TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12284:2018 VỀ MẬT ONG – PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SS-LACTAM (AMOXICILLIN, AMPICOLLIN, PENICILLIN G) BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12284:2018

MẬT ONG – PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG β -LACTAM (AMOXICILLIN, AMPICILLIN, PENICILLIN G) BẢNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS)

Honey – Determination of β–lactam (amoxicillin, ampicillin, penicillin G) residues by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

Lời nói đầu

TCVN 12284:2018 do Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

MẬT ONG – PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG β -LACTAM (AMOXICILLIN, AMPICILLIN, PENICILLIN G) BẢNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS)

Honey – Determination of β–lactam (amoxicillin, ampicillin, penicillin G) residues by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng β-lactam gồm: Amoxicillin, ampicillin, penicillin G có trong mật ong bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

Giới hạn định lượng của phương pháp là 10 μg/kg.

2  Nguyên tắc

Dư lượng β-lactam trong mật ong được chiết ra bằng dung dịch đệm phosphat pH 9,2, được loại bỏ đường và các hợp chất khác bằng chiết dung môi và cột chiết pha rắn HLB. Dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

3  Thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác và nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

3.1  Natri phosphat ngậm một phân tử nước (NaH₂PO₄.H₂O).

3.2  Natri chlorit (NaCl).

3.3  Natri hydroxit (NaOH).

3.4  Nước (H2O), loại dùng cho LC/MS.

3.5  Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho LC/MS.

3.6  Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho HPLC.

3.7  Metanol (CH₃OH), loại dùng cho HPLC.

3.8  Khí N₂, độ tinh khiết ≥ 99,99 %.

3.9  Axít formic (HCOOH).

3.10  Amoni axetat (CH₃COONH₄).

3.11  Dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH 9,2)

Hòa tan 13,8 g natri phosphat ngậm một phân tử nước (3.1) trong 900 ml nước cất vào bình định mức 1000 ml (4.13), chính pH 9,2 bằng dung dịch NaOH 10 M (3.13). Định mức bằng nước cất hai lần đã khử ion. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.

3.12  Dung dịch NaCI 2 %

Cân 20 g NaCI (3.2) vào bình định mức 1000 ml (4.13) hòa tan và định mức tới vạch bằng nước cất hai lần đã khử ion. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.

3.13  Dung dịch NaOH 10 M

Cân 40 g NaOH (3.3) cho vào bình định mức 100 ml (4.13) hòa tan bằng 70 ml nước cất và để mát. Định mức bằng nước cất hai lần đã khử ion đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.

3.14  Dung dịch amoni axetat 0,05 M

Cân 4,0 g amoni axetat (3.10) vào bình định mức 1000 ml (4.13) hòa tan và định mức tới vạch bằng nước cất hai lần đã khử ion. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.

3.15  Dung dịch của hỗn hợp axetonitri:nước (3:7)

Lấy 140 ml nước (3.4) pha vào 60 ml axetonitril (3.5) cho vào lọ thủy tinh 250 ml (4.16). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.

3.16  Chất chuẩn amoxicillin (AMO), độ tinh khiết 99,0 %.

3.17  Chất chuẩn ampicillin (AMP), độ tinh khiết 99,0 %.

3.18  Chất chuẩn penicillin G (PENG), độ tinh khiết 99,2 %.

3.19  Chất nội chuẩn amoxicillin-d₄(AMO-d₄), độ tinh khiết 99,0 %.

3.20  Chất nội chuẩn penicillin G-d₇ (PENG-d₇), độ tinh khiết 99,0 %.

3.21  Dung dịch chuẩn gốc AMO, AMP, PENG, nồng độ 1000 μg/ml trong axetonitril

Cân 50 mg ± 0,1 mg mỗi loại vào các bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (4.13). Hoà tan và định mức đến vạch bằng axetonitril (3.5) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °C có thể bền đến 2 tháng.

CHÚ THÍCH: Lượng cân trên phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 μg/ml sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.

3.22  Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) AMO, AMP, PENG, nồng độ 10 μg/ml trong axetonitril

Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch gốc AMO, AMP, PENG, (3.21) cho vào bình định mức 10 ml (4.13), định mức đến vạch bằng axetonitril (3.5). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 1 tháng.

