TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12381:2018 (EN 16155:2012) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SUCRALOSE – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12381:2018

EN 16155:2012

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SUCRALOSE PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of sucralose – High performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 12381:2018 hoàn toàn tương đương với EN 16155:2012;

TCVN 12381:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SUCRALOSE PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of sucralose – High performance liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng sucralose trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bằng cách rửa giải từ cột pha đảo (RP) sử dụng metanol pha nước, sau đó phát hiện bằng detector chỉ số khúc xạ (RI) [1].

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm phân tích sucralose (từ 83 mg/kg đến 737 mg/kg) trong các mẫu thêm chuẩn của tương cà chua, mayonnaise, bánh quy, sữa chua, bột hòa tan trong nước giải khát và kẹo.

Để biết thêm thông tin về kết quả đánh giá xác nhận, xem Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

3  Nguyên tắc

Tùy thuộc vào tính chất đồng nhất của chúng, mẫu được hòa tan trong nước hoặc pha loãng với nước, và nếu thích hợp, được lọc hoặc làm trong bằng dung dịch Carrez cải biến. Sau đó, dung dịch mẫu được chiết trên cột chiết pha rắn và được rửa giải bằng hỗn hợp metanol/nước, hàm lượng sucralose được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bằng cách rửa giải ra khỏi cột pha đảo (RP), sử dụng metanol trong pha nước, sau đó bằng detector chỉ số khúc xạ. Cách khác, có thể sử dụng detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD). Việc định lượng được thực hiện bằng cách áp dụng phương pháp ngoại chuẩn. Hàm lượng sucralose trong thực phẩm được tìm ra là 1,6-dichloro-1,6-dideoxy-β-D-fructofuranosyl-4-chloro-4-deoxy-α-D-galactopyranoside, xác định theo phương pháp quy định trong trong tiêu chuẩn này.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có các quy định khác. Có thể sử dụng các dung dịch bán sẵn trên thị trường có chất lượng tương đương với thuốc thử đã được liệt kê dưới đây.

4.1  Sucralose, (C₁₂H₁₉Cl₃O₈, MW: 397,63),

4.2  Kali hexacyanoferrate(II), K₄[Fe(CN)₆] 3H₂O.

4.3  Kẽm nitrat, Zn(NO₃)₂6H₂O.

4.4  Metanol, dùng cho HPLC.

4.5  Dung dịch gốc (ρ_suc = 1 000 mg/l).

Cân khoảng 100 mg sucralose, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong nước và thêm nước đến vạch. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng. Phải tính đến hàm lượng nước và độ tinh khiết của chất chuẩn.

4.6  Dung dịch chuẩn (ρ_suc = 20 mg/l đến 100 mg/l).

Nồng độ của dung dịch chuẩn được đưa ra sau đây chỉ là các ví dụ và có thể thay đổi tùy thuộc vào độ nhạy của thiết bị và dải nồng độ bao trùm, cần chú ý để không vượt quá dải tuyến tính của hệ thống detector.

Từ dung dịch gốc (4.5), chuẩn bị ít nhất 5 dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng sao cho nồng độ sucralose thu được, ví dụ: 20 mg/l, 40 mg/l, 60 mg/l, 80 mg/l và 100 mg/l. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày phân tích.

4.7  Dung dịch Carrez cải biến

4.7.1  Dung dịch A [kali hexacyanaferrate(II)]

Hòa tan 53,45 g kali hexacyanaferrate(II) (4.2) trong nước và thêm nước đến vạch 500 ml.

4.7.2  Dung dịch B (kẽm nitrat)

Hòa tan 148,75 g kẽm nitrat (4.3) trong nước và thêm nước đến 500 ml.

4.8  Dung dịch rửa giải dùng cho HPLC

Trộn đều một phần thể tích metanol (4.4) với 3 phần thể tích nước.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau đây:

5.1  Bộ lọc màng, dùng để lọc mẫu, cỡ lỗ: tối đa 0,45 µm.

5.2  Giấy lọc gấp nếp.

5.3  Ống chiết pha rắn (SPE) C18, 500 mg.

