TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12195-2-3:2018 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT – PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM CLAVICEPS AFRICANA FREDERICKSON, MANTLE & DE MILLIANO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12195-2-3:2018

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-3 YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM CLAVICEPS AFRICANA FREDERICKSON, MANTLE & DE MILLIANO

Procedure for identification of plant disease caused by fungi
Part 2-3: Particular requirements for Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano fungi

Lời nói đầu

TCVN 12195-2-3:2018 do Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật – Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM CLAVICEPS AFRICANA FREDERICKSON, MANTLE & DE MILLIANO

Procedure for identification of plant disease caused by fungi
Part 2-3: Particular requirements for Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano fungi

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình giám định nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật – Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.

3  Thiết bị, dụng cụ

3.1  Túi chứa mẫu

3.2  Tủ lạnh: có thể vận hành ở nhiệt độ từ 3°C đến 8°C

3.3  Giấy bản

3.4  Kẹp ép mẫu thực vật: gồm 2 cặp mắt cáo (thường là bằng gỗ), dây buộc

3.5  Lọ đựng mẫu: Kín khí, bằng chất liệu thủy tinh hoặc nhựa

3.6  Tủ lưu trữ mẫu

3.7  Hộp lưu trữ mẫu

3.8  Lúp cầm tay: độ phóng đại 4x

3.9  Kim khêu nấm: làm bằng vật liệu không gỉ

3.10  Lam kính

3.11  Lamen

3.12  Kính hiển vi: độ phóng đại 40x đến 100x

3.13  Dụng cụ để ẩm hộp thủy tinh, nhựa; túi nilon, hộp petri kín khí. Nếu sử dụng túi ni lon nên sử dụng túi mới hoặc hộp petri đã hấp sấy vô trùng.

3.14  Giấy lọc: kích thước lỗ lọc 20 μm đến 25 μm

3.15  Lưới nhựa

3.16  Dao cắt mẫu: lưỡi dao bằng inox

3.17  Kính lúp soi nổi: độ phóng đại 0,75x đến 13,5x

3.18  Đèn cồn

3.19  Bàn gia nhiệt

4. Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1  Natri chloride (NaCl)

4.2  Dung dịch Lactophenol.

4.3  Axit lactic 85%

4.4  Cồn 70%

4.5  Hóa chất cố định mẫu: Chất kết dính, Bôm Canada, Xylene, Glycerol

4.6  Silicagel

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

5.1.1  Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước

Tiến hành lấy mẫu theo TCVN 8597: 2010

5.1.2  Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng

Đối với ruộng điều tra có diện tích <3.00m²: Điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm có diện tích 1m². Thu toàn bộ các bông có triệu chứng nghi bị nhiễm nấm cựa gà cao lương.

Đối với ruộng có diện tích ≥3.000 m²: Điều tra trên 10 điểm, mỗi điểm có diện tích 1m². Thu toàn bộ các bông có triệu chứng nghi bị nhiễm nấm cựa gà cao lương.

5.2  Bảo quản mẫu giám định

Các bộ phận tươi khi thu được chứa trong các túi lấy mẫu (3.1) và bảo quản trong tủ lạnh (3.2) ở nhiệt độ 4 đến 5°C.

Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc gửi đi giám định có thể xử lý bằng phương pháp ép khô:

Bộ phận nhiễm bệnh (bông) được ép khô bằng cách đặt giữa các lớp giấy bản (3.3) thường là từ 4 đến 5 tờ.

Các lớp giấy bản (có chứa mẫu) được đặt giữa 2 miếng bìa các tông và đặt vào kẹp ép mẫu thực vật sau đó nén chặt bằng dây hoặc vật nặng.

Trong quá trình làm khô mẫu giấy bản nên thay thường xuyên khoảng 1 lần/ngày.

