TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12371-1:2019 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT – PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12371-1:2019

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 1:General requirements

Lời nói đầu

TCVN 12371-1:2019 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytolasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

Phần 1: Yêu cầu chung

Phần 2-1 : Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

Phần 2-2 : Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

Phần 2-3 : Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

 

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 1: General requirements

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định kĩ thuật chung trong quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các phiên bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật – Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng

3  Dụng cụ, thiết bị

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:

3.1  Túi lấy mẫu

3.2  Tủ lạnh: nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

3.3  Giấy bản

3.4  Bìa các tông

3.5  Kẹp ép mẫu thực vật

3.6  Tủ lưu trữ mẫu: có khả năng duy trì nhiệt độ và ẩm độ thấp

3.7  Hộp lưu trữ mẫu

3.8  Lọ đựng mẫu: bằng vật liệu trơ với hóa chất, trong suốt, có nắp kín

3.9  Hộp chứa mẫu: Kín khí, có nắp đậy

3.10  Tủ lạnh sâu: nhiệt độ từ âm 80 °C đến âm 20 °C

3.11  Đèn cồn

3.12  Hộp petri

3.13  Que cấy thẳng, que cấy vòng

3.14  Pipette

3.15  Bản giếng ELISA

3.16  Túi ni-lông: vô trùng

3.17  Giấy thấm

3.18  Ống eppendorf

3.19  Bể ổn nhiệt

3.20  Chày, cối: sứ hoặc nhựa

3.21  Máy chu trình nhiệt (PCR)

3.22  Kính hiển vi: có độ phóng đại 40 lần đến 1 000 lần

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1  Silicagel

4.2  Nước cất

4.3  Glycerol (C₃H₈O₃)

4.4  Cồn (C₂H₅OH): 70 % hoặc 90 %

4.5  Parafin

4.6  Dung dịch Natri hypoclorit (NaOCl) 10 %

4.7  Tím kết tinh (Crystal violet) 5 %

4.8  Dung dịch Lugol’s iodine

4.9  Dung dịch Safranin O 0,5 %

4.10  Dung dịch KOH 3 %

4.11  CTAB

4.12  Natri carbonat (Na₂CO₃)

4.13  Lab- Lemco Powder

4.14  Dung dịch axit sunfuric H₂SO₄ 10 %

4.15  Đồng sunfat CuSO₄

4.16  axit sunfuro H₂SO₃

4.17  Fomalin CH₂O

4.18  2 mercaptoethanol HOCH₂CH₂SH

4.19  Chloroform: isoamyl alcohol (24:1)

4.20  Isopropanol C₃H₈O

4.21  TE

4.22  Agarose

4.23  Natri bicarbonate NaHCO₃

4.24  Natri azua NaN₃

4.25  Natri clorit NaCl

4.26  Natri hydro phosphate Na₂HPO₄

4.27  Kali biphosphate KH₂PO₄

4.28  Kali Clorua KCl

4.29  Tween-20

4.30  Magie Clorua MgCl₂. 6H₂O

4.31  Diethanolamine HN(CH₂CH₂OH)₂

4.32  Yeast extract

4.33  Peptone

4.34  Agar

4.35  Kali hydro phosphate K₂HPO₄

4.36  Magie Suntat MgSO₄. 7H₂O

4.37  Bacteriological agar

4.38  Nước cất vô trùng

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

5.1.1  Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng

– Diện tích điều tra: phụ thuộc vào loại cây trồng, điều kiện cụ thể tại vùng điều tra và mục đích điều tra.

– Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm điều tra theo một trong số các phương pháp sau

+ Chọn điểm theo đường chéo góc

+ Chọn điểm theo ô bàn cờ

+ Chọn điểm hình rẻ quạt

+ Chọn điểm ngẫu nhiên

+ Điều tra toàn bộ ruộng theo băng. Tại ruộng điều tra, điều tra toàn bộ ruộng theo phương pháp cuốn chiếu theo băng. Mỗi ruộng được chia ra làm các băng nhỏ, mỗi băng có chiều rộng 2 m, điều tra lần lượt từ đầu tới cuối băng và kiểm tra toàn bộ cây trồng trong mỗi băng điều tra.