5.4  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm có:

– bơm;

– bộ bơm mẫu;

– detector RI kiểm soát nhiệt độ, hoặc ELSD;

– lò cột;

– hệ thống đánh giá.

5.5  Cột tách pha đảo C18, kích thước 250 mm x 4 mm, ví dụ, Lichrospher®1) 100 RP-18,5 µm hoặc cột tương tự.

Cần sử dụng cột bảo vệ có vật liệu nhồi tương tự để bảo vệ cột phân tích.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu

Đồng hóa vật liệu thử bằng phương pháp phù hợp. Ví dụ, mẫu dạng lỏng có thể được khuấy, các sản phẩm rắn như kẹo cứng có thể được nghiền và các sản phẩm như kẹo cao su được làm đông lạnh sâu và sau đó nghiền. Các sản phẩm bán rắn như sữa chua hoặc tương cà chua có thể được đồng nhất bằng cách khuấy, sau đó được làm trong bằng dung dịch Carrez cải biến (4.7), nếu cần.

Một số mẫu có thể cần xử lý sơ bộ bằng ống SPE.

6.2  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

6.2.1  Mẫu hòa tan (ví dụ: kẹo cứng và các sản phẩm tương tự)

Hòa tan khoảng 5 g, chính xác đến 1 mg, mẫu đã đồng nhất trong nước đựng trong bình định mức 50 ml và thêm nước đến vạch. Lọc qua bộ lọc màng nếu dung dịch bị đục.

6.2.2  Các mẫu hòa tan không hoàn toàn (ví dụ: bánh ngọt, kẹo cao su, sữa chua, tương cà chua, mayonnaise)

Trộn khoảng 5 g mẫu đã đồng nhất, chính xác đến 1 mg, với khoảng 25 ml nước đựng trong bình định mức 50 ml và khuấy trong 30 min ở khoảng 40 °C đến 60 °C (máy khuấy từ) hoặc xử lý trong bể siêu âm. Trộn đều các mẫu chứa protein với 1 ml của từng dung dịch Carrez cải biến (4.7.1 và 4.7.2) và lắc sau mỗi lần bổ sung. Sau đó đưa dung dịch mẫu về nhiệt độ phòng và thêm nước đến vạch. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, sau đó lọc qua bộ lọc màng nếu dung dịch bị đục.

6.2.3  Chiết pha rắn

Ổn định cột chiết pha rắn (5.3) với 5 ml của mỗi loại metanol và nước. Bơm 5 ml dung dịch mẫu trong 6.2.1 hoặc 6.2.2 tương ứng lên cột đã được ổn định. Sau đó, rửa ống ba lần, mỗi lần 5 ml nước, cẩn thận không để cột chảy đến khô trong các bước này. Sau đó, rửa giải sucralose ra khỏi cột bằng 5 ml dung chất rửa giải HPLC (4.8). Thu lấy dịch vào bình định mức 10 ml cho đến khi cột khô và thêm nước đến vạch. Lọc chất rửa giải qua bộ lọc màng (5.1) và chuyển vào lọ thủy tinh dùng cho HPLC.

6.3  Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Khi sử dụng cột theo 5.5, các thông số sau đây cho thấy phù hợp:

– Thể tích bơm: đến 100 µl

– Chất rửa giải: (4.8)

– Nhiệt độ lò cột: 35 °C

– Nhiệt độ detector RI: 30 °C

– Tốc độ dòng: khoảng 1,2 ml/min.

6.4  Nhận biết

Bơm dung dịch mẫu thử vào hệ thống HPLC, tốt nhất ở các điều kiện như đề cập trong 6.3. Nhận biết sucralose trong mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu của pic mẫu với thời gian lưu của dung dịch sucralose chuẩn. Cách nhận biết bổ sung bao gồm việc bổ sung sucralose vào mẫu và trong phép xác định nếu các pic chồng lên nhau.