3.23  Dung dịch chuẩn hỗn hợp (S2) AMO, AMP, PENG, 1 μg/ml trong axetonitril: nước

Lấy 1 ml từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (3.22) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với axetonitril: nước (3.15). Dung dịch này được chuẩn bị trong ngày sử dụng.

3.24  Dung dịch nội chuẩn gốc amoxicillin d₄, penicillin G d₇, nồng độ 1000 μg/ml trong axetonitril

Cho 1 ml axetonitril (3.5) vào từng lọ có chứa 1mg chất nội chuẩn thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °C có thể bền đến 6 tháng.

3.25  Dung dịch hỗn hợp nội chuẩn trung gian (IS1) AMO d₄, PENG d₇, 10 μg/ml trong axetonitril

Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch nội chuẩn gốc AMO d₄, PENG d₇ (3.24) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với axetonitril (3.5). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C có thể bền đến 3 tháng.

3.26  Dung dịch hỗn hợp nội chuẩn (IS2) AMO d₄, PENG d₇,1 μg/ml trong axetonitril: nước

Lấy 1 ml dung dịch hỗn hợp nội chuẩn trung gian (3.25) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng axetonitrihnước (3.15). Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °C có thể bền đến 1 tháng.

3.27  Dung môi pha động kênh B, axetonitril + 0,01 % axít formic

Lấy 100 μl axit formic (3.9) cho vào 1000 ml axetonitril (3.5), khuấy đều. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tuần.

3.28  Dung môi pha động kênh A, nước + 0,01 % axít formic

Lấy 100 μl axit formic (3.9) cho vào 1000 ml nước (3.4), khuấy đều. Dung dịch khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tuần.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống máy sắc ký lòng phổ khối lượng LC-MS/MS

– Bơm 2 kênh dung môi gradient;

– Detector 2 tứ cực MS/MS;

– Máy tính và phần mềm phân tích;

– Hệ thống bơm mẫu tự động.

4.2  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,01 mg.

4.3  Máy ly tâm lạnh, tốc độ 200 r/min đến 15 000 r/min.

4.4  Máy vortex, tốc độ tối đa 2000 r/min.

4.5  Tủ sấy, dải nhiệt độ đến 250 °C, sai số ± 0,1 °C.

4.6  Bộ bay hơi nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ.

4.7  Máy đo pH.

4.8  Bể chiết siêu âm.

4.9  Bộ chiết pha rắn kết nối bơm chân không.

4.10  Tủ âm sâu, dải nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 30 °C.

4.11  Micropipet, dung tích 5 μl đến 50 μl, 10 μl đến 100 μl, 20 μl đến 200 μl và 100 μl đến 1000 μl.

4.12  Ống nghiệm thủy tinh, dung tích 8 ml.

4.13  Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml và 1000ml.

4.14  Ống ly tâm, dung tích 50 ml.

4.15  Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.

4.16  Lọ thủy tinh, dung tích 250 ml.

4.17  Màng lọc nylon, kích thước lỗ 0,2 μm đường kính 13 mm.

4.18  Cột Oasis HLB, 200 mg, dung tích 6 ml.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Mẫu khi chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở âm 20 °C và có thể ổn định được trong 6 tháng.

6  Chuẩn bị mẫu

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Cân 2 g ± 0,01 g mẫu đã đồng nhất bằng cách khuấy hoặc lắc đều vào ống ly tâm 50 ml (4.14). Cho vào 40 μl hỗn hợp nội chuẩn (3.26). Lắc đều bằng máy vortex (4.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

6.2  Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu mật ong không nhiễm β-lactam, chuẩn bị tối thiểu một mẫu trắng cho mỗi lô.

6.3  Chuẩn bị mẫu kiểm soát

Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng có bổ sung 40 μl hỗn hợp chuẩn β-lactam (3.23) và 40 μl hỗn hợp nội chuẩn (3.26) để thu được nồng độ chuẩn của mẫu kiểm soát là 20 ng/g và nồng độ chất nội chuẩn là 20 ng/g. Lắc đều bằng máy vortex (4.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

6.4  Chuẩn bị mẫu và dựng đường chuẩn

Đường chuẩn được lập dựng trên mẫu trắng (6.2) được thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau.

