TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11671:2016 VỀ THỨC ĂN CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ SẢN PHẨM DINH DƯỠNG DÀNH CHO NGƯỜI LỚN – XÁC ĐỊNH VITAMIN D2 VÀ VITAMIN D3 – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG – PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN (LC-MS/MS)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11671:2016

THỨC ĂN CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ SẢN PHẨM DINH DƯỠNG DÀNH CHO NGƯỜI LỚN – XÁC ĐỊNH VITAMIN D2 VÀ VITAMIN D3 – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN (LC-MS/MS)

Infant formula and adult nutritionals – Determination of vitamin D2 and D3 – Liquid chromatographic with tandem mass spectroscopy method (LC-MS/MS)

Lời nói đầu

TCVN 11671:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2011.13, Vitamins D₂ and D₃ in infant formula and adult nutritionals. LC-MS/MS;

TCVN 11671:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ SẢN PHẨM DINH DƯỠNG DÀNH CHO NGƯỜI LỚN – XÁC ĐỊNH VITAMIN D2 VÀ VITAMIN D3 – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN (LC-MS/MS)

Infant formula and adult nutritionals – Determination of vitamin D2 and D3 – Liquid chromatographic with tandem mass spectroscopy method (LC-MS/MS)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định tổng vitamin D₂ và vitamin D₃ trong thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và sản phẩm dinh dưỡng dành cho người lớn bằng sắc ký lỏng-phổ khối lượng hai lần (LC-MS/MS).

2  Nguyên tắc

Cân trực tiếp mẫu thử vào ống ly tâm bằng thủy tinh 50 ml và bổ sung chất nội chuẩn được ghi nhãn đồng vị ổn định. Mẫu được xà phòng hóa bằng kali hydroxit trong 30 min ở 75°C để phá vỡ nền mẫu và để dễ cho việc chiết chất phân tích. Thu lấy vitamin D chiết được bằng dung môi ete-pentan và làm khô dưới dòng nitơ. Chất chiết khô này được hoàn nguyên và được lọc trước khi phân tích. Vitamin D được tách khỏi các hợp chất gây nhiễu sử dụng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) và được định lượng bằng máy đo phổ khối lượng hai lần. Xà phòng hóa ở nhiệt độ cao cho phép việc chuẩn bị mẫu kết thúc trong không quá 3 h. Thời gian phân tích của thiết bị là 12 min/mẫu.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất có điện trở suất ≥ 18 Mohm x cm hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Dung môi

3.1.1  Pentan, loại dùng cho HPLC.

3.1.2  Dietyl ete, khan.

3.1.3  Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

3.1.4  Iso-octan, độ tinh khiết ≥ 99,0 %.

3.1.5  Metanol, loại dùng cho HPLC (để chuẩn bị mẫu).

3.1.6  Metanol, loại dùng cho LC-MS (để chuẩn bị pha động LC-MS/MS).

3.1.7  Natri L-ascorbat, tinh thể, độ tinh khiết ≥ 98 %.

3.2  Dung dịch kali hydroxit, dung dịch 45 % (khối lượng/thể tích).

3.3  Pha động

3.3.1  Pha động A, dung dịch amoni format 2 mM trong nước

Chuyển định lượng 126 mg ± 5 mg amoni format độ tinh khiết 99,0 % vào bình định mức 1 ℓ (4.16), thêm khoảng 5 ml nước để hòa tan và thêm nước đến vạch.

3.3.2  Pha động B, dung dịch amoni format 2 mM trong metanol

Chuyển định lượng 126 mg ± 5 mg amoni format độ tinh khiết 99,0 % vào bình định mức 1 ℓ (4.16), thêm khoảng 5 ml nước để hòa tan và thêm metanol (3.1.5) đến vạch.