6.5  Định lượng

Việc định lượng được thực hiện bằng cách dựa theo đường chuẩn của diện tích pic và nồng độ sucralose.

Dựng diện tích pic thu được so với nồng độ. Đường thẳng (y = a + bx) theo các kết quả, trong đó b là giá trị độ dốc của hàm tuyến tính và a là giao điểm của hàm hiệu chuẩn trên trục y.

Phải kiểm tra đặc tính thích hợp của đường chuẩn.

7  Tính kết quả

Định lượng nồng độ khối lượng ρ_Suc, tính bằng miligam trên lít hoặc phần khối lượng w_Suc tính bằng miligam trên kilogam sucralose (suc) bằng cách tích hợp diện tích pic (R) thu được từ phép phân tích dung dịch mẫu đã bơm.

Nồng độ sucralose, ρ_Suc hoặc w_Suc, trong mẫu sau đó được tính bằng cách sử dụng hàm hiệu chuẩn theo Công thức (1):

ρ_suc hoặc w_suc (1)

Trong đó:

R là đáp ứng diện tích pic;

a là giao điểm của đường chuẩn (6.5);

b là độ dốc của đường chuẩn (6.5);

V là tổng thể tích của dung dịch mẫu (ví dụ: 50 ml);

m là khối lượng của mẫu (ví dụ: 5 g).

Kết quả được làm tròn đến số nguyên.

8  Độ chụm

8.1  Yêu cầu chung

Dữ liệu thống kê về xác định sucralose được thu thập trong năm 2007/2008 trong hai thử nghiệm liên phòng trên các sản phẩm sau: sốt cà chua, mayonnaise có nồng độ sucralose cao và thấp, bánh quy, sữa chua, 2 loại nước giải khát dạng bột hòa tan và 2 viên nén (kẹo) có hương vị và nồng độ khác nhau. Các giá trị từ phép thử liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng cho các dải nồng độ chất phân tích và các chất nền khác với dải nồng độ và nền mẫu nêu trong Phụ lục A.

8.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi xác định trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn độ lặp lại r. Độ lặp lại phụ thuộc vào mức nồng độ của chất phân tích trong mẫu.

8.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm thực hiện, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

1. a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;
2. b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng;
3. c) ngày và thời gian tiến hành lấy mẫu (nếu biết);
4. d) ngày nhận mẫu:
5. e) ngày thử nghiệm;
6. f) kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;
7. g) các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;
8. h) các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc các tùy chọn khác có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Phương pháp này do nhóm làm việc “Chất tạo ngọt” của Văn phòng Bảo vệ người tiêu dùng và An toàn Thực phẩm Liên bang Đức (Bundesamt fur. Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, BVL) biên soạn nhằm mục đích thực hiện § 64 LFGB. Phép thử được thử nghiệm trong hai phép thử liên phòng thử nghiệm tương ứng với tổng số 10 và 9 phòng thử nghiệm, xem [2] và Bảng A.1.

Bảng A.1 – Dữ liệu thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Quinlan, M. E., Jenner, M. R., 1990. Analysis and stability of the Sweetener Sucralose in Beverages. Journal of Food Science, 55,244-246

[2] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung des Gehaltes an Sucralose in Lebensmitteln L 00.00126, Januar 2010 (Food Analysis: Determination of sucralose content in foodstuffs L 00.00- 126, 201001) in: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB: Verfahren zur probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegen- standen/Bundesgesundheitsamt (In: Collection of official methods under article 64; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office) Loseblattausgabe, Stand Jan. 2010 Bd. 1 (Loose leaf edition, as of 2010-01 Vol I.) Berlin, Koln: Beuth Veriag GmbH

1) Lichrospher^®1) 100 RP-18 là ví dụ về sản phẩm phù hợp có bản sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.