Cho 1,0 ml axit formic và 0,38 g ± 0,04 g amoni axetat (3.5) vào 1 000 ml metanol (3.1) và trộn kỹ.

3.12  Dung dịch chuẩn gốc nicarbazin (thành phần DNC có nồng độ 1 000 μg/ml)

Cân 141,4 mg chất chuẩn đối chứng nicarbazin (3.8) tương đương với khoảng 100,0 mg DNC (có tính đến độ tinh khiết của chất chuẩn) và chuyển vào bình định mức 100 ml. Hòa tan bằng siêu âm trong khoảng 10 min và pha loãng đến vạch bằng N,N′-dimethyl formamid (3.7). Trộn kỹ.

3.13  Dung dịch chuẩn trung gian nicarbazin (thành phần DNC có nồng độ 10 μg/ml)

Chuẩn bị bằng cách pha loãng 100 lần từ dung dịch chuẩn gốc nicarbazin (3.12) với axetonitril (3.3).

3.14  Dung dịch để dựng đường chuẩn nicarbazin

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng nồng độ 25 ng/ml, 50 ng/ml, 125 ng/ml, 500 ng/ml, 1250 ng/ml và 2500 ng/ml từ dung dịch chuẩn trung gian nicarbazin (3.13) với axetonitril (3.3) để dựng đường chuẩn.

3.15  Dung dịch nội chuẩn gốc DNC-d₈, 1,0 mg/ml

Chuyển 10 mg chất chuẩn DNC-d₈ (3.9) vào bình định mức 10 ml, dùng N,N′-dimethyl formamid (3.7), để hòa tan. Thêm N,N’-dimethyl formamid đến vạch và trộn đều.

3.16  Dung dịch nội chuẩn DNC-d₈, 1,0 μg/ml

Chuẩn bị bằng cách pha loãng 1 000 lần dung dịch nội chuẩn gốc DNC-d₈ (3.15) với axetonitril (3.3).

CHÚ THÍCH 1  Có thể thay đổi các thể tích khác nhau của các nồng độ tương đương.

CHÚ THÍCH 2  Bảo quản tất cả các dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Các dung dịch chuẩn gốc bền trong 3 tháng và các dung dịch chuẩn bền trong 14 ngày khi được bảo quản trong các điều kiện này.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Pipet định mức, bằng thủy tinh, có các dung tích thích hợp.

4.2  Pipet xả hết.

4.3  Bình định mức, bằng thủy tinh, có các dung tích thích hợp.

4.4  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 g và 0,00001 g.

4.5  Thìa, bằng thép không gỉ hoặc được phủ Teflon, hoặc thìa bằng gỗ dùng một lần.

4.6  Ống đong chia độ, bằng thủy tinh, có các dung tích thích hợp.

4.7  Máy nghiền lạnh và đồng hóa.

4.8  Máy trộn vortex nhiều ống.

4.9  Ống ly tâm bằng polypropylen, hình côn, dung tích 50 ml có nắp đậy.

4.10  Máy ly tâm lạnh (kiểm soát được nhiệt độ), có khả năng hoạt động ở tốc độ 3 000 r/min (gia tốc hướng tâm khoảng 2025 g), ở nhiệt độ 5 °C.

4.11  Pipet, dùng một lần.

4.12  Bộ lọc, bằng PTFE có đường kính 13 mm, cỡ lỗ 0,45 μm.

4.13  Lọ nhỏ có nắp đậy dùng cho HPLC.

4.14  Máy LC-MS/MS, loại ba tứ cực, ví dụ API 4000 1)

4.15  Bơm và bộ bơm mẫu tự động dùng cho HPLC.

4.16  Cột sắc ký, ví dụ: Aqueous C18, dài 50 mm, đường kính trong 2,1 mm, cỡ hạt 3 μm 2)

5  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1  Đồng hóa và bảo quản mẫu

Tiến hành nghiền lạnh bằng cách làm đông lạnh mẫu với nitơ lỏng rồi nghiền thành bột mịn để thu được mẫu đồng nhất, sử dụng máy nghiền lạnh (4.7). Nghiền tối thiểu 500 g mẫu.

Có thể cân 5,0 g ± 0,5 g mẫu con (mẫu đã nghiền) (1,0 g đối với mẫu thận), cho vào các ống polypropylen dung tích 50 ml (4.9) và cấp đông để hạn chế mẫu cấp đông và rã đông nhiều lần. Bảo quản tất cả các mẫu ở nhiệt độ đông lạnh (-20 °C hoặc nhỏ hơn) khi không xử lý hoặc lấy mẫu con. Nên bảo quản mẫu bổ sung cùng với các mẫu phân tích để xác nhận tính ổn định khi bảo quản.

