TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12600:2018 (EN 16006:2011) VỀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH TỔNG FUMONISIN B1 VÀ B2 TRONG THỨC ĂN HỖN HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH VÀ HPLC PHA ĐẢO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG CÓ TẠO DẪN XUẤT TRƯỚC CỘT HOẶC SAU CỘT

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12600:2018

EN 16006:2011

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH TỔNG FUMONISIN B1 VÀ B2 TRONG THỨC ĂN HỖN HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH VÀ HPLC PHA ĐẢO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG CÓ TẠO DẪN XUẤT TRƯỚC CỘT HOẶC SAU CỘT

Animal feeding stuffs – Determination of the sum of fumonisin B1 & B2 in compound animal feed with immunoaffinity clean-up and RP-HPLC with fluorescence detection after pre- or postcolumn derivatisation

Lời nói đầu

TCVN 12600:2018 hoàn toàn tương đương với EN 16006:2011;

TCVN 12600:2018 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH TỔNG FUMONISIN B1 VÀ B2 TRONG THỨC ĂN HỖN HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH VÀ HPLC PHA ĐẢO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG CÓ TẠO DẪN XUẤT TRƯỚC CỘT HOẶC SAU CỘT

Animal feeding stuffs – Determination of the sum of fumonisin B1 & B2 in compound animal feed with immunoaffinity clean-up and RP-HPLC with fluorescence detection after pre- or post–column derivatisation

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng fumonisin B₁ và B₂ (FB₁ và FB₂) trong thức ăn hỗn hợp ở mức từ 3 mg/kg đến 16 mg/kg.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 7150:2007 (ISO 835:2007), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Pipet chia độ.

TCVN 7153:2002 (ISO 1042:1998), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức.

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

FB₁ và FB₂ được chiết ra khỏi mẫu thử bằng dung dịch metanol 50 % trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS). Dịch chiết sau đó được pha loãng với PBS và làm sạch bằng cách sử dụng cột ái lực miễn dịch (IAC). FB₁ và FB₂ sau đó được tách ra khỏi IAC bằng metanol và sau đó bằng nước. Sau khi điều chỉnh thể tích, dịch rửa giải thu được từ cột IAC được bơm trực tiếp vào HPLC và FB₁ và FB₂ được phát hiện bằng detector huỳnh quang sau khi tạo dẫn xuất trước hoặc sau cột.

4  Thuốc thử và vật liệu thử

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử loại phân tích, trừ khi có quy định khác. Các dung môi phải có chất lượng HPLC hoặc chất lượng tốt hơn và chỉ sử dụng nước cất hai lần hoặc nước sạch loại 2 như quy định trong TCVN 4851 (ISO 3696).

4.1  Nước cất hai lần hoặc nước đã khử ion phù hợp với TCVN 4851 (ISO 3696).

4.2  Metanol (CH₃OH)

CẢNH BÁO – Metanol là chất độc và phải thực hiện công việc trong tủ hút. Phải mang trang bị bảo hộ phù hợp (quần áo phòng thí nghiệm, kính bảo hộ, găng tay).

4.3  Axetonitril (CH₃CN)

CẢNH BÁO – Axetonitril là chất độc và phải thực hiện công việc trong tủ hút. Phải mang mặc trang bị bảo hộ phù hợp (quần áo phòng thí nghiệm, kính bảo hộ, găng tay).

4.4  Kali clorua (KCl).

4.5  Natri clorua (NaCl).

4.6  Dinatri hydrophosphat ngậm 12 phân tử nước (Na₂HPO₄.12 H₂O).

4.7  Dinatri tetraborat ngậm 10 phân tử nước (Na₂B₄O₇.10H₂O).

4.8  Natri carbonat (Na₂CO₃).

4.9  Axit boric (H₃BO₃).

4.10  Kali sulfat (K₂SO₄).

4.11  NAC, N-Acetyl-L-Cystein (C₅H₉NO₃S).

4.12  OPA, o-Phthalaldehyd [C₆H₄ (CHO)₂].

4.13  BME, β-Mercaptoethanol (HOCH₂CH₂SH).

4.14  Axit formic (HCO₂H), 98 % đến 100 %.

CẢNH BÁO – Axit formic đậm đặc là chất độc và phải thực hiện công việc trong tủ hút. Phải mang mặc trang bị bảo hộ phù hợp (quần áo phòng thí nghiệm, kính bảo hộ, găng tay).

4.15  PBS đậm đặc, dung dịch muối đệm phosphat đậm đặc

Hoà tan các chất sau đây vào 1 800 ml nước (4.1):

– 4 g KCl (4.4);

-160 g NaCl (4,5);

– 72 g Na₂HPO₄.12H₂O (4.6).