Kẹp ép mẫu thực vật (3.4) (có chứa mẫu) có thể phơi nắng, để trong phòng có điều hòa hoặc máy sưởi để tăng hiệu quả làm khô mẫu.

Thời gian làm khô mẫu hoàn toàn thông thường là từ 5 đến 10 ngày.

Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo.

Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi lấy mẫu vô trùng, bên ngoài đề rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).

Các túi chứa mẫu bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp lưu trữ mẫu (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như silicagel…)

Các tiêu bản lam của nấm được dán nhãn, để trong hộp lưu trữ mẫu và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Ảnh chụp của mẫu vật (ảnh mẫu vật, ảnh cấu trúc nấm…) được ghi rõ các thông tin và lưu lại trong máy tính hoặc ảnh rửa.

6  Phát hiện bệnh

Phát hiện mẫu bệnh theo triệu chứng của bệnh: Bệnh thường xuất hiện trên các hạt riêng lẻ trên gié hoặc trên bông Cao lương. Các hạt nhiễm bệnh bị phá hủy biến thành một khối nấm trắng mềm hình cầu, khi thời tiết ẩm ướt khối nấm này có thể tiết ra các khối bào tử nhớt màu vàng hoặc trắng. Khi bệnh nặng toàn bộ bông cao lương có thể bị bao phủ bởi khối dịch nhớt. Khi thời tiết ẩm ướt (độ ẩm không khí cao) các khối bào tử giảm độ nhớt và bề mặt biến thành trắng mờ. Các giọt dịch này có thể rơi xuống bề mặt của bông, hạt, lá, thân và đất khi khô đi tạo thành các vết màu trắng sữa.

Các khối bào tử nhớt có thể bị kí sinh bởi nấm Cerebella andropogonis hoặc một số loại nấm khác nên cần quan sát kĩ khi giám định sơ bộ.

Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước mà nấm có phân bố (tham khảo phụ lục A) và các loài cây mà nấm gây hại (tham khảo phụ lục A)

6.1  Kiểm tra bằng mắt thường hoặc dưới kính lúp soi nổi (3.17)

Lô hạt được kiểm tra sự có mặt của nấm: lớp nấm màu trắng tới xám trên bề mặt hạt. Kiểm tra sự có mặt của hạch nấm: hạch nấm có màu đỏ nâu hình oval.

6.2  Phương pháp kiểm tra hạt nổi (flotation test)

Hạt được khuấy mạnh trong dung dịch muối NaCl 10% (Xem phụ lục B)

Các hạt nổi được thu lại quan sát dưới kính lúp soi nổi tìm và kiểm tra sự có mặt của nấm cũng như hạch nấm

CHÚ THÍCH: ngoài các hạt mang bệnh, các hạt non, nhỏ, bị gãy, vỡ hoặc lép lửng và các hạt vẫn còn trong vỏ trấu cũng sẽ nổi khi thả vào dung dịch vì vậy cần quan sát dưới kính lúp soi nổi.

7  Giám định bệnh

7.1  Làm tiêu bản lam

Tiêu bản lam của mẫu giám định được làm theo một trong các phương pháp sau:

Phương pháp 1: cố định lam sử dụng chất kết dính:

Nhỏ 1 giọt dung dịch soi kính (có thể sử dụng axit lactic 85% (4.3), lactogrycerol (Xem phụ lục B) hoặc lactophenol (xem phụ lục B)) lên một lam kính (3.10) sạch.

Dùng kim khêu nấm (3.9) hoặc dao cắt mẫu lấy nấm trên bề mặt vết bệnh, các lát cắt mỏng của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch soi kính.

Đặt lamen (3.11) lên giọt dung dịch soi kính có chứa mẫu nấm.

Hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn (3.18) để đuổi bọt khí.

Nếu dịch soi kính tràn ra phía ngoài lamen quá nhiều sử dụng giấy thấm lau khô trước khi gắn cố định mẫu.