– Số lượng mẫu: số lượng mẫu phụ thuộc vào mục đích điều tra và phương pháp lấy mẫu.

+ Cây ăn quả, cây lâu năm, cây công nghiệp: số lượng cây điều tra tại một điểm tối thiểu từ 3 cây đến 5 cây.

+ Cây hàng năm, rau màu, cây ngắn ngày: mỗi điểm có diện tích tối thiểu là 1 m².

5.1.2  Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước

Lấy mẫu theo TCVN 8597:2010.

5.2  Bảo quản mẫu

5.2.1  Mẫu nghi nhiễm vi khuẩn

5.2.1.1  Mẫu là các bộ phận tươi

Các bộ phận tươi nghi nhiễm vi khuẩn gây hại thực vật được chứa trong các túi lấy mẫu (3.1) bảo quản trong tủ lạnh (3.2) ở nhiệt độ từ 4 °C đến 5 °C.

Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc gửi đi giám định có thể xử lý bằng các phương pháp sau.

Ép khô

Bộ phận nhiễm bệnh được ép khô bằng cách đặt giữa các lớp giấy bản (3.3) thường là từ 4 đến 5 tờ.

Các lớp giấy bản (3.3) (có chứa mẫu) được đặt giữa 2 miếng bìa các tông và đặt vào kẹp ép mẫu thực vật (3.5) sau đỏ nén chặt bằng dây hoặc vật nặng.

Trong quá trình làm khô mẫu giấy bản (3.3) nên thay thường xuyên khoảng 1 lần/ngày.

Kẹp ép mẫu thực vật (3.5) (có chứa mẫu) có thể phơi nắng, để trong phòng có điều hòa hoặc máy sưởi để tăng hiệu quả làm khô mẫu.

Thời gian làm khô mẫu hoàn toàn thông thường là từ 5 đến 10 ngày.

Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo.

Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi lấy mẫu (3.1) vô trùng, bên ngoài đề rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu, thông tin kí chủ, thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại), địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).

Các túi lấy mẫu (3.1) bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp lưu trữ mẫu (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như Silicagel (4.1)…)

Ngâm mẫu

Bộ phận nhiễm bệnh được rửa nhẹ dưới vòi nước chảy sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng (4.38).

Mẫu được để chỗ thoáng để bề mặt khô hoàn toàn.

Có thể ngâm mẫu vào dung dịch H₂SO₄10 % (4.14) bổ sung thêm từ 2 đến 3 giọt glycerol (4.3) và từ 2 đến 3 giọt cồn 90 % (4.4) trong vòng 24 giờ.

Vớt mẫu vật ra, rửa trong nước lạnh.

Chuyển mẫu vào lọ đựng mẫu có chứa dung dịch bảo quản (Xem phụ lục C) và đậy chặt nắp.

Thay dung dịch bảo quản khi thấy hiện tượng dung dịch bị vẩn đục (hoặc 6 tháng 1 lần) cho đến khi dung dịch bảo quản không bị vẩn đục nữa thì gắn chặt lọ mẫu bằng parafin (4.5).

Dán nhãn bên ngoài lọ đựng mẫu ghi rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).

5.2.1.2  Mẫu là các sản phẩm khô

Mau được để trong các túi chứa mẫu (3.1) hoặc hộp chứa mẫu (3.9) kín có nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.2.2  Mẫu nghi nhiễm virus, phytoplasma

5.2.2.1  Mẫu là các bộ phận tươi

Các bộ phận tươi được chứa trong các túi chứa mẫu bảo quản trong tủ lạnh sâu (3.10) ở nhiệt độ âm 80 °C.

Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc mẫu gửi đi giám định có thể làm mẫu khô để bảo quản theo phương pháp sau:

Làm mẫu khô

– Bộ phận nhiễm bệnh (lá hoặc cành) được đặt trong túi chứa mẫu có chứa Silicagel (4.1). (Chú ý thay Silicagel (4.1) mới khi phần cũ đã hút ẩm tối đa)

– Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo.

– Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi chứa mẫu bằng giấy bên ngoài đề rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).