6.1.2  Chuẩn bị mẫu kiểm soát chất lượng (QC) và mẫu kiểm soát

Trong ngày phân tích, chuẩn bị ít nhất bảy mẫu nền kiểm soát và một mẫu nền được bổ sung ở mức dư lượng tối đa (MRL).

6.2  Chiết

a) Cân 5,0 g ± 0,05 g (đối với thận, cân 1,0 g ± 0,05 g) mẫu nghiền đại diện cho mẫu cấp đông hoặc rã đông một phần, chính xác đến 0,00001 g, cho vào ống ly tâm (4.9).

b)  Dùng pipet xả hết (4.2) thêm vào tất cả các mẫu 200 μl (đối với thận là 40 μl) dung dịch nội chuẩn DNC-d₈ 1,0 μg/ml (3.16).

c) Thêm vào các mẫu QC một lượng nicarbazin ở mức MRL (dựa trên hàm lượng và độ tinh khiết của DNC).

d) Cân 10 g ± 1 g natri sulfat khan (3.4), chính xác đến 0,00001 g, cho vào mỗi mẫu. Đối với mẫu thận, giảm lượng natri sulfat khan đi năm lần.

e) Trộn kỹ natri sulfat khan với mẫu, dùng thìa bằng thép không gỉ hoặc được phủ Teflon, hoặc thìa bằng gỗ dùng một lần (4.5).

f) Dùng pipet định mức (4.1) thêm 20 ml axetonitril (3.3) và trộn đều bằng máy trộn vortex nhiều ống (4.8) trong 30 min.

g) Ly tâm mẫu với tốc độ khoảng 3 000 r/min bằng máy ly tâm (4.10) trong 10 min.

h) Gạn dịch nổi phía trên vào ống chia độ [ống ly tâm (4.9) hoặc ống đong (4.6) dung tích 50 ml].

i) Chiết lại phần mẫu còn lại trong ống ly tâm như sau: dùng pipet định mức (4.1) thêm 20 ml axetonitril (3.3) và trộn đều bằng máy trộn vortex nhiều ống (4.8) trong 30 min, ly tâm mẫu với tốc độ khoảng 3 000 r/min trong 10 min. Gạn dịch nổi phía trên vào phần dịch nổi ở điểm h) nêu trên.

j) Dùng pipet xả hết (4.2) thêm 1,0 ml dung dịch nicarbazin (3.14) vào từng dịch chiết của sáu mẫu nền kiểm soát để thu được dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu, dung dịch này dùng để dựng đường chuẩn so sánh nền mẫu. Nồng độ cuối cùng của các dung dịch này là: 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml, 2,5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml và 50 ng/ml.

k) Chỉnh tất cả các dịch chiết mẫu đến thể tích cuối cùng 50 ml bằng axetonitril (3.3) và trộn đều.

l) Dùng bộ lọc (4.12) để lọc mẫu vào trong lọ nhỏ (4.13), dịch lọc được sử dụng để phân tích.

6.3  Xác định

6.3.1  Các điều kiện vận hành sắc ký lỏng (LC)

Các điều kiện vận hành sau đây cho thấy thích hợp:

– Nhiệt độ cột sắc kí (4.16):                                            30°C;

– Tốc độ dòng:                                                              0,4 ml/min;

– Nhiệt độ đối với bộ bơm mẫu tự động (4.15):               nhiệt độ phòng;

– Thể tích bơm:                                                              10 μl;

– Thời gian chạy:                                                           12 min;

– Gradient:

+ pha động B giữ 0 %:                                                  khoảng 2 min;

+ pha động B tăng từ 0 % đến 80 %:                             từ 2 min đến 3 min;

+ pha động B tăng từ 80 % đến 100 %:                          từ 3 min đến 6 min;

+ pha động B giữ 100 %:                                              từ 6 min đến 8 min;

+ pha động B giảm từ 100 % về 0 %:                             từ 8 min đến 8,2 min.

6.3.2  Các điều kiện vận hành MS/MS

Lưu ý: có thể sử dụng các thiết bị tương đương.

Các thông số MS được cung cấp là những giá trị được đề xuất đối với các thiết bị API 4000 (4.14). Để tối ưu hóa phép phân tích, điều chỉnh các thông số của MS thu được.