Dùng chất kết dính (ví dụ: sơn móng tay) gắn chặt viền lamen và lam kính.

Đặt lam kính đã cố định ở nơi khô ráo.

CHÚ THÍCH: Sử dụng phương pháp này có thể lưu trữ được tiêu bản lam trong vòng vài năm.

Phương pháp 2: Cố định mẫu lam bằng keo Bôm Canada (Canada balsam)

Nhỏ 1 giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene (xem phụ lục B) lên một lam kính (3.10) sạch.

Dùng kim khêu nấm (3.9) hoặc dao (3.16) cắt mẫu lấy nấm trên bề mặt vết bệnh, các lát cắt mỏng của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene.

Đặt lamen (3.11) lên giọt dung dịch soi kính có chứa mẫu nấm.

Nếu trong lam có bọt khí có thể đuổi bọt khí bằng cách đặt lam lên một bàn gia nhiệt (3.19).

CHÚ THÍCH: Đây là phương pháp cố định tiêu bản lam lâu dài, thời gian lưu trữ có thể lên tới vài chục năm.

7.2  Giám định bằng hình thái của hạch nấm

Sau khi được phát hiện, các hạt nghi ngờ nhiễm bệnh sẽ được quan sát kĩ dưới kính lúp soi nổi (3.17) và so sánh với những đặc điểm của hạch nấm C. africana.

7.2.1  Đặc điểm định loại chính của hạch nấm C. africana

“Hạch nấm” của C. africana là một tập hợp của hạch nấm (sclerotia) và một lớp sợi nấm bao phủ ở phía ngoài. Hạch nấm thường ở phần dưới hoặc bên trong lớp sợi nấm (Sphacelium).

Đặc điểm hình thái chính để định loại của hạch nấm C. africana:

Hạch nấm có hình từ bầu dục tới hình cầu kích thước (4 đến 6) mm x (2 đến 3) mm. Khi cắt lát hạch nấm ở phía trong mô hạch chia 2 phần rõ rệt: phần phía trong có màu trắng và viền ngoài có màu nâu hoặc đỏ nâu. Toàn bộ hạch có thể được bao phủ bởi một lớp nấm (sphacelium) màu trắng kem.

Trong một số trường hợp nếu có thể quan sát được giai đoạn hữu tính của nấm (giai đoạn nảy mầm của hạch nấm) có những đặc điểm như: Hạch có thể nảy mầm tạo thành 6 đệm nấm (stromata). Các đệm nấm này có cuống (stipe) và phần đầu giả (capitulum) màu tím đậm. Kích thước đệm nấm (bao gồm cuống) (8 đến 15)mm x (3,3 đến 0,6) mm, đường kính của phần đầu giả khoảng 0,5 đến 1,3 mm.

7.2.2  Phân biệt đặc điểm hình thái của hạch nấm C. africana với các loài nấm cựa gà khác (C. purpurea, C. sorghi, C. sorghicola) gây hại trên cao lương

Không chỉ có một loài C. africana gây hại trên hạt cao lương khi giám định ban đầu bằng hình thái hạch nấm nên chú ý so sánh với các hình thái hạch của các nấm cựa gà khác cũng gây hại trên cao lương như C. purpurea, C. sorghi, C. sorghicola (xem Bảng 1).

CHÚ THÍCH: Các loài thuộc giống Claviceps nói chung thường bị kí sinh bởi nấm Cerebella làm cho hình dạng của hạch nấm bị thay đổi nên khi quan sát chú ý để không nhầm lẫn và bỏ sót hạt bị bệnh.