3.3.3  Dung dịch chiết, hỗn hợp dietyl ete-pentan (20 + 80) (tỷ lệ thể tích).

3.4  Chất chuẩn

3.4.1  Vitamin D₃, khoảng 40 000 lU/mg.

3.4.2  Vitamin D₃ đã trideuteri hóa, độ tinh khiết ≥ 97 % và tỷ lệ đồng vị ổn định > 97 %.

3.4.3  Vitamin D₂, khoảng 40 000 IU/mg.

3.4.4  Vitamin D₂ đã trideuteri hóa, độ tinh khiết ≥ 98,0 % và tỷ lệ đồng vị ổn định > 97 %.

3.5  Dung dịch chuẩn

3.5.1  Dung dịch chuẩn gốc vitamin D₃ (khoảng 48 000 ng/ml)

Dùng cân (4.12) cân 24 mg ± 1 mg vitamin D₃ cho vào bình định mức 500 ml (4.16). Hòa tan và thêm iso–octan (3.1.4) đến vạch.

Lấy một phần dung dịch cho vào lọ thủy tinh có nắp vặn Teflon (4.18). Bảo quản ở dưới – 10°C. Dung dịch đã chuẩn bị bền trong 8 tuần.

3.5.2  Dung dịch chuẩn gốc vitamin D₂ (khoảng 48 000 ng/ml)

Dùng cân (4.12) cân 24 mg ± 1 mg vitamin D₂ cho vào bình định mức 500 ml (4.16). Hòa tan và thêm iso-octan (3.1.4) đến vạch.

Lấy một phần dung dịch cho vào lọ thủy tinh có nắp vặn Teflon (4.17). Bảo quản ở dưới – 10°C. Dung dịch đã chuẩn bị bền trong 8 tuần.

3.5.3  Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp vitamin D₂/D₃ (ISTD, khoảng 540 ng/ml)

Cho khoảng 25 ml metanol (3.1.6) cho vào bình định mức 50 ml (4.16). Chuyển 560 μl từng dung dịch chuẩn gốc (3.5.1) và (3.5.2) vào bình. Thêm metanol (3.1.6) đến 50 ml.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn mới hàng ngày. Dung dịch đã chuẩn bị bền trong 48 h.

3.5.4  Vitamin D₂/D₃ đã trideuteri hóa, dung dịch nội chuẩn được ghi nhãn đồng vị ổn định (SIIS; khoảng 5 000 ng/ml)

Dung dịch đã chuẩn bị được chuyển vào các lọ riêng rẽ và được đậy kín. Bảo quản ở – 70°C. Dung dịch có thể được sử dụng cho đến khi quan sát thấy rõ sự suy giảm chất lượng của dung dịch.

Chuyển định lượng toàn bộ lượng chứa trong từng ống ampul có vitamin D₂ và vitamin D₃ đã trideuteri hóa (1 mg) vào bình định mức 200 ml (4.16), sử dụng metanol (3.1.6) để pha loãng các dung dịch chuẩn và để làm ướt bình. Hòa tan lượng chứa của các ống ampul đã được chuyển hết vào bình bằng metanol đến 200 ml.

3.5.5  Dung dịch chuẩn làm việc

Thêm 100 μl nước, 75 μl hỗn hợp SIIS (3.5.4), một thể tích xác định của hỗn hợp dung dịch chuẩn trung gian (3.5.3) và metanol (3.1.6) theo Bảng 1. Đậy nắp và trộn đều. Chuyển vào lọ lấy mẫu tự động tối màu và đậy nắp.

Bảng 1 – Thể tích yêu cầu đối với dung dịch chuẩn làm việc

3.6  Nguồn nitơ, độ tinh khiết ≥ 99,7 % để làm bay hơi chất chiết dung môi.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Cột, ví dụ: Waters HSST1), kích thước 2,1 mm x 150 mm, cỡ hạt 1,7 μm hoặc tương đương.

4.2  Máy sắc ký lỏng, ví dụ: Waters Acquity UPLC Binary Solvent Manager¹⁾, có thể hoạt động được ở 130 421 kPa (15 000 psi).