Cho lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp β-lactam (3.22), (3.23) và dung dịch hỗn hợp nội chuẩn β-lactam (3.26) vào các ống ly tâm có chứa mẫu trắng theo Bảng 1, lắc 15 s bằng máy vortex (4.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo như đối với mẫu thử.

Bảng 1 – Nồng độ các dung dịch chuẩn dùng để xây dựng đường chuẩn

7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm vào mẫu thử (6.1) 20 ml đệm phosphat 0,1 M (3.11);

Lắc 1 min bằng máy vortex (4.4) ở tốc độ cao nhất. Để yên 20 min ở nhiệt độ phòng;

Hoạt hóa cột HLB bằng 10 ml metanol (3.7), 10 ml nước cất, 10 ml NaCI 2 % (3.12) và 2 ml đệm phosphat 0,1 M (3.11);

Ly tâm mẫu ở 4000 r/min trong 5 min (4.3);

Chuyển dung dịch qua cột chảy chậm, không quá 2 giọt/s;

Rửa cột bằng 5 ml nước cất chảy tốc độ tối đa 2 ml/min, để khô cột 5 min bằng bơm chân không;

Rửa giải bằng 3 ml axetonitril (3.6) tốc độ 1 ml/min đến 2 ml/min thu vào ống nghiệm 8 ml (4.12);

Bay hơi tới khô bằng bộ bay hơi nitơ ở nhiệt độ 50 °C (4.6);

Hòa tan cặn bằng 2 ml dung dịch amoni axetat 0,05 M (3.14)

Lọc bằng màng lọc nylon (4.17), đưa dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (4.16);

Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (4.1).

7.2  Tiến hành thử nghiệm trên LC-NIS/MS

7.2.1  Yêu cầu chung

Chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế mao quản, điện thế đầu công, năng lượng va chạm, tốc độ khi va chạm…để mỗi chất phân tích thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.

7.2.2  Điều kiện trên LC (tham khảo)

Cột sắc ký: RP C18, đường kính trong 2,1 mm, dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 μm

Nhiệt độ cột: (40 ±5)°C

Tốc độ dòng: 0.2 ml/min

Thể tích bơm mẫu: 5 μl

Thời gian phân tích: 9 min

Pha động: Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2.

Bảng 2 – Điều kiện gradient cho hệ thống LC

7.2.3  Điều kiện trên MS (tham khảo)

Kiểu ion hóa: ESI (+)/MRM

Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150°C

Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 °C

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 l/h

Tốc độ dòng khí qua đầu cone: 20 l/h

Áp suất khí va chạm: Argon, p = 2,93×10^-3 mbar

Điện thế mao quản: 2,0 kV

Bảng 3 – Điều kiện phân mảnh MS/MS

7.3  Trình tự bơm mẫu (tùy chọn)

– Bơm dung môi kiểm tra máy:axetonitril (3.5);

– Bơm các dung dịch để dựng đường chuẩn;

– Bơm mẫu trắng;

– Bơm mẫu kiểm soát;

– Bơm mẫu thử.

8  Tính toán và biểu thị kết quả

8.1  Hệ số tín hiệu, RF, tính theo công thức:

Trong đó:

Sp là diện tích pic của ion định lượng chất cần phân tích;

Sp_IS là diện tích pic của ion thứ cấp của chất nội chuẩn.

8.2  Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu RF với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu x theo phương trình đường chuẩn: RF = ax + b. Trong đó:

b là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

a là hệ số góc của đường chuẩn.

8.3  Tính kết quả

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu, C, microgam trên kilogam (μg/kg) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C_x là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lit (μg/l);

V là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

F là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8.4  Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg/kg (ppb) được làm tròn đến hai chữ số sau dấu phẩy.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

– Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;

– Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

– Kết quả thử nghiệm thu được.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]  Quy trình nội bộ VS1/QT/90/TD “Mật ong – Xác định dư lượng β–lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ”

[2]  Phương pháp phân tích dư lượng Penicillin trong mật ong bằng sắc ký lỏng hai lần khối phổ, mã # M-H364, 2007- JT laboratories Inc.