– Các túi lấy mẫu (3.1) bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như silicagel (4.1)…)

5.2.2.2  Mẫu là các sản phẩm khô

Mẫu được để trong các túi chứa mẫu (3.1) hoặc hộp chứa mẫu (3.9) kín có nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

6  Phát hiện bệnh

Phát hiện và thu thập mẫu bệnh dựa vào một số đặc tính sinh học quan trọng của loài dịch hại là phân bố, ký chủ và triệu chứng hại,

– Phân bổ: Mỗi loài vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma chỉ có khả năng tồn tại và gây hại tại vùng có điều kiện khí hậu phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của loài đó.

– Ký chủ: Mỗi loài vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma có khả năng gây hại cho một phổ ký chủ.

– Triệu chứng bệnh: Triệu chứng do vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma gây hại trên thực vật thường rất đặc trưng và khác nhau tùy thuộc vào loài vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma, loài ký chủ, bộ phận bị hại và giai đoạn hại.

7  Giám định bệnh

7.1  Giám định vi khuẩn gây bệnh thực vật

Có thể áp dụng một hoặc một số các phương pháp sau tùy thuộc vào từng loài vi khuẩn cụ thể.

7.1.1  Giám định bằng phương pháp hình thái kết hợp với phản ứng sinh hóa

7.1.1.1  Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo

Bước 1: Khử trùng bề mặt mẫu bệnh

Phần mô cây nghi nhiễm bệnh (cành, thân, lá…) được rửa sạch dưới vòi nước chảy

Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm mẫu trong dung dịch Natri hypoclorit 10 % (4.6) trong 2 phút hoặc cồn 70 % (4.4) từ 30 giây đến 60 giây sau đó rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng (4.38). Với các mô gỗ khử trùng bằng cách nhúng cồn 70 % (4.4) và hơ qua ngọn lửa đèn cồn (3.11).

Bước 2: Tách chiết vi khuẩn

Có thể tách chiết vi khuẩn từ mô cây, hạt nghi bị bệnh bằng một hoặc một số biện pháp:

– Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng (4.38).

– Nghiền mẫu trong nước cất vô trùng (4.38) hoặc trong dịch chiết.

Bước 3: Phân lập

Trang đều dịch chiết trên môi trường đặc hiệu (Xem phụ lục B). Đặt các đĩa petri (3.12) ở nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển.

Bước 4: Nuôi cấy làm thuần

Chọn các khuẩn lạc có hình thái phù hợp với mô tả hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh cấy truyền trên môi trường đặc hiệu.

7.1.1.2  Phản ứng nhuộm Gram

Có thể dùng một trong hai phương pháp sau:

Phương pháp 1

Bước 1: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc từ bước 4 điều 7.1.1.1 hoà vào 1 giọt nước cất (4.2) ở giữa lam kính, làm khô trong không khí. Thông thường các khuẩn lạc sẽ được lấy sau khi cấy 24 giờ.

Bước 2: Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần.

Bước 3: Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet) 0,5 % (4.7) trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.

Bước 4: Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol’s iodine (4.8) trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.

Bước 5: Nhỏ cồn 70 % (4.4), giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.

Bước 6: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin O 0,5 % (4.9) trong 1 đến 2 phút, rửa nước, để khô trong không khí.

Bước 7: Quan sát dưới kính hiển vi (4.21) ở vật kính có độ phóng đại 1 000 lần

Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím

Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ.

Phương pháp 2

Bước 1: Dùng pipette (3.14) nhỏ 1 giọt KOH 3 % (4.10) lên một lam kính sạch.

Bước 2: Sử dụng que cấy vòng (3.13) lấy một ít khuẩn từ môi trường (xem 7.2) nuôi cấy trộn đều với dung dịch KOH 3 % (4.10) tới khi tạo huyền phù.

Bước 3: Nhấc que cấy lên khỏi giọt dịch một khoảng 5 mm đến 20mm

Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram (-) nếu có một đám nhầy (dạng sợi) được kéo theo que cấy

Vi khuẩn Gram (+) nếu không có đám nhầy (dạng sợi) được kéo theo que cấy.

CHÚ THÍCH: Đây là phản ứng sinh hóa cơ bản và chung nhất trong giám định vi khuẩn bằng phản ứng sinh hóa. Tùy loài vi khuẩn mà bộ phản ứng sinh hóa để giám định sẽ khác nhau. Bộ phản ứng sinh hóa của từng loài vi khuẩn cụ thể sẽ được nêu trong từng tiêu chuẩn cụ thể dành riêng cho loài.