4.3  Detector, ví dụ: Waters Quattro Premier XE/Xevo¹⁾, quang phổ khối mạch bốn cực hoặc tương đương.

4.4  Bộ bơm mẫu.

4.5  Bộ sinh khí nitơ.

4.6  Hệ thống phân tích dữ liệu.

4.7  Ống ly tâm, bằng thủy tinh, dung tích 50 ml có nắp vặn Teflon.

4.8  Máy ly tâm.

4.9  Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ 75°C ± 2°C.

4.10  Máy trộn Vortex.

4.11  Bộ bay bơi.

4.12  Cân, có thể đọc chính xác đến 0,001 g.

4.13  Bộ lọc xyranh, bằng PTFE, cỡ lỗ 0,45 μm.

4.14  Pipet, có thể phân phối các thể tích 100 μl, 250 μl và 1 000 μl, có thể điều chỉnh được lượng cần phân phối.

4.15  Đầu tip pipet.

4.16  Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1 ℓ.

4.17  Lọ thủy tinh, có nắp vặn Teflon.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Cân chính xác lượng mẫu yêu cầu cho vào ống ly tâm 50 ml (4.7) (xem Bảng 2)

Bảng 2 – Khối lượng mẫu gần đúng

Thêm 75 μl dung dịch nội chuẩn được ghi nhãn đồng vị ổn định (SIIS) (3.5.4) và trộn trong máy trộn Vortex (4.10) trong 10 s.

6.2  Xà phòng hóa

Cho khoảng 0,4 mg ± 0,1 g natri L-ascorbat (3.1.7) và trộn trong máy trộn Vortex (4.10) tối thiểu 10 s. Thêm 6 ml ± 0,3 ml metanol (3.1.5) và trộn 15 s.

Thêm 4 ml ± 0,3 ml dung dịch kali hydroxit 45 % (3.2) và trộn ngay trong máy trộn tối thiểu 20 s để trộn kỹ hỗn hợp.

Đặt ống (4.7) trong nồi cách thủy (4.9) đã gia nhiệt trước ở nhiệt độ 75°C ± 2°C trong ít nhất 30 min, cứ 10 min đến 20 min lại trộn 5 s.

Sau 30 min, lấy ống ra khỏi nồi cách thủy và đặt ngay vào bề nước đá ít nhất 30 min để đưa nhanh về nhiệt độ phòng.

6.3  Chiết lỏng-lỏng

Cho 5 ml ± 0,3 ml axetonitril (3.1.3) vào mỗi ống, đậy nắp và trộn ở tốc độ vừa phải ít nhất 5 s.

Thêm 22 ml ± 1 ml dung môi chiết dietyl ete-pentan (3.3.3) và lắc ngang 20 lần. Đảo chiều ống mỗi lần lắc.

Ly tâm trong máy ly tâm (4.8) ở tốc độ vừa phải (khoảng 300 g trong 1,5 min) để hỗn hợp tách lớp hoàn toàn.

Gạn lớp dietyl ete-pentan trong và chuyển lớp trên cùng vào ống ly tâm hình côn 50 ml (4.7), để lại vài mililit hỗn hợp dietyl ete-pentan.

Cho bay hơi đến khô lớp dietyl ete-pentan trong nồi cách thủy (4.9) ở nhiệt độ 40°C ± 4°C, thổi dòng khí nitơ từ bộ sinh khí nitơ (4.5) lên phía trên mẫu.

Lấy ống ly tâm khỏi nồi cách thủy, ngay khi kết thúc quá trình bay hơi. Quan sát dịch chiết khi thấy xuất hiện màng trắng hoặc vàng, cần đảm bảo dịch chiết khô hoàn toàn trước khi hoàn nguyên.

Hoàn nguyên ngay bằng 1,9 ml metanol (3.1.5) và trộn trong 10 s hoặc cho đến khi chất rắn hòa tan.

Thêm 100 μl nước và trộn trên máy trộn Vortex (4.10) thêm 5 s.

Lọc mẫu đã hoàn nguyên vào lọ lấy mẫu tự động của máy HPLC, sử dụng bộ lọc xyranh PTFE (4.13). Bơm hỗn hợp lên hệ thống sắc ký đã cân bằng.

