TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12195-2-7:2019 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT – PHẦN 2-7: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM TILLETIA INDICA MITRA

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12195-2-7:2019

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 2-7: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM TILLETIA INDICA MITRA

Procedure for identification of plant disease caused by fungi

Part 2-7: Particular requirements for Tilletia indica Mitra

Lời nói đầu

TCVN 12195-2-7: 2019 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12195 Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

– Phần 1: Yêu cầu chung

– Phần 2-1 : Yêu cầu cụ thể đối với nấm Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz

– Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr

– Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano

– Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Ciborinia camelliae Kohn

– Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Boeremia foveata (Foister) Aveskamp, Gruyter & Verkley

– Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada

– Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra

– Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili

 

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 2-7: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM TILLETIA INDICA MITRA

Procedure for identification of plant disease caused by fungi

Part 2-7: Particular requirements for Tilletia indica Mitra

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu về quy trình giám định nấm Tilletia indica Mitra gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12195-1:2019, Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật – Phần 1: Quy định chung.

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:

3.1  Kim khêu nấm

3.2  Dao cắt mẫu

3.3  Kính hiển vi: có độ phóng đại từ 40 lần đến 1 000 lần

3.4  Bình tam giác: dung tích 100 ml, 250 ml…

3.5  Máy lắc

3.6  Phễu

3.7  Lưới lọc: kích thước lỗ lọc 20 µm, 53 µm

3.8  Bình phun nước cất

3.9  Công tơ hút

3.10  Ống ly tâm

3.11  Giấy parafilm

3.12  Hộp petri

3.13  Chày: thủy tinh, nhựa

3.14  Máy ly tâm: tốc độ từ 1 000 đến 4 000 vòng/phút

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1  Tween-20 0,01 %

4.2  Nước tinh khiết dùng trong công nghệ phân tử (MGW)

4.3  Agarose

4.4  Nước cất

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 12195-1:2019 (điều 5.1).

5.2  Bảo quản mẫu giám định

Bảo quản mẫu giám định hoặc sau khi giám định như sau:

– Bông lúa bảo quản tươi hoặc ép khô theo TCVN 12195-1: 2019 (điều 5.2.1)

– Hạt lúa theo TCVN 12195-1: 2019 (điều 5.2.2)

– Tiêu bản lam theo TCVN 12195-1: 2019 (điều 5.2.4)

6  Phát hiện bệnh

Cây nhiễm bệnh thấp hơn, bông ngắn, số lượng hạt trên bông giảm. Nấm chỉ gây bệnh trên một số hạt trên bông, các hạt nhiễm bệnh thường bị lép.

Ban đầu có chấm đen nhỏ dưới phần nội nhũ và rãnh hạt.

Khi xâm nhiễm trên hạt, nấm làm cho hạt có mùi tanh (do trimethylamine) tương tự như nấm T. tritici, T. foetida và T. controversa. Hạt bị xâm nhiễm từ phần rốn hạt và chạy dọc theo đường rãnh hạt (không gây nhiễm nội nhũ), hạt có thể bị vỡ hoàn toàn hoặc bị nứt một phần. Khi bệnh nặng, mô dọc theo rãnh hạt và vùng tiếp giáp nội nhũ bị thay thế bởi các bào tử. Mày hạt bị tách ra làm cho hạt bị nhiễm bệnh lộ ra ngoài, cả hạt và phần mày hạt có thể bị rụng khỏi bông.

Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các lô hàng có nguồn gốc tại các quốc gia mà nấm có phân bố (xem phụ lục A).

7  Giám định nấm bệnh

7.1  Giám định bằng đặc điểm hình thái

7.1.1  Kiểm tra trực tiếp

7.1.1.1  Đối với mẫu có triệu chứng bệnh

– Quan sát hình thái của nấm thu được bằng một trong hai cách:

+ Kiểm tra trực tiếp: như điều 7.1.1.1.1 của TCVN 12195-1:2019

+ Soi tiêu bản lam cố định: Làm tiêu bản lam như điều 7.1.1.2 của TCVN 12195-1:2019

– Quan sát dưới kính hiển vi (3.3) đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm Tilletia indica Mitra (điều 7.1.2).

7.1.1.2  Đối với mẫu không biểu hiện triệu chứng bệnh

– Thu mẫu nấm bằng biện pháp rửa, quay ly tâm

Bước 1: Lấy 50 g hạt lúa mỳ cho vào bình tam giác (3.4) 250 ml.

