TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12371-2-3:2019 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT – PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12371-2-3:2019

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL.

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-3: Particular requirements for Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

Lời nói đầu

TCVN 12371-2-3: 2019 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

– Phần 1: Yêu cầu chung

– Phần 2-1 : Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

– Phần 2-2 : Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

– Phần 2-3 : Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-3: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL.

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-3: Particular requirements for Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu về quy trình giám định vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12371-1: 2019, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:

3.1  Bình tam giác

3.2  Đĩa petri

3.3  Túi nilong

3.4  Máy chu trình nhiệt (PCR)

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1  Cồn 70 %

4.2  Nước cất vô trùng

4.3  Agarose

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 12371-1:2019 (điều 5.1).

5.2  Bảo quản mẫu

Bảo quản mẫu giám định hoặc sau khi giám định như sau:

+ Thân, cành, lá, quả, rễ bảo quản tươi, ép khô hoặc ngâm mẫu theo TCVN 12371-1: 2019 (điều 5.2.1.1)

+ Hạt theo TCVN 12371-1: 2019 (điều 5.2.1.2)

6  Phát hiện bệnh

Trên lá, vết bệnh ban đầu là những đốm màu xanh nhợt có dạng giọt dầu ở phần phiến lá giữa các gân lá. Các vết này nhanh chóng khô đi tạo ra các vết chết hoại có màu trắng. Khi bệnh từ phiến lá xâm nhiễm vào hệ thống mạch dẫn một số lá chết ở một phía của lá kép bị héo rũ.

Trên thân cây, triệu chứng bệnh có thể là các sọc vàng, đôi khi thân bị nứt dọc theo các đốt thân. Bó mạch của các cây nhiễm bệnh có màu vàng sậm hoặc nâu.

Trên quả, triệu chứng thường bắt đầu từ những đốm nhỏ hơi lồi lên, vết bệnh có viền hoặc quầng trắng. Các vết bệnh phát triển to ra và có màu nâu ở tâm vết bệnh tạo ra dạng “mắt chim”.

Trên hạt, bệnh không biểu hiện triệu chứng.

Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước mà vi khuẩn có phân bố (xem phụ lục A) và các loài cây mà vi khuẩn gây hại (xem phụ lục A).

7  Giám định bệnh

7.1  Giám định bằng ELISA

7.1.1  Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo

Bước 1: Khử trùng bề mặt mẫu bệnh

Phần mô cây nghi nhiễm bệnh (cành, thân, lá…) được rửa sạch dưới vòi nước chảy.

Nhúng mẫu trong dung dịch cồn 70 % (4.1) trong 30 giây đến 60 giây tùy kích thước mẫu.

Bước 2: Tách chiết vi khuẩn

Tách chiết vi khuẩn từ mô cây (lá, thân, quả): cắt một đoạn mô cây đã được khử trùng bề mặt và ngâm trong 100 ml nước cất vô trùng 30 phút hoặc nghiền nhỏ mô cây trong 10 ml nước cất vô trùng (4.2).

Tách chiết vi khuẩn từ hạt: Hạt được cho vào bình tam giác (3.1) có chứa 20 ml dịch chiết hạt (xem phụ lục D) và lắc mạnh bằng tay trong 20 đến 30 giây. Sau đó, đưa bình tam giác (3.1) có dịch chiết hạt lên máy lắc và lắc trong 36 giờ đến 48 giờ với tốc độ 150 vòng/phút.

Bước 3: Phân lập

Trang đều 1 ml dịch chiết thu được trên môi trường NGA (Nutrient Glucose Agar) (xem phụ lục B) hoặc YPGA (Yeast Peptone Glucose Agar) (xem phụ lục B) chứa trong các đĩa petri (3.2). Đặt các đĩa petri ở nhiệt độ 26 °C trong 8 ngày.

Bước 4: Nuôi cấy làm thuần

Chọn các khuẩn lạc vàng sáng, có bóng mờ, có rìa tròn cấy truyền sang đĩa có môi trường đặc hiệu. Đặt các đĩa petri ở nhiệt độ 26 °C trong 8 ngày.

7.1.2  Chuẩn bị dịch mẫu

Có thể chuẩn bị dịch mẫu từ mô bệnh hoặc từ khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn.

– Mẫu mô cây (quả, thân, lá): lấy một mẫu nhỏ mô cây (quả hoặc thân hoặc lá) ngâm trong 1 ml nước cất khoảng 15 đến 20 phút. Sau đó nước chứa vi khuẩn được ly tâm 13 000 vòng/phút trong 5 phút thu kết tủa vi khuẩn. Hòa tan kết tủa vi khuẩn thu được trong 1 ml dung dịch đệm chiết mẫu.

– Khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn: Hòa tan một phần khuẩn lạc (xem 7.1.1) trong 1 ml dung dịch đệm chiết mẫu.

7.1.3  Quy trình thực hiện ELISA

Bước 1: Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 µl dịch mẫu (xem 7.1.2) đã chuẩn bị.

Bước 2: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.3) ủ ở 37°C qua đêm (khoảng 4 đến 6 giờ).

Bước 3: Sau đó, nhỏ thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch đệm cố định mẫu.

Bước 4: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.3) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 5: Rửa giếng bằng đệm rửa ba lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm.

Bước 6: Thêm vào mỗi giếng 100 µl kháng thể.

Bước 7: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.3) ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Bước 8: Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm.

Bước 9: Thêm vào mỗi giếng 100 µl Enzym gắn.

Bước 10: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Bước 11: Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm.