Cerebella là một giống nấm mốc hoại sinh. Loại nấm mốc này thường xuất hiện trên các giọt bào tử và lớp nấm của các loài nấm thuộc giống Claviceps nói chung và loài C. africana nói riêng. Nấm Cerebella hoại sinh trên các giọt bào tử tạo thành một mảng mốc màu đen bao kín bề mặt của giọt dịch hay hạt bị bệnh. Mảng mốc này thường có dạng nhăn nheo xếp thành vân như vỏ não. Toàn bộ lớp bào tử, nấm và hạch nấm Claviceps sẽ bị chìm sâu trong lớp nấm này nên khi muốn tìm và quan sát bào tử, nấm hay hạch nấm của Claviceps sẽ phải khêu sâu qua lớp nấm mốc này và quan sát kỹ dưới kính hiển vi.

7.3  Giám định bằng hình thái bào tử nấm

Các hạt nghi ngờ được chọn lựa hoặc các hạt mang bệnh đã được giám định ban đầu bằng hình thái hạch nấm tiếp tục giám định bằng hình thái bào tử của nấm.

Mẫu được cố định trên lam kính (xem 8.1) quan sát dưới kính hiển vi (3.12) từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao (10x, 20x, 40x và 100x).

7.3.1  Đặc điểm hình thái chính của bào tử nấm C. africana

Bào tử vô tính:

Nấm có 2 loại bào tử vô tính: bào tử lớn và bào tử nhỏ. Bào tử lớn (hình 1) đơn bào, không màu, hình bầu dục hoặc thon dài kích thước (9 đến 17) μm x (5 đến 8) μm. Bào tử nhỏ hình cầu, đơn bào, không màu, đường kính 2 đến 3 μm. Trong một số trường hợp có thể quan sát được bào tử thứ cấp (nảy mầm từ các bào tử lớn) hình quả lê, kích thước (8 đến 14) μm x (4,0 đến 6,5) μm.

Hình 1- Bào tử nấm C. africana

Bào tử hữu tính:

Quả thể bầu hay quả thể mở (Ascomata/perithecia), hình quả bầu nậm, kích thước (123 đến 226) μm x (86 đến 135) μm. Các túi bào tử (asci) hình ống kích thước 140 μm x (3 đến 4) μm chứa 6 bào tử túi thon dài có vách ngăn kích thước 45 x 1 μm.

7.3.2  Phân biệt đặc điểm hình thái của bào tử nấm C. africana với các loài nấm cựa gà khác (C. purpurea, C. sorghi, C. sorghicola) gây hại trên cao lương

Không chỉ có một loài C. africana gây hại trên hạt cao lương nên khi giám định bằng hình thái nấm nên chú ý so sánh với các hình thái bào tử của các nấm cựa gà khác cũng gây hại trên cao lương như C. purpurea, C. sorghi, C. sorghicola (xem Bảng 1).

Bảng 1 Phân biệt đặc điểm hình thái của hạch nấm và bào tử của nấm C. africana với các loài nấm cựa gà khác (C. purpurea, C. sorghi, C. sorghicola) gây hại trên cao lương

8  Báo cáo kết quả

Sau khi quan sát các đặc điểm hình thái so sánh với đặc điểm hình thái nấm (xem 7.2, 7.3) và khẳng định kết quả giám định là nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano, đơn vị giám định trả lời kết quả giám định. Phiếu kết quả giám định tham khảo tại phụ lục C.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh nấm cựa gà cao lương

Tên khoa học: Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano

Tên khác (Syn.): Sphacelia sorghi McRae

Vị trí phân loại

Bộ: Hypocreales

Họ: Clavicipitaceae

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á (India, Japan, Thailand, Yemen); Châu Phi (Angola, Botswana, Burkina Faso, Burundi, Ethiopia, Ghana, Kenya, Lesotho, Malawi, Mozambique, Nigeria, Rwanda, Senegal, South Africa, Sudan, Swaziland, Tanzania, Uganda, Zambia, Zimabwe); Châu Mỹ (Mexico, USA, Dominican Republic, Haiti, Honduras, Jamaica, Netherlands Antilles, Puerto Rico, Argentina, Bolivia, Brazil, Colombia, Paraguay, Uruquay, Venezuela); Châu Đại Dương (Australia) (CABI, 2016).