Bước 2: Thêm vào bình 100 ml (3.4) dung dịch Tween-20 (4.1) nồng độ 0,01 %, đậy nắp bình (có thể bao kín bằng giấy parafilm (3.11)).

Bước 3: Đặt bình tam giác lên máy lắc (3.5) hoặc lắc bằng tay trong vòng 3 phút để các bào tử rời ra khỏi hạt lúa mỳ.

Bước 4: Chuẩn bị một bộ lọc bao gồm một bình tam giác (3.4), một phễu (3.6) trong đó có 1 lưới lọc (3.7) kích thước 53 µm.

Bước 5: Đổ dịch và hạt lúa mỳ lên phễu của bình tam giác (3.4) đã chuẩn bị.

Bước 6: Dùng bình phun nước cất (3.8) rửa hạt lúa mì còn ở trên lưới 3 lần (mỗi lần dùng 20 ml đến 50 ml nước cất). Tiếp tục rửa hạt lúa mì bằng nước cất (4.4) đến khi lượng nước trong bình đạt từ 300 ml đến 400 ml. Bỏ lưới lọc, rửa phễu lọc 2 lần bằng nước cất (4.4) mỗi lần 10 ml đến 20 ml nước.

Bước 7: Chuẩn bị bộ lọc thứ 2 bao gồm 1 bình tam giác (3.4): 1 phễu (3.6) trong đó có đặt một lưới lọc 20 µm (3.7) (lưới lọc này có thể ngâm trong nước trước để có hiệu quả lọc tốt hơn).

Bước 8: Rót dịch thu được ở trên qua bộ lọc đã chuẩn bị. Rửa bình chứa dịch 2 lần bằng 10 ml nước cất (4.4). Nghiêng lưới lọc (3.7) một góc 30º đến 35º rửa nhẹ nhàng lưới lọc bằng nước cất (4.4) sao cho phần cặn còn lại trên lưới lọc dồn sang bên cạnh của lưới lọc. Dùng công tơ hút (3.9) hút dịch và cặn trên lưới lọc vào ống ly tâm (3.10).

Bước 9: Ly tâm dịch thu được ở tốc độ 4 000 vòng/phút trong 3 phút. Phần cặn thu được sau ly tâm hòa tan lại trong nước cất để đạt dung tích khoảng 50 ml đến 100 ml.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu hạt đã qua xử lý hóa chất diệt nấm, hạt phải được ngâm trong NaOH (0,2% hoặc 1%) trong 24 giờ trước khi rửa, quay ly tâm

– Kiểm tra trực tiếp: như điều 7.1.1.1.1 của TCVN 12195-1:2019 toàn bộ dịch thu được sau khi rửa quay ly tâm.

– Quan sát dưới kính hiển vi (3.3) đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm Tilletia indica Mitra (điều 7.1.2).

7.1.2  Đặc điểm hình thái định loại của nấm Tilletia indica Mitra

Bào tử đông (Teliospore) dạng cầu tới gần cầu, đường kính thông thường (22 đến 47) µm, có thể lớn hơn (35 đến 41) µm; Màu sắc từ vàng cam nhạt tới nâu tới nâu đậm, đỏ nâu; một số bào tử có màu đen hoặc màu đen mờ. Gai dày đầu gai nhọn hoặc tù, một số trường hợp đầu hơi cong, độ dài gai (1,5 đến 5,0) µm. Bề mặt gai có dạng vỏ não với những rãnh hẹp. Các gai được bao bọc bởi một màng mỏng trong suốt.

Tế bào bất dục: hình cầu tới gần cầu hoặc hình giọt lệ, màu vàng nâu, (10 đến 28) µm x 48 µm, có hoặc không có đỉnh nhỏ (gai ngắn), vách tế bào mượt dày khoảng 7µm và tạo phiến.

Khi giám định nấm chú ý phân biệt với một số loài nấm Tilletia khác có hình thái tương tự và có khả năng lẫn tạp cao trong lô hàng (Bảng 1)

Bảng 1 – Phân biệt đặc điểm hình thái của bào tử của nấm Tilletia indica với các loài nấm than đen khác (Tilletia horrida, Tilletia walkeri) thường xuất hiện trên lô hàng lúa mì