6.4  Các điều kiện vận hành thiết bị

Các điều kiện vận hành thiết bị dưới đây được coi là thích hợp.

6.4.1  Các điều kiện sắc ký

Xem Bảng 3 về các điều kiện sắc ký của máy Waters Acquity UPLC (4.2).

Bảng 3 – Các điều kiện sắc ký của máy Waters Acquity UPLC

6.4.2  Điều kiện của máy đo phổ khối lượng

Xem Bảng 4 và Bảng 5 về các điều kiện vận hành của máy Waters Quattro Premier XE/Xevo (4.3).

Bảng 4 – Các điều kiện vận hành của máy Waters Quattro Premier XE/Xevo

Bảng 5 – Các thông số phân tích khối lượng của máy Waters Quattro Premier XE/Xevo

6.5  Phân tích UPLC

Sau khi đánh giá, xác nhận sự cân bằng của hệ thống UPLC, bơm dung dịch chuẩn làm việc (WS1 đến WS5) (xem 3.3.5) sau đó bơm thuốc thử trắng, mẫu kiểm soát và dịch chiết mẫu (6.3).

Bơm dung dịch chuẩn làm việc định kỳ 5 h sau khi phân tích dịch chiết mẫu (ví dụ: 25 mẫu có chu trình thời gian phân tích là 12 min), bơm sau khi phân tích dịch chiết mẫu cuối cùng.

CHÚ THÍCH   Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r² > 0,990. Các phần dư của đường chuẩn phải nhỏ hơn 15 % đối với WS1 và nhỏ hơn 10 % đối với WS2 đến WS5.

7  Tính và biểu thị kết quả

7.1  Tính nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc

Tính nồng độ vitamin D, X₀, trong dung dịch chuẩn làm việc (3.5.5), biểu thị bằng miligam trên mililit (mg/ml) theo Công thức (1):

                         (1)

Trong đó:

V₀ là thể tích dung dịch chuẩn gốc vitamin D sử dụng để chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp vitamin D₂/D₃ (ISTD) (3.5.3), tính bằng mililit (ml) (Ở đây V₀ = 0,560 ml);

V₁ là dung tích bình định mức, tính bằng mililit (ml) (Ở đây V₁ = 500 ml);

V₂ là dung tích bình định mức, tính bằng mililit (ml) (Ở đây V₂ = 50 ml);

V₃ là thể tích cuối cùng của dung dịch chuẩn làm việc được chuẩn bị (V₃ = 2 ml);

W là khối lượng vitamin D đã dùng để tạo dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam (mg);

V_ISTD là thể tích dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp vitamin D₂/D₃ (ISTD) (3.5.3) đã dùng (xem Bảng 1), tính bằng mililit (ml).

1 000 là các hệ số chuyển đổi miligam sang microgam hoặc microgam sang nanogam.

7.2  Tính đường chuẩn và lượng vitamin D trong mẫu thử

Sử dụng chiều cao pic đối với cả vitamin D và vitamin D đã trideuteri hóa đối với từng mức dung dịch chuẩn làm việc để tập hợp một đường hồi quy tuyến tính.

Tính sự hồi quy bằng cách dựng tỷ lệ đáp ứng chiều cao pic đối với từng dung dịch chuẩn làm việc so với nồng độ vitamin D.

Tỷ lệ đáp ứng được xác định là tỷ lệ chiều cao pic vitamin D chia cho chiều cao pic vitamin D đã trideuteri hóa.

7.3  Tính hàm lượng vitamin D trong mẫu thử

Tính hàm lượng vitamin D, X, trong mẫu thử, biểu thị bằng microgam trên kilogam (μg/kg), theo Công thức 2:

                 (2)

Trong đó:

C là nồng độ vitamin D xác định được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V là thể tích của metanol đã dùng để hoàn nguyên dịch chiết, tính bằng mililit (ml);

S là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) kết quả thử thu được.