7.1.2  Giám định bằng ELISA

7.1.2.1  Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo

Thực hiện theo điều 7.1.1.1

7.1.2.2  Chuẩn bị dịch mẫu

Có thể chuẩn bị dịch mẫu từ mô bệnh hoặc từ khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn.

– Mẫu mô cây (quả, thân, lá): lấy một mẫu nhỏ mô cây (quả hoặc thân hoặc lá) ngâm trong 1 ml nước cất (4.2) khoảng 15 phút đến 20 phút. Sau đó nước chứa vi khuẩn được ly tâm 13 000 vòng/phút trong 5 phút thu kết tủa vi khuẩn. Hoà tan kết tủa vi khuẩn thu được trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (xem phụ lục A).

– Khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn: Hoà tan một phần khuẩn lạc (xem 7.1.2.1) trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (xem phụ lục A).

7.1.2.3  Quy trình thực hiện ELISA

Có thể sử dụng kít ELISA thương mại hoặc làm theo phương pháp sau:

Bước 1: Nhỏ vào mỗi giếng ELISA (3.15) 100 µl dịch mẫu.

Bước 2: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ ở 37 °C qua đêm (khoảng 4 đến 6 giờ).

Bước 3: Sau đó, nhỏ thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch đệm cố định mẫu (xem phụ lục A).

Bước 4: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 5: Rửa giếng bằng đệm rửa (xem phụ lục A) ba lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm.

Bước 6: Thêm vào mỗi giếng 100 µl kháng thể.

Bước 7: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Bước 8: Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thẩm.

Bước 9: Thêm vào mỗi giếng 100 µl Enzym gắn.

Bước 10: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Bước 11: Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm.

Bước 12: Thêm vào mỗi giếng 100 µl đệm cơ chất (xem phụ lục A). Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

7.1.2.4  Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng mắt thường hoặc bằng máy đọc ở bước sóng 405 nm.

7.1.3  Giám định bằng PCR

7.1.3.1  Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo

Thực hiện theo điều 7.1.1.1

7.1.3.2  Tách chiết DNA

Có thể tách chiết DNA từ mô bệnh hoặc từ khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn.

– Khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn: Dùng que cấy vi khuẩn (3.13) lấy một khuẩn lạc trên môi trường (xem 7.1.1) cho vào ống eppendof (3.18) đã chứa 100µl nước cất vô trùng khuấy (4.38) đều để hoà tan khuẩn lạc. Tiếp theo để ống eppendof (3.18) ở nhiệt độ 95 °C trong 15 phút trong bể ổn nhiệt (3.19) sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Ly tâm dịch vi khuẩn trong 5 đến 10 giây.

– Mẫu mô cây (quả, thân, lá): Cho 100 µl dịch chiết vi khuẩn (xem bước 2 điều 7.1.1) vào ống eppendof (3.18) và để ở nhiệt độ 95 °C trong 15 phút trong bể ổn nhiệt (3.11) sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Tiếp theo, ly tâm dịch chiết trong 5 đến 10 giây.

– Tách chiết bằng CTAB (với mô cây nghi nhiễm bệnh)

Bước 1: Nghiền nhỏ từ 0,5 g đến 1 g mô cây nghi nhiễm bệnh bằng cối và chày sứ (3.20) trong 5ml CTAB (4.11) có chứa 2 % 2 mercaptoethanol (4.18)

Bước 2: Lấy 1 ml dịch nghiền vào ống eppendof (3.18)

Bước 3: Ủ ở 65 °C trong 30 phút.

Bước 4: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút.

Bước 5: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới đo lượng dịch

Bước 6: Thêm vào ống eppendof (3.18) lượng dịch chloroform (CHCl3):isoamyl alcohol (24:1) (4.19) bằng lượng dịch thu được ở bước 4, lắc đều

Bước 7: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút.

Bước 8: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới, đo lượng dịch

Bước 9: Thêm vào ống lượng dịch isopropanol (4.20) bằng 0,7 dịch thu được ở bước 8. Lắc nhẹ, để tủa trong vòng 20 phút (nhiệt độ âm 20 °C)

Bước 10: Ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ phần dịch phía trên

Bước 11: Rửa kết tủa DNA 2 lần bằng cồn 70 % (4.4)

Bước 12: Hòa tan kết tủa DNA bằng TE (4.21), pH 8.0

7.1.3.3  Nhân gen

RNA thu được tiến hành nhân gen trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.21)

Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu.