A.3  Ký chủ

Ký chủ chính: Sorghum bicolor(L.) Moench (Cao lương), Sorghum halepense (L.) Pers.( Miến lép)

Ký chủ khác: Sorghum (chi Cao lương), Pennisetum glaucum L.R.Br (CABI, 2016).

A.4  Đặc điểm sinh học nấm Claviceps africana

Phần lớn vòng đời của nấm tập trung ở bào tử phân sinh lớn vì bào tử này có khả năng hình thành bào tử thứ cấp; tuy vậy, hiệu quả trong lây lan là rất khó phân định. Con đường xâm nhiễm của C. africana tương tự như của loài C. sorghi, mặc dù về mặt thời điểm là khác nhau. Bào tử lớn nảy mầm sau 12 đến 16 giờ ở các đầu nhụy của các hoa không được thụ phấn, ống mầm xâm nhập vào bề mặt của đầu nhụy và mọc xuống đường truyền của các ống nhụy vào trong phôi. Bào tử nảy mầm trong khoảng nhiệt độ 14 đến 32°C, thích hợp nhất ở 20°C. Sợi nấm mọc vào trong phôi vào phần đế, xâm nhiễm phần trục nhánh để cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho toàn bộ hệ sợi nấm phát triển. Thời kì ủ bệnh bắt đầu trước khi triệu chứng xuất hiện (hình thành khối nấm) là 6 đến 12 ngày, nhiệt độ phù hợp nhất cho bệnh phát triển là 20°C.

Bào tử, trong giọt bào tử, thường tiết ra khoảng 1 ngày sau khi khối nấm hình thành rõ ràng. Trong điều kiện độ ẩm cao, bào tử lớn xuất hiện trên bề mặt của giọt bào tử sản sinh ra bào tử thứ cấp làm cho giọt bào tử có màu trắng. Đây là đặc điểm đặc trưng của loài C. africana. Bào tử thứ cấp lan truyền nhờ gió.

Nấm cựa gà chỉ xâm nhiễm và phát triển ở các phôi không được thụ phấn. Chính vì vậy, có một mối liên hệ chặt chẽ giữa hoa không được thụ phấn và sự xâm nhiễm của nấm bệnh.

Bệnh tồn tại ở dạng khối nấm hoặc hạch. Các dạng này có khả năng tồn tại trong môi trường. Ở độ ẩm thấp và nhiệt độ cao, hạch được hình thành nhiều hơn.

Bào tử lớn tồn tại từ 7 đến 12 tháng trong điều kiện khô.

Phụ lục B

(Quy định)

Thành phần dung dịch xử lý mẫu

B.1  Dung dịch NaCl 10%

Cảnh báo an toàn: phenol và xylen là chất độc hại, tránh tiếp xúc trực tiếp với da trần, sử dụng găng tay và dụng cụ bảo hộ lao động trong thời gian tiếp xúc với phenol và xylen.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                                 Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12195-2-3 về “Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật – Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano”.

13. Kết quả giám định:

Tên khoa học: Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano

Tên khác (Syn.): Sphacelia sorghi McRae

Là đối tượng kiểm dịch thực vật thuộc danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] CABI (2016) Crop Protection Compedium

[2] http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/fungi/ascomycetes/Pages/Ergot.aspx,

[3] http://www.naro.affrc.go.jp/org/nilgs/diseases/contents/de4.htm

[4] IPPC (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.

[5] TCVN 8597:2010, Kiểm dịch thực vật – Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.

[6] Viện Bảo vệ thực vật (1997). Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật. Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng. NXB Nông nghiệp.

[7] Viện Nấm học quốc tế IMI (1994) Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng. Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại Viện Bảo vệ thực vật, Hà Nội

[8] Commonwealth Mycologycal Institute (1983) Plant Pathologist’s Pocketbook