Chỉ tiêu	T. horrida	T. walkeri	T. indica
Kích thước bào tử to nhất (µm)	22 đến 47	36 đến 45	45 đến 50
Kích thước trung bình (µm)	24 đến 28	30 đến 31	35 đến 41
Màu sắc bào tử đông	Vàng nhạt tới màu hạt dẻ nhạt hoặc đậm (tới đen mờ)	Vàng nhạt tới nâu đỏ (không có màu đen đục)	Màu cam nhạt nhưng chủ yếu là màu đỏ nâu đậm tới đen mờ
Hình thái và phân bố gai	Gai nhọn, nhìn bề mặt có nhiều góc cạnh; ít khi có dạng rãnh vỏ não hoặc hiếm khi có dạng bụi. Đầu gai nhọn, có thể trở thành cụt, ít khi cong	Dạng thô; dạng vân tương tự vỏ não không hoàn hảo hoặc bụi dày. Gai dạng nón tới cụt	Gai dày, có dạng vỏ não. Đầu gai nhọn hoặc gẫy đầu.

 

Hình 1- Bào tử đông của nấm Tilletiaindica

(NGUỒN: EPPO)

7.2  Giám định bằng phương pháp PCR

7.2.1  Phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

Bước 1: Rửa sạch bào tử thu được sau khi rửa ly tâm (xem 7.1.1.2) hoặc thu trực tiếp trên mẫu có triệu chứng bệnh bằng cách rửa bằng nước cất trên lưới lọc 20 µm (3.7). Hút dịch thu được vào ống mới thêm nước cất cho đủ 3 ml ngâm qua đêm ở 21 °C.

Bước 2: Ly tâm 4 000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch trong ống chỉ thu phần cặn ly tâm.

Bước 3: Hòa tan cặn ly tâm trong nước, thay nắp mới và lắc nhẹ ống ly tâm (3.10).

Bước 4: Ly tâm ở 4 000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch rửa.

Bước 5: Thêm vào 1 ml nước cất vô trùng để rửa cặn ly tâm (Ly tâm và rửa 2 lần).

Bước 6: Tiếp tục ly tâm 1 200 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch rửa.

Bước 7: Hòa tan lại cặn ly tâm trong 1 ml nước cất vô trùng (4.2).

Bước 8: Trang 1 ml dịch hòa tan ở bước 7 lên môi trường Agar (WA) (xem phụ lục B) và đặt ở nhiệt độ 21 °C chu kì ánh sáng 12 giờ tối/12 giờ sáng trong 5 ngày.

Bước 9: Bọc các đĩa môi trường bằng giấy parafilm (3.11), tiếp tục nuôi cấy trong 7 ngày đến 14 ngày.

Bước 10: Cắt miếng thạch có bào tử nảy mầm gắn trên nắp hộp petri trong đó chứa 5 ml môi trường khoai tây dextrose lỏng (PDB) (xem phụ lục B), đặt hộp petri ở 21 °C chu kì ánh sáng 12 giờ tối/12 giờ sáng trong 2 đến 3 ngày.

Bước 11: Kiểm tra sự hình thành bào tử đảm trên bề mặt môi trường nếu chưa thấy nuôi cấy thêm 5 ngày.

Bước 12: Dùng kim khêu nấm (3.1) vô trùng lấy những màng nấm trong môi trường đặt trên các miếng giấy lọc vô trùng để loại bỏ môi trường bám dính.

7.2.2  Tách chiết DNA

Bước 1: 0,1 g nấm thu sau khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo (xem 7.2.1) cho vào ống ly tâm (3.10) 2 ml.

Bước 2: Thêm vào 1 ml nước tinh khiết dùng trong công nghệ phân tử (MGW) (4.2) nghiền đều bằng chày thủy tinh hoặc chày nhựa vô trùng (3.13).

Bước 3: Ủ trong 30 giây.

Bước 4: Tách DNA bằng kít tách chiết DNA tổng số của nấm

7.2.3  Nhân gen trong máy chu trình nhiệt

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu:

Tin 3 (5′-CAA TGT TGG CGT GGC GGC GC-3′)

Tin 4 (5′-CAA CTC CAG TGA TGG CTCCG-3′)

Chu trình nhiệt sử dụng:

94 °C trong 1 phút 94 °C trong 15 giây 65 °C trong 15 giây 72 °C trong 15 giây 72 °C trong 6 phút

25 chu kì

7.2.4  Đọc kết quả

– Điện di bằng agarose gel 2 % (4.3)

– Mẫu dương tính sẽ cho đoạn gen có kích thước 414 bp.

7.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài Tilletia indica Mitra khi:

– Nấm có đặc điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở điều 7.1.2.

hoặc

– Phương pháp PCR cho kết quả là dương tính.

8  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

– Thông tin về mẫu giám định.