7.1.3.4  Đọc kết quả

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose(4.21).

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước như hướng dẫn.

7.2  Giám định virus, phytoplasma bằng phương pháp RT-PCR

7.2.1  Tách chiết RNA

Có nhiều phương pháp tách chiết RNA khác nhau, tùy vào điều kiện của phòng thí nghiệm có thể áp dụng cách tách chiết khác nhau. Sau đây là một số cách tách chiết phổ biến có thể áp dụng.

– Tách chiết bằng CTAB (với mô cây nghi nhiễm bệnh)

Bước 1: Nghiền nhỏ 200 mg mô cây nghi nhiễm bệnh bằng cối và chày

Bước 2: Chuyển phần mô đã nghiền vào ống eppendof (3.18) thêm vào 500 µl dịch chiết CTAB (4.11) bổ sung 2 % 2 mercaptoethanol (4.18).

Bước 3: Ủ ở 65 °C trong 30 phút.

Bước 4: Ly tâm 10 phút tốc độ 12000 vòng/phút.

Bước 5: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới đo lượng dịch

Bước 6: Thêm vào ống lượng dịch chloroform: isoamyl alcohol(24:1) (4.19) gấp đôi lượng dịch thu được ở bước 4, lắc đều

Bước 7: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút.

Bước 8: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới, đo lượng dịch

Bước 9: Thêm vào ống lượng dịch isopropanol (4.20) bằng 2/3 dịch thu được ở bước 8. Lắc nhẹ để tủa trong vòng 1 giờ (nhiệt độ âm 20 °C)

Bước 10: Ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần dịch phía trên

Bước 11: Rửa tủa 2 lần bằng cồn 70 % (4.4)

Bước 12: Hòa tan tủa bằng TE (4.21), pH 8.0

– Tách bằng kít (ví dụ cụ thể của hãng QIAGEN)

Bước 1: Thêm 10 µl 2-mercaptoethanol vào 1 ml dịch chiết RLT

Bước 2: Thêm 450 µl dịch chiết ở bước 1 vào 0,1 g mẫu tươi hoặc 0,02 g mẫu đông lạnh

Bước 3: nghiền nhỏ mẫu

Bước 4: Chuyển dịch nghiền mẫu vào ống ly tâm màu tím (được đặt trong ống ly tâm 2 ml)

Bước 5: Ly tâm ở 13 000 vòng/phút trong 2 phút

Bước 6: Chuyển dịch phía dưới ống sang ống mới (không lấy phần cặn ly tâm)

Bước 7: Chuyển phần dịch thu được ở bước 6 sang cột ly tâm màu hồng (đặt trong ống ly tâm 2ml)

Bước 8: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 15 giây Bước 9: Loại bỏ dịch ở ống 2 ml

Bước 10: Thêm vào cột ly tâm màu hồng 700 µl đệm RW1

Bước 11: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 15 giây

Bước 12: Loại bỏ dịch ở ống 2 ml

Bước 13: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 2 phút

Bước 14: Đặt cột ly tâm màu hồng vào ống ly tâm 1,5 ml mới

Bước 15: Thêm 30 µl Rnase-free water vào cột ly tâm màu hồng

Bước 13: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 1 phút

7.2.2  Nhân gen

Nhân gen trong máy chu trình nhiệt PCR (3.21).

Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu.

Chu trình nhiệt được thiết kế dựa theo trình tự mồi

7.2.3  Đọc kết quả

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose (4.21)

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước như hướng dẫn.

8. Báo cáo

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

– Thông tin về mẫu giám định.