Bước 12: Thêm vào mỗi giếng 100 µl đệm cơ chất. Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

7.1.4  Đọc kết quả: Đọc kết quả bằng mắt thường hoặc bằng máy đọc ở bước sóng 405 nm.

7.2  Giám định bằng PCR

7.2.1  Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo

Thực hiện theo điều 7.1.1

7.2.2  Tách chiết DNA

Thực hiện theo điều 7.1.3.2 TCVN 12371-1: 2019.

7.2.3  Nhân gen

Đoạn mồi sử dụng.

PSA-4: 5′-TCA TTG GTC AAT TCT GTC TCC C -3′

PSA-R: 5′-TAC TGA GAT GTT TCA CTT CCC C -3′

Chu trình nhiệt:

7.2.4  Đọc kết quả

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose 2 % (4.3).

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 270 bp.

7.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. khi:

– Phương pháp ELISA cho kết quả là dương tính.

hoặc

– Phương pháp PCR cho kết quả là dương tính.

8  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

– Thông tin về mẫu giám định.

– Tên loài

– Phương pháp giám định

– Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục B.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh thối loét cà chua

Tên khoa học: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

Tên khác:

Corynebacterium michiganense pv. michiganense (Smith) Dye & Kemp

Corynebacterium michiganense (Smith) Jensen

Vị trí phân loại:

Lớp: Actinobacteria.

Bộ: Actinomycetales

Họ: Microbacteriaceae

Giống: Clavibacter

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: Israel, Turkey, Armenia, Azerbaijan, China, India, Indonesia, Iran; Japan, Korea, Syria, Lebanon, Thailand; Châu Phi: South Africa, Egypt, Kenya, Madagascar, Togo, Uganda, Zambia, Morocco, Tanzania; Tunisia; Zimbabwe, Republic of the Congo; Châu Mỹ: Canada, USA, Mexico, Uruguay, Belize, Costa Rica, Cuba, Dominica, Dominican Republic, Grenada; Guadeloupe, Martinique, Panama; Argentina, Brazil, Colombia, Peru, Chile, Ecuador; Châu Âu: France, Greece, Rusian Federation, Switzeland, Czech, Lithuania, Netherland, Belarus, Poland, Romania, Belgum, Bulgaria, Cyprus, Finland, Germany, Hungary, Italy, Ukraine; Châu Đại Dương: Australia, Fiji, Guam, New Caledonia, New Zealand, Tonga

A.3  Ký chủ

Solanum lycopersicum (Cà chua), Capsicum annuum (ớt), Solanum nigrum (lu lu đực)

A.4  Đặc điểm sinh học

Nguồn lây nhiễm chính trên cây cà chua thường là từ các hạt bị nhiễm. Bệnh lây lan cho các cây con khác bằng các hoạt động như cắt tỉa và đóng gói để trồng; buộc cây, uốn cây và cho cây leo giàn; ngắt lá, ngắt chồi bên và buộc cây trong nhà kính, và nói chung là bằng nước mưa, tưới phun hoặc phun chất hóa học. Bó mạch bị xâm nhiễm có thể dẫn tới cây bị còi cọc, héo và làm chết cây non. Mặc dù quần thể vi khuẩn gây bệnh thối loét quả cà chua giảm rất nhanh khi tàn dư thực vật phân hủy trong đất nhưng chúng có khả năng tồn tại lâu dài trong các tàn dư chưa bị phân hủy trên mặt đất và là nguồn lây nhiễm đầu tiên cho cây trồng ở vụ sau. Vi khuẩn gây bệnh thối loét quả cà chua còn có thể tồn tại trên những cây cà chua dại và các cây kí chủ khác và trở thành nguồn truyền lan của bệnh. Trên đồng ruộng, vi khuẩn gây bệnh thối loét quả cà chua có thể lây truyền giữa các cây cạnh nhau do nước, hoạt động của máy móc cơ giới hoặc hoạt động canh tác của con người khi làm đất làm cho rìa lá chết hoại và quả bị đốm. Vi khuẩn gây bệnh thối loét quả cà chua có thể tồn tại dưới dạng hoại sinh trên bề mặt của lá cà chua. Bệnh gây héo lá và giảm năng suất. Các cây cà chua non mẫn cảm với bệnh hơn các giai đoạn khác. Trong điều kiện tự nhiên cây cà chua cảm nhiễm với bệnh trong suốt thời kì sinh trưởng của nó. Sự khác nhau về thời gian ủ bệnh trước khi triệu chứng của bệnh xuất hiện phụ thuộc vào tuổi của cây, mức độ kháng, nhiệt độ và nồng độ xâm nhiễm. Khi điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển thì triệu chứng biểu hiện cũng nặng hơn. Vi khuẩn tập trung ở mạch gỗ và có thể gây ra các vết nứt. Các bó mạch nhiễm bệnh chứa các hạt nhớt, các vết chai và khối vi khuẩn.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:
2. Nước xuất khẩu:
3. Xuất xứ:
4. Phương tiện vận chuyển: Khối lượng:
5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Tình trạng mẫu:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Số mẫu lưu:
11. Người giám định:
12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-3: 2019 về “Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al”.
13. Kết quả giám định:

Tên tiếng việt: Bệnh thối loét cà chua

Tên khoa học: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

Vị trí phân loại:

Lớp: Actinobacteria.

Bộ: Actinomycetales

Họ: Microbacteriaceae

Giống: Clavibacter

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bradbury J. F, 1986. Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.

[2] CABI, (2017), Crop Protection Compedium.

[3] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[4] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.

[5] J.M.waller, M.Bigger and R.A.Hillocks, 2007, Coffee pests, diseases & their management, CAB international.

[6] TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật – Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.

[7] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.