– Tên loài

– Phương pháp giám định

– Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục C.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh than đen lúa mỳ

Tên khoa học: Tilletia indica Mitra

Tên khác: Neovossia indica (Mitra) Mundk.

Vị trí phân loại:

Lớp: Ustilaginomycetes

Bộ: Tilletiales

Họ: Tilletiaceae

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: India, Afghanistan, Iraq, Nepal, Iran, Pakistan; Châu Phi: South Africa, Kenya; Châu Mỹ: USA, Mexico, Brazil; Châu Âu: Switzeland, Poland, Russian Federation

A.3  Ký chủ

Triticale, Triticum (chi lúa mì), Triticum aestivum (lúa mì)

A.4  Đặc điểm sinh học

Nấm tồn tại trong đất ngay cả khi không trồng lúa mạch trong 2 năm liền vẫn không thể loại trừ mà chỉ làm giảm tỉ lệ bệnh. Tuy vậy sự tồn tại và phát tán của nấm có thể thông qua việc vận chuyển các hạt nhiễm bệnh. Bào tử đông nảy mầm trên mặt đất khi nhiệt độ và ẩm độ phù hợp, nhiệt độ thường là khoảng 20 °C đến 25 °C. Bào tử đông nảy mầm sinh ra đảm đơn bào, hình sợi, trên đó sinh ra bào tử đảm sporidia. Các bào tử đảm sơ cấp sinh ra các bào tử đảm thứ cấp dạng khúc dồi hay thon dài hoặc sợi nấm có thể sinh ra bào tử đảm thứ cấp. Trong hai loại bào tử đảm thứ cấp này dạng khúc dồi có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh trên cây. Dạng bào tử này thuộc loại bào tử bắn (ballistospores). Bào tử đảm sơ cấp và thứ cấp lan truyền nhờ gió và nước mưa tới các bông lúa mạch và là nguồn lây nhiễm chủ yếu. Các ống mầm của các bào tử đảm thứ cấp xâm nhập vào lỗ khí khổng của mày hạt, lá bắc và có thể là cuống hoa mở. Nấm tấn công bầu nhụy và làm cho hạt bị nhiễm bệnh

Bệnh thích hợp với điều kiện khí hậu mát và độ ẩm cao. Nhiệt độ, lượng mưa và ẩm độ là các nhân tố chính trong mô hình cảnh báo sớm bệnh than đen lúa mỳ. Nhiệt độ từ 8 °C đến 20 °C và độ ẩm cao khi có mưa phùn nhẹ trời âm u là điều kiện thích hợp nhất cho sự xâm nhiễm. Điều kiện môi trường đóng vai trò quyết định trong sự xâm nhiễm. Khi thời tiết khô nhiệt độ cao (20 °C đến 25 °C) và trời quang bệnh sẽ khó phát triển.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nhân tạo

B1  Môi trường PDB

Thành phần

Khoai tây	250 g
Đường (dextrose)	20 g
Nước	1 000 ml

Nước chiết khoai tây: Khoai tây không cần gọt vỏ, rửa sạch, thái nhỏ thành từng miếng vuông khoảng 1 cm. Đun khoai tây trong nước cho đến khi mềm (khoảng 1-2 giờ), lọc bằng vải màn để lấy dịch trong.

Khử trùng môi trường trong nồi hấp (xem phụ lục B TCVN 12195-1:2019).

B 2  Môi trường WA

Thành phần

Agar	15 g
Nước	1 000 ml

Hòa tan hoàn toàn Agar trong nước.

Khử trùng môi trường trong nồi hấp (xem phụ lục B TCVN 12195-1:2019).

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan giám định ……………………..

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ——————–

 

………………. ngày … tháng … năm 20 …….

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:
2. Nước xuất khẩu:
3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:

Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Tình trạng mẫu:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Số mẫu lưu:
11. Người giám định:

12 . Phương pháp giám định: Theo TCVN 12195-2-7:2019. Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật – Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra.

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh than đen lúa mỳ

Tên khoa học: Tilletia indica Mitra

Tên khác: Neovossia indica (Mitra) Mundk.

Vị trí phân loại:

Lớp: Ustilaginomycetes

Bộ: Tilletiales

Họ: Tilletiaceae

 

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CABI, (2018), Crop Protection Compedium.

[2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[3] IPPC, (2006), ISPM 21 Diagnostic protocols for regulated pests.

[4] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

[5] Viện Nấm học quốc tế IMI, (1994), Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng, Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại Viện Bảo vệ thực vật, Hà Nội.

[6] https://gd.eppo.int/taxon/NEOVIN