– Tên loài

– Phương pháp giám định

– Người giám định/cơ quan giám định

 

Phụ lục B

(Quy định)

Chuẩn bị và điều chế môi trường nhân tạo

B.1  Hấp, sấy khử trùng

B.1.1  Sấy khử trùng

Dùng phương pháp này để khử trùng hộp lồng và dụng cụ thủy tinh. Dụng cụ phải được rửa sạch và gói riêng rẽ bằng giấy nhôm rồi đặt vào hộp bằng chất liệu phù hợp để có thể sấy được. Tránh không nên sử dụng giấy để gói vì sẽ làm dính kết vào dụng cụ và có thể gây cháy trong quá trình sấy. Dụng cụ thủy tinh có thể được sấy trong tủ sấy bằng không khí nóng, các đồ sấy không nên xếp quá chật để đảm bảo không khí nóng đối lưu, khí nóng phải đảm bảo tiếp xúc đều tất cả các phần của dụng cụ để quá trình sấy đạt hiệu quả tốt.

Có thể sử dụng các nhiệt độ và cách sấy sau:

Nhiệt độ	Thời gian
120 °C	8 giờ
140 °C	3 giờ
160 °C	1 giờ
180 °C	20 phút

B.1.2  Hấp khử trùng bằng nồi hấp

Dùng phương pháp này để khử trùng môi trường nhân tạo. Các nồi hấp vô trùng tự động (autoclave) hoặc các nồi áp suất đều có thể sử dụng để hấp vô trùng. Các môi trường nhân tạo sau khi điều chế được đựng trong các bình thủy tinh có nắp. Các bình này được đặt trong các lồng, hộp của nồi hấp vô trùng và đặt vào nồi hấp. Không nên để nghiêng hay rót môi trường quá đầy tránh làm trào môi trường trong quá trình khử trùng. Không nên xếp chồng chéo hoặc quá đầy ảnh hưởng tới luồng không khí đối lưu trong nồi hấp. Hấp khử trùng thường ở nhiệt độ 121 °C trong thời gian 30 phút.

Khi vận hành nồi hấp vô trùng kiểu mới (autoclave) hay kiểu cũ đều cần sự giám sát cẩn thận và tuân thủ hướng dẫn sử dụng máy.

B.2  Điều chế môi trường nhân tạo

B.2.1  Môi trường Nutrient agar

Thành phần

Lab- Lemco Powder (4.13)	1 g
Yeast extract (4.32)	2 g
Peptone (4.33)	5 g
NaCl (4.25)	5g
Agar (4.34)	15g
Nước cất (4.2)	1 000 ml

Phương pháp điều chế:

Hòa tan các thành phần trên theo thứ tự vào nước cất, chỉnh pH 7,2 đến 7,4.

Hấp khử trùng (xem B.1.2).

B.2.2  Môi trường King’ B

Thành phần

Peptone (4.33)	20 g
Glycerol (4.3)	10 ml
K2HPO4 (4.13)	1,5 g
MgSO4. 7 H2O (4.36)	1,5 g
Bacteriological agar (4.37)	15 g
Nước cất (4.2)	1 000 ml

Phương pháp điều chế:

Hòa tan các thành phần trên theo thứ tự vào nước cất chỉnh pH tới 7,2 ± 0,2

Hấp khử trùng (xem B.1.2).

CHÚ THÍCH: Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại môi trường nhân tạo để nuôi vi khuẩn có thể mua các loại môi trường này sau đó điều chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc tự điều chế theo phương pháp nêu trên.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Dung dịch bảo quản mẫu

Có thể sử dụng một trong những dung dịch bảo quản sau:

Dung dịch 1:
	CuSO4 (4.15)	85 g
	H2SO3 (4.16)	28,4 ml
	Nước (4.2)	2 485 ml
Dung dịch 2:
	H2SO3 (4.16)	284 ml
	Nước (4.2)	3 785 ml
Dung dịch 2:
	Muối bão hòa	1 000 ml
	Fomalin (4.17)	500 ml
	Nước (4.2)	870 ml
Dung dịch 3:
	Fomalin (4.17)	450 ml
	Cồn 70 % (4.4)	540 ml
	Nước (4.2)	1 810 ml

Cách pha dung dịch muối bão hòa:

Hòa tan muối trong nước nóng đến mức độ bão hòa.

Để dung dịch nguội trong 3 giờ.

Lọc bỏ phần không tan hết

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bradbury J. F,1986. Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.

[2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[3] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.

[4] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

[5] QCVN 01-175:2014. Lưu giữ, bảo quản và vận chuyển mẫu trong kiểm dịch thực vật