Chế độ vận hành: ion âm, theo dõi phản ứng đã chọn [phần mềm phân tích như kiểm soát đa phản ứng (MRM)];

chuyển tiếp xác định:                                                     301,0 m/z → 136,7 m/z;

chuyển tiếp khẳng định:                                                 301,0 m/z → 106,9 m/z;

chuyển tiếp chất nội chuẩn:                                            308,7 m/z → 140,6 m/z.

6.3.3  Các thông số MS cụ thể đối với các hợp chất (dùng cho API 4000)

DNC, khối lượng Q₁ 301,0 amu, khối lượng Q₃ 136,7 amu, năng lượng va chạm -16 V; điện thế áp giữa cực thứ hai và thứ ba: -11 V; thế đầu vào: -6 V.

DNC, khối lượng Q₁ 301,0 amu, khối lượng Q₃ 106,9 amu, năng lượng va chạm -48 V; thế áp giữa bộ tứ cực thứ hai và thứ ba: -7 V; thế đầu vào: -4 V.

DNC-d₈, khối lượng Q₁ 308,7 amu, khối lượng Q₃ 140,6 amu, năng lượng va chạm -16 V; thế áp giữa bộ tứ cực thứ hai và thứ ba: -7 V; thế đầu vào: -6 V.

6.3.4  Các thông số MS của thiết bị

– nguồn ion:                                          turbospray;

– độ phân giải (Q₁ và Q₃):                       đơn vị tùy chọn;

– khí chắn (CUR):                                   20;

– điện áp phun ion (IS):                          -4500 V;

– va chạm hoạt hóa phân ly (CAD):         10;

– thế phân nhóm (DP):                           -55 V;

– nhiệt độ nguồn:                                   550 °C.

6.3.5  Sự phù hợp hệ thống

Thực hiện đủ số lần bơm chất chiết kiểm soát cuối cùng có chứa chất nội chuẩn sao cho độ đáp ứng của chất nội chuẩn ổn định. Người phân tích quyết định cách xác định khi độ đáp ứng trên trục tung (trục y) ổn định. Có thể lấy từ 5 lần đến 10 lần bơm trong trường hợp này.

6.3.6  Tiến hành xác định

6.3.6.1  Tiến hành bơm riêng từng dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu, từng dịch chiết mẫu, sau đó lại bơm từng dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu.

CHÚ THÍCH  Các dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu được bơm lần đầu tiên và lần cuối cùng có thể không lấy từ cùng một lọ nhỏ (xem điểm l của 6.2). Không nên bơm dịch chiết mẫu quá 12 lần giữa các lần bơm dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu.

6.3.6.2  Đo diện tích pic của DNC và DNC-d₈ trong các dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu và các dịch chiết mẫu. Dựng đường chuẩn tuyến tính 1/x của các tỷ lệ ion xác định của độ đáp ứng chuẩn (tỷ lệ 301,0→136,7 đến 308,7→140,6; DNC đến DNC-d₈) theo nồng độ DNC. Từ đường chuẩn, tính nồng độ DNC trong dịch chiết mẫu, biểu thị bằng nanogam trên mililit (ng/ml).

6.3.6.3  Nếu tỷ lệ ion xác định vượt quá điểm cao nhất của đường chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết mẫu với dịch chiết của mẫu nền kiểm soát và bơm lại cùng với dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu.

Đối với gan, nếu nồng độ DNC trong mẫu thử nằm trong dải từ 500 ng/g (tương ứng với điểm cao nhất của đường chuẩn) đến 8 000 ng/g thì phải pha loãng dịch chiết mẫu với dịch chiết của mẫu nền kiểm soát và bơm lại cùng với dung dịch chuẩn so sánh nền mẫu. Nếu nồng độ DNC trong mẫu thử vượt quá 8 000 ng/g thì phải trộn các mẫu thử ban đầu với mẫu kiểm soát âm tính (ví dụ, trộn 1 g mẫu thử với 4 g mẫu kiểm soát âm tính) và chiết lại.

7  Tính kết quả

Nồng độ nicarbazin trong mẫu thử, X, tính theo DNC, biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), được tính theo Công thức (1):

Trong đó

A        là nồng độ DNC trong dịch chiết mẫu, xác định được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

B        là thể tích dịch chiết, tính bằng mililit (ml);

C        là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

D        là hệ số pha loãng.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 – Các kết quả nghiên cứu