Chỉnh pH đến 7,4 bằng HCl 10 mol/l và thêm đủ đến 2 000 ml.

4.16  PBS sẵn để sử dụng

Pha loãng 100 ml PBS đậm đặc (4.15) đến 1 000 ml với nước (4.1),

hoặc là

Viên nén PBS, viên muối đệm phosphat

Hòa tan một viên vào 200 ml nước (4.1) sẽ được dung dịch đệm phosphat 0,01 mol/l, kali clorua 0,0027 mol/l và natri clorua 0,137 mol/l, pH 7,4 ở 25°C (ví dụ: Sigma P4417).

4.17  Dịch pha loãng

Trộn 50 phần thể tích metanol (4.2) với 50 phần thể tích nước (4.1).

4.18  Dung môi chiết

Trộn 50 phần thể tích metanol (4.2) với 50 phần thể tích PBS (4.16).

4.19  Dung dịch đệm phản ứng

4.19.1  Tạo dẫn xuất sau cột (OPA 0,006 mol/l, NAC 0,006 mol/l, cacbonat natri 0,384 mol/l, axit boric 0,216 mol/l và kali sulfat 0,108 mol/l):

– Hòa tan 40,7 g natri cacbonat (4.8), 13,4g axit boric (4.9) và 18,8g kali sulfat (4.10) vào 1,0 L nước (4.1);

– Khuấy trong 10 min;

– Thêm 800 mg OPA (4.12) vào mỗi 1,0 L dung dịch nêu trên;

– Thêm 1 g NAC (4.11) vào mỗi 1,0 L dung dịch nêu trên;

– Khuấy trong 10 min;

– Xử lý bằng siêu âm trong 15 min;

– Khuấy trong 10 min;

– Xử lý lại bằng siêu âm trong 15 min và

– Lọc dung dịch qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 µm (5.17).

Việc hòa tan hoàn toàn OPA là rất quan trọng.

Không nên thay đổi dung dịch đệm phản ứng trong khi chạy HPLC. Chuẩn bị dung dịch mới cho mỗi lần chạy HPLC.

4.19.2  Tạo dẫn xuất trước cột (OPA 0,05 mol/l, BME 0,12 mol/l, dinatri tetraborat 0,08 mol/l, metanol 16,7%):

– Hoà tan 40 mg OPA (4.12) trong 1,0 ml metanol (4.2);

– Trộn cho đến khi hòa tan hoàn toàn;

– Thêm 5,0 ml dung dịch dinatri tetraborat decahydrat 0,1 mol/l (3,8 g/100 ml; 4.7);

– Trộn kỹ;

– Thêm 50 µl BME (4.13), và

– Trộn kỹ.

Ngoài ra có thể dùng:

– Thuốc thử phthaldialdehyd.

4.20  Dung dịch chuẩn gốc FB₁ và FB₂

– Dung dịch Fumonisin FB₁ và FB₂ đã được chứng nhận có chứa mỗi chất khoảng 50 µg/ml trong dung môi thích hợp. Lấy chính xác nồng độ được ghi trên giấy chứng nhận, hoặc là

Hòa tan riêng rẽ từng Fumonisin FB₁ và FB₂ bằng các dung môi thích hợp và trộn với nhau sao cho thu được dung dịch gốc có chứa khoảng 50 µg/ml. Tính chính xác nồng độ và pha loãng.

CHÚ THÍCH 1: Cân chính xác hóa chất khô và đong chính xác các thể tích dung môi để hòa tan chúng.

CHÚ THÍCH 2: Các dung dịch trên có thể được bảo quản trong thời gian tối đa là 6 tháng ở nhiệt độ dưới -18 °C ở nơi tối.

4.21  Dung dịch FB₁ và FB₂ chuẩn trung gian

– Cho 160 µl dung dịch gốc FB₁ và FB₂ (4.20) vào bình định mức 2 ml (5.13), và

– Thêm dịch pha loãng (50 % metanol, 4.17) đến vạch (2,0 ml).

thu được 2,0 ml dung dịch chứa khoảng 4 µg/ml FB₁ và khoảng 4 µg/ml FB₂ (50/50 thể tích).

4.22  Các dung dịch hiệu chuẩn

Từ dung dịch chuẩn trung gian (4.21) chuẩn bị 5 mức hiệu chuẩn bằng cách cho các dung tích dung dịch gốc pha loãng như liệt kê trong bảng sau vào các bình định mức (5.13) có các thể tích như trong bảng và thêm dịch pha loãng (4.17) đến vạch.

Tính các nồng độ của FB₁ và FB₂ cho các mức hiệu chuẩn khác nhau bằng cách chia nồng độ đã được chứng nhận hoặc nồng độ tính được của dung dịch gốc (4.20) theo độ pha loãng cuối cùng được nêu trong bảng dưới đây. Nếu quan sát thấy độ bão hòa của tín hiệu detector ở mức hiệu chuẩn cao nhất, thì pha loãng 250 µl dung dịch chuẩn trung gian thành 2,0 ml để có độ pha loãng cuối cùng là 100.

Bảng 1 – Dung dịch hiệu chuẩn (4.22) được dùng để xác định tổng lượng Fumonisin B₁ và B₂

Chất hiệu chuẩn	Dung dịch chuẩn trung gian (4.21)	Bình định mức (5.13) (ml)	Dung dịch chuẩn gốc (4.20)	Nồng độ FB1 và FB2 (ng/ml)
1	50	20,0	5 000	10
2	125	10,0	1 000	50
3	125	5,0	500	100
4	500	2,0	50	1 000
5	1 000	2,0	25	2 000

Các mức hiệu chuẩn này là các khuyến nghị và có thể được điều chỉnh theo nhu cầu cụ thể. Nồng độ chính xác của các mức hiệu chuẩn phải được tính dựa trên độ pha loãng cuối cùng và nồng độ chính xác của dung dịch gốc (4.20).

CHÚ THÍCH: Các dung dịch trên có thể được bảo quản trong 5 ngày ở 6 °C ± 2 °C ở nơi tối.

4.23  Cột ái lực miễn dịch (IAC)

Các cột ái lực miễn dịch phải có một pha tĩnh với các kháng thể đơn dòng cố định đặc hiệu với ít nhất là fumonisin B₁ và B₂. Để phù hợp cho phương pháp này chúng phải đáp ứng các yêu cầu dưới đây:

Phần dịch chiết lớn hơn 5 ml từ nguồn nguyên liệu thức ăn hỗn hợp đại diện không chứa fumonisin được trộn với FB₁ và FB₂ theo tỷ lệ các phần bằng nhau ở nồng độ 920 ng/ml (cao) hoặc 110 ng/ml (thấp) cho tổng của cả hai FB₁ và FB₂. Sau đó pha loãng 5,0 ml dịch chiết thêm chuẩn này đến tổng thể tích 50,0 ml (xem 6.2).

Sau các bước được mô tả trong 6.3 và 6.4, sẽ thu được nồng độ dự kiến trong các dung dịch để bơm hoặc là 460 ng/ml hoặc là 55 ng/ml cho tổng của cả hai FB₁ và FB₂.

Sau khi đo (Điều 7) các dung dịch này, nồng độ FB₁ và FB₂ thu được có thể được tính theo Công thức (1) và Công thức (2) trong Điều 8. Chia tổng nồng độ quan sát được của FB₁ và FB₂ cho nồng độ dự kiến thu được hiệu suất của cột ái lực miễn nhiễm.

Hiệu suất này phải là 99 % ± 18 % (U, k = 2) ở mức cao và 118 % ± 18 % (U, k = 2) ở mức thấp.

Việc kiểm tra cột như trên cần được thực hiện cho mỗi mức (nồng độ) trên ít nhất ba cột được chọn ngẫu nhiên của mỗi lô cột ái lực miễn dịch mới sử dụng. Nếu sau khi thử, lô cột không đáp ứng được các yêu cầu nêu trên, thì sử dụng lô cột khác hoặc phải điều chỉnh các điều kiện trong 6.3 để thỏa mãn các yêu cầu.

Mọi thay đổi trong các quy trình làm sạch đòi hỏi phải tiến hành thẩm định lại quá trình làm sạch và tất cả các công đoạn (sắc ký) tiếp theo.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm thông thường và các thiết bị sau:

5.1  Máy nghiền

5.2  Máy trộn

Khi trộn tạo ra một chuyển động tạo nếp gấp của vật liệu đi qua, ví dụ, máy có một trống quay với các cánh vây cá và thanh gạt bên trong hoặc di chuyển lộn lên xuống trong một cái hộp kín.

5.3  Máy trộn vortex

5.4  Máy lắc phòng thí nghiệm.

5.5  Bình 250 ml có nắp vặn.

5.6  Ống đong có chia vạch, dung tích 5 ml, 50 ml, 1000 ml và 2 000 ml.

5.7  Pipet loại A, dung tích 2 ml, 10 ml và 50 ml.

5.8  Cân phân tích (d = 0,01 g).

5.9  Bộ lọc vi sợi thủy tinh, không có chất kết dính với kích thước lỗ khoảng 2 µm.

5.10  Phễu lọc, có kích thước thích hợp.

5.11  Lọ cấp mẫu tự động, kích thước thích hợp có nắp đậy.

5.12  Bình chứa dùng cho cột IAC

Có kích thước thích phù hợp với bộ chuyển đổi để đấu nối với đầu của IAC.

5.13  Bình định mức [loại A, trong TCVN 7153 (ISO 1042)], dung tích 2 ml, 5 ml, 10 ml và 20 ml.

5.14  Xyranh thủy tinh kín khí và/hoặc bộ pipet tự động chuyển trực tiếp

Có khả năng phân phối chính xác các thể tích sau: 5 µl, 50 µl, 125 µl, 160 µl, 500 µl và 1 000 µl.

5.15  Giá đỡ để giữ các cột ái lực miễn dịch, kích thước thích hợp.

5.16  Hệ máy HPLC, bao gồm:

5.16.1  Hệ thống phân phối dung môi

Có khả năng tạo ra gradient hai kênh với độ chính xác đầy đủ ở áp suất yêu cầu.

5.16.2  Bơm mẫu tự động

Có thể bơm đủ thể tích dung dịch với độ lặp lại đủ và đối với việc tạo dẫn xuất trước cột, có khả năng trộn thuốc thử và dung dịch mẫu trước khi bơm.

5.16.3  Cột sắc ký

Bất kỳ cột nào bảo đảm pic đối xứng (hệ số bất đối xứng của pic 0,9 < As < 1,4 ở 10 % toàn bộ chiều cao), đủ thời gian lưu (k > 2) và độ phân giải (Rs > 1) đối với FB₁ và FB₂.

5.16.4  Detector huỳnh quang

Có thể đo ở bước sóng kích thích và phát xạ cần thiết và được trang bị cuvet dòng chảy có kích thước phù hợp.

5.16.5  Hệ thống tạo dẫn xuất sau cột (không cần nếu đã sử dụng tạo dẫn xuất trước cột)

Có thể dùng hệ tạo dẫn xuất sau cột bán sẵn hoặc hệ thống tự lắp. Nếu dùng hệ thống tự lắp cần có:

– Máy bơm thuốc thử: có khả năng tạo ra áp suất để cấp dòng chảy thuốc thử vào buồng tạo dẫn xuất ổn định không có xung.

– Ống Polyetheretherketone (PEEK): đường kính ngoài theo yêu cầu của hệ HPLC sử dụng và đường kính bên trong khác nhau, ví dụ: đường kính ngoài 1/16″ và đường kính trong: 0,04″, 0,02″, 0,01″ và/hoặc 0,005″.

– Bộ trộn chữ T: bằng Polyetheretherketone (PEEK) có thể tích bên trong nhỏ.

5.17  Bộ lọc Nylon cỡ lỗ 0,45 µm.

6  Chuẩn bị mẫu

6.1  Chuẩn bị mẫu

Điều quan trọng là phòng thí nghiệm nhận được mẫu thực sự đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Các mẫu cần được nghiền nhỏ và trộn đều bằng máy nghiền (5.1) và máy trộn kiểu trống (5.2) hoặc quá trình trộn khác mà có thể trộn đồng đều mẫu trước khi lấy ra phần mẫu thử để phân tích.

Trong mọi trường hợp: Nếu mẫu đông lạnh thì cần làm tan băng hoàn toàn trước khi lấy mẫu. Trộn mẫu kỹ trước khi lấy phần mẫu thử để phân tích.

CHÚ THÍCH: Các mẫu đưa đi nghiên cứu liên phòng thí nghiệm [3] được nghiền nhỏ đến kích thước hạt khoảng 0,5 mm.

6.2  Chiết FB₁ và FB₂

– Lấy 20,0 g mẫu thử cho vào một hộp chứa đủ lớn có nắp đậy, ví dụ: Bình 250 ml (5.5);

– Thêm 200 ml dung môi chiết (4.18), đậy nắp và lắc mạnh bằng tay, để các thành phần của mẫu phân tán đều;

– Đặt bình trên máy lắc (5.4) và lắc trong 120 min; chọn tốc độ sao cho các thành phần được trộn đều mà không bám trên bình;

– Để yên cho mẫu chiết lắng xuống sau khi lắc;

– Thu lấy 5,0 ml dịch chiết lỏng nổi phía trên và pha loãng với PBS (4.16) đến thể tích 50,0 ml và trộn;

– Chuẩn bị phễu lọc (5.10) với bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.9) và

– Lọc dịch chiết lỏng từ mẫu đã được pha loãng và thu dịch chiết vào một bình mới (5.5).

Dịch chiết pha loãng đã lọc này có thể được bảo quản ở 4 °C đến 10 °C qua đêm.

Trong trường hợp vật liệu bị nhiễm trên 10 000 µg/kg (xem Điều 8), thì lấy 10,0 ml dịch chiết pha loãng đã lọc và thêm PBS (4.16) đến tổng thể tích 50,0 ml và trộn.

6.3  Làm sạch

– Dùng IAC (cột ái lực miễn dịch 4.23) cho mỗi một dịch chiết;

– Gắn cột vào bình chứa (5.12), không tháo dung dịch bảo quản cột ra khỏi cột;

– Cho vào bình 25,0 ml dịch chiết pha loãng đã lọc (6.2);

– Mở khóa của cột;

– Để chảy chậm qua cột (tốc độ chảy phải là một giọt trên giây đến hai giọt trên giây);

– Sau khi dịch chiết pha loãng đã chảy hết qua cột, rửa IAC bằng 10 ml PBS (4.16);

– Thổi không khí qua IAC (ví dụ: sử dụng ống bơm lớn nối với cột) để thổi hết PBS dư;

– Đặt bình định mức 5 ml (5.13) hoặc ống đong có chia vạch 5 ml (5.6) bên dưới IAC và thêm 5 x 500 µl metanol (4.2) vào IAC (chỉ khi metanol ở lần thêm trước đã ra hết khỏi cột mới thêm tiếp 500 µl);

– Thu lấy tất cả dịch rửa giải vào bình định mức (5.13) hoặc ống đong (5.6);

– Sau khi tất cả metanol (4.2) đã đi qua cột thì thêm 2,0 ml nước (4.1) vào IAC;

– Tiếp tục thu lấy dịch rửa giải vào bình định mức hoặc ống đong, và

– Cẩn thận thổi không khí qua cột để thu được nhiều nhất lượng nước (4.1) đã thêm vào cột.

6.4  Dung dịch thử

– Đối với phương pháp tạo dẫn xuất trước cột: Thêm nước (4.1) vào bình định mức hoặc ống đong cho đủ 5 ml;

– Đối với phương pháp tạo dẫn xuất sau cột: thêm 5 µl axit formic (4.14) và nước (4.1) vào bình định mức hoặc ống đong cho đủ 5 ml;

– Trộn các thành phần trong bình định mức hoặc ống đong và chuyển phần dung dịch thử vào lọ lấy mẫu tự động (5.11).

Dung dịch mẫu thử này có thể được bảo quản ở 4 °C đến 10 °C trong hai ngày.

6.5  Quy trình thêm chuẩn

Để xác định độ thu hồi, thực hiện thêm dung dịch chuẩn gốc FB₁ và FB₂ (4.20) hoặc dung dịch gốc đã pha loãng vào nguyên liệu thức ăn hỗn hợp không chứa fumonisin. Mức thêm phải phù hợp và lượng thêm không được vượt quá 1 ml. Để mẫu đã thêm chuẩn trong khoảng 30 min cho dung môi bay hơi.

7  Cách tiến hành

7.1  Điều kiện vận hành HPLC

7.1.1  Yêu cầu chung

Các khuyến nghị về điều kiện vận hành tốt với các thiết bị được liệt kê trong 5.16. Có nhiều khả năng, cần phải điều chỉnh nếu đang sử dụng các thiết bị khác thì mới có được độ phân giải và thời gian lưu thích hợp (5.16.3). Những điều chỉnh này có thể bao gồm, nhưng không giới hạn trong những điều chỉnh sau: chương trình bơm mẫu, dung tích bơm, tỷ lệ phần trăm dung môi ở chế độ đẳng dòng hoặc gradient, tốc độ dòng và/hoặc nhiệt độ cột.

7.1.2  Tạo dẫn xuất trước cột

Nếu sử dụng thiết bị nêu trong 5.16, các điều kiện sau đây cho kết quả đạt yêu cầu:

a) chương trình bơm mẫu tự động:

1) lấy 20 µl dung dịch đệm phản ứng tạo dẫn xuất trước cột (4.19.2);

2) lấy 40 µl dung dịch thử (6.4);

3) lấy 20 µl dung dịch đệm phản ứng tạo dẫn xuất trước cột (4.19.2);

4) trộn 20 lần, và

5) bơm tất cả.

Tất cả các bước trên đây có thể thực hiện thủ công (điều chỉnh tổng thể tích trong khi vẫn duy trì tỷ lệ các thể tích, nếu cần) nếu bảo đảm chắc chắn rằng dung dịch sẽ được bơm trong vòng 3 min sau khi trộn. Điều quan trọng tiếp là khoảng thời gian từ khi trộn đến khi bơm phải như nhau đối với tất cả mẫu thử và các dung dịch hiệu chuẩn.

b) Thể tích bơm: 80 µl;

c) Nhiệt độ cột: 40 °C;

d) Tốc độ dòng: 1,0 ml/min;

e) Detector huỳnh quang: Bước sóng kích thích λ: 335 nm; phát xạ λ: 440 nm (cần kiểm tra xem các bước sóng đó có đúng là các vị trí cực đại của detector huỳnh quang được sử dụng hay không);

f) Pha động:

1) A: axit formic 0,5 % (4,14) hòa tan trong nước (4.1);

2) B: axit formic 0,5 % (4,14) hòa tan trong metanol (4.2).

g) Thiết lập gradient (HPLC thể tích lưu 0,8 ml) xem bảng 2.

Bảng 2 – Thiết lập gradient cho việc tạo dẫn xuất trước cột

Thời gian (min)	B (%)
0	69,5
14	79
14,01	100
17,01	100
17,02	69,5
20	69,5

Đối với các thiết bị mà có thể tích lưu khác cần điều chỉnh gradient để đạt được độ phân giải như độ phân giải nêu ra trong Phụ lục A. Mục tiêu là cần đạt được hệ số rửa giải đối với FB₁ k > 3.

7.1.3  Tạo dẫn xuất sau cột

Hướng dẫn lắp ráp hệ thống (5.16.5):

Đường dẫn đến cột sắc ký (5.16.3) không có thay đổi so với khi hoạt động bình thường. Đầu ra của cột được nối với một trong ba cổng của bộ trộn chữ T (xem 5.16.5). Ống nối từ cột đến bộ trộn chữ T càng ngắn càng tốt.

Cổng thứ hai của bộ trộn chữ T được nối với máy bơm (xem 5.16.5) để cấp thuốc thử. Ống nối này nên sử dụng một được làm bằng một đoạn ống PEEK có đường kính trong 0,005 inch (xem 5.16.5) để tạo ra một áp lực ngược sao cho bơm cấp thuốc thử hoạt động đúng cách. Điều quan trọng nhất là dòng chảy của thuốc thử tạo phản ứng phải không được có xung. Chỉ một xung nhỏ cũng có thể gây ra sự tắt dần áp lực giữa bơm và tạo áp suất ngược bên trong ống nối PEEK. Để phòng tránh hiện tượng này có thể sử dụng ống nối PEEK đường kính trong lớn hơn. Cổng ra thứ ba – cổng chính của bộ trộn chữ T – được nối qua cuộn phản ứng rồi nối vào detector huỳnh quang. Chiều dài, cũng chính là thể tích của cuộn phản ứng phải đảm bảo được sự cân bằng giữa việc duy trì độ phân giải của cột sắc ký (ngắn) và bảo đảm phản ứng xảy ra hoàn toàn (dài). Đường kính bên trong của cuộn phản ứng ít quan trọng. Nếu chọn đường kính quá nhỏ thì sẽ tạo ra áp suất ngược. Nếu sử dụng cuộn phản ứng là ống PEEK dài 2,5 m, đường kính trong 0,02 inch thì sẽ thu được kết quả khả quan.

Khi sử dụng thiết bị nêu trong 5.16, các điều kiện sau đây sẽ cho kết quả khả quan:

a) Thể tích bơm: 50 µl

b) Nhiệt độ cột: 45 °C

c) Tốc độ dòng: 1,2 ml/min (pha động); 0,45 ml/min (thuốc thử tạo phản ứng sau cột (4.19.1)).

d) Detector huỳnh quang: Kích thích λ: 335 nm; Phát xạ λ: 440 nm (cần kiểm tra xem các bước sóng đó có đúng là các vị trí cực đại của detector huỳnh quang được sử dụng hay không).

e) Pha động

1)  A: axit formic 0,1 % (4.14) pha trong nước (4.1);

2)  B: axit formic 0,1 % (4.14) pha trong Axetonitril (4.3).

Cài đặt gradient: xem Bảng 3.

Bảng 3 – Cài đặt gradient để tạo dẫn xuất sau cột

Thời gian (min)	B (%)
0	34
13	34
13,01	95
16	95
16,01	34
19	34

Việc tách là đẳng dòng nhưng để tránh việc tích tụ các thành phần nền mẫu, nên cần có đoạn cài đặt đến 95 % B. Tỷ lệ phần dung môi phải được điều chỉnh sao cho hệ số rửa giải FB₁ là k > 2.

7.2  Xác định các fumonisin trong dung dịch thử

Bơm các lượng dung dịch thử (6.4) vào máy sắc ký sử dụng các điều kiện tương tự như khi chạy các dung dịch hiệu chuẩn (4.22).

7.3  Trình tự chạy sắc ký

Luôn bắt đầu mỗi mẻ đo với một thuốc thử trắng để kiểm tra hệ thống. Sau đó bơm các dung dịch hiệu chuẩn. Trước khi bơm dung dịch thử đầu tiên, cần phải bơm thuốc thử trắng để bảo đảm rằng không có sự chuyển các chất từ mẻ trước sang mẻ sau. Các dung dịch thử phải được chạy hai lượt (lặp lại) và chạy lại các dung dịch hiệu chuẩn xen kẽ sau những khoảng thời gian đều nhau. Tần suất của những lần chạy lại dung dịch hiệu chuẩn này phụ thuộc vào sự ổn định của hệ sắc ký.

7.4  Hiệu chuẩn

Dựng đường chuẩn: lấy tín hiệu (diện tích hoặc chiều cao các pic) của tất cả các dung dịch hiệu chuẩn đã xác định được đối với các nồng độ tương ứng cho FB₁ và FB₂ riêng rẽ. Không sử dụng giá trị trung bình của nhiều lần bơm. Với sự ước lượng hồi quy tuyến tính của đồ thị nối các điểm trên tọa độ để vẽ được hai đường chuẩn ước tính cho hai chất (FB₁ và FB₂). Kiểm tra sự có nghĩa của hệ số chặn và độ tuyến tính.

7.5  Nhận biết pic

Việc nhận biết các pic FB₁ hoặc FB₂ trong dung dịch thử bằng cách đối chiếu thời gian lưu của dung dịch thử với thời gian lưu của các dung dịch hiệu chuẩn gần nhất trong mẻ phân tích. Tín hiệu (diện tích hoặc chiều cao) của FB₁ hoặc FB₂ trong dung dịch thử phải nằm trong khoảng hiệu chuẩn. Nếu như tín hiệu FB₁ và/hoặc FB₂ trong dung dịch thử vượt quá các tín hiệu cao nhất của dung dịch hiệu chuẩn, thì cần pha loãng dung dịch thử với dịch pha loãng (4.17) để đưa nồng độ của dung dịch thử vào trong khoảng tuyến tính của nồng độ hiệu chuẩn sau đó tiến hành phân tích lại. Hệ số pha loãng phải được hợp nhất và đưa vào mọi phép tính sau đó.

8  Xác định nồng độ

Sử dụng đường chuẩn ước tính và các hệ số độ dốc và hệ số chặn ước tính của đường hồi quy tuyến tính (7.4) để tính ra các nồng độ FB₁ (C_T (FB1)) và FB₂ (C_T (FB2)) trong các dung dịch thử (6.4) từ giá trị trung bình cộng kết quả của hai lần bơm mẫu như sau:

	(ng/ml)	(1)
	(ng/ml)	(2)

Nếu dung dịch thử đã phải pha loãng vì tín hiệu nằm ngoài dải nồng độ hiệu chuẩn (7.5), thì nhân các nồng độ tính toán của FB₁ (c_T (FB1)) và FB₂ (c_T(FB2)) với hệ số pha loãng.

Để tính được các phần khối lượng (w_SMP) của các chất phân tích trong các vật liệu ban đầu, sử dụng công thức sau:

(ng/g hoặc µg/kg)

Trong đó:

cT	là nồng độ tính được (ng/ml) của FB1 (1) hoặc FB2 (2), có thể được điều chỉnh pha loãng;
mSMP	là khối lượng (g) của vật liệu thử (mẫu) đã dùng để chiết (20,0 g);
V1	là tổng thể tích (ml) của dung môi chiết (200,0 ml);
V2	là thể tích (ml) của phần dịch chiết đã lọc được dùng để pha loãng (5,0 ml);
V3	là tổng thể tích (ml) của dịch chiết thô đã pha loãng (50,0 ml);
V4	là thể tích (ml) của phần dịch chiết đã lọc và pha loãng được dùng cho IAC (25,0 ml);
V5	là tổng thể tích (ml) của dung dịch thử (5,0 ml).

Nếu khối lượng mẫu thử và các thể tích được mô tả ở đây được giữ nguyên, thì phương trình (3) trên có thể được đơn giản thành;

wSMP = cT x 20 (µg/kg)

(4)

Nếu kết quả của Công thức (4) lớn hơn 10 000 µg/kg hoặc nếu trước đó biết mức độ mẫu thử bị nhiễm có thể vượt quá giá trị đó, thì pha loãng dịch chiết (6.2) với hệ pha loãng bổ sung (hệ số pha loãng bổ sung 50/10 = 5). Công thức đơn giản sau đó sẽ là:

WSMP = cT x 20 x 5 = cT x 100 (µg/kg)

(5)

Thực hiện các tính toán như trên cho FB₁ và FB₂. Tổng của cả hai sẽ được tính như sau:

WSMP = wSMP, FB1 + wSMP, FB2 (µg/kg)

(6)

9  Độ chụm

9.1  Nghiên cứu cộng tác

Chi tiết của việc nghiên cứu liên phòng thí nghiệm về độ chính xác của phương pháp được thể hiện trong^[3]. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thí nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

9.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một chất liệu thử trong cùng một phòng thí nghiệm do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Bảng 4 – Độ chụm của dữ liệu lặp lại

= 3 110 µg/kg	r = 229 µg/kg
= 5 000 µg/kg	r = 282 µg/kg
= 5 600 µg/kg	r = 826 µg/kg
= 8 200 µg/kg	r = 809 µg/kg
= 16 000 µg/kg	r = 1 120 µg/kg

Mối tương quan giữa r và  có thể được ước lượng bằng công thức sau:

r = 2,8 x 0,031 x

(7)

có nghĩa là độ lệch chuẩn lặp lại tương đối là không đổi trong dải làm việc.

9.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp trên cùng một chất liệu thử nghiệm trong các phòng thí nghiệm khác nhau với những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt giới hạn tái lập R.

Bảng 5 – Độ chụm của dữ liệu tái lập

= 3 110 µg/kg	R = 1 650 µg/kg
= 5 000 µg/kg	R = 2 140 µg/kg
= 5 600 µg/kg	R = 2 420 µg/kg
= 8 200 µg/kg	R = 3 450 µg/kg
= 16 000 µg/kg	R = 8 980 µg/kg

Mối tương quan giữa R và  có thể được ước lượng một cách đầy đủ bằng công thức sau:

R = 2,8 x 0,18 x

(8)

nghĩa là độ lệch chuẩn tương đối tái lập là không đổi trong dải làm việc.

10  Báo cáo kết quả

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và kiểu loại xử lý mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày phân tích;

f) kết quả kiểm tra thu được và đơn vị biểu thị kết quả;

g) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được;

h) các bất thường quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

i) các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn, mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

 

Phụ lục A

(tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các dữ liệu sau đây thu được trong một nghiên cứu liên phòng thí nghiệm^[3] theo Hướng dẫn của AOAC về thủ tục nghiên cứu hợp tác để đánh giá xác nhận các đặc tính của phương pháp phân tích^[2].

Bảng A.1 – Dữ liệu về độ chụm

Mẫu	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi
Năm thực hiện hợp tác nghiên cứu	2008	2008	2008	2008	2008
Số lượng phòng thí nghiệm tham gia	16	16	16	16	16
Số lượng phòng thí nghiệm bị loại ra	0	0	0	0	0
Số phòng thí nghiệm không tuân thủ	4	4	4	4	4
Số kết quả được chấp nhận	12	12	12	12	12
Giá trị trung bình  (µg/kg)	3 110	5 000	5 600	8 200	16 000
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, (µg/kg)	81,9	101	295	289	398
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, (%)	2,6	2,0	5,3	3,5	2,5
Giới hạn lặp lại ra, (µg/kg)	229	282	826	809	1 120
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, (µg/kg)	589	766	863	1 230	3 210
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDr, (%)	19	15	15	15	20
HORRAT	1,4	1,2	1,3	1,3	1,9
Giới hạn tái lập, Rb (µg/kg)	1 650	2 140	2 420	3 450	8 980
Độ thu hồi (%)	n.ac	69	n.a.c	79	n.a.c
a r = 2,8 x Sr b R = 2,8 x SR c không áp dụng

Bảng A.2 – Thành phần vật liệu

Vật liệu thử	Thành phần	Phần	Các thành phần chủ yếu
Mẫu trắng	Thức ăn cho thỏ	4	ngũ cốc, hạt, các sản phẩm phụ của cây trồng, rau, khoáng chất
	Thức ăn cho ngựa	5	yến mạch, đại mạch, bột mì, mảnh ngô, mảnh đậu, sợi, dầu, gỉ mật
	Thức ăn cho lợn	5	đậu Hà Lan, đậu nành rang, lúa mì, lúa mạch, tinh bột sắn, cải bắp, mỡ động vật, ngô, muối
Loại B	Mẫu trắng	4	Xem “Mẫu trắng”.
	Bột ngô	1	Ngô nhiễm tự nhiên
Loại C	Mẫu trắng	2	Xem “Mẫu trắng”.
	Bột ngô	1	Ngô nhiễm tự nhiên
Loại SH	Bột ngô	1	Ngô nhiễm tự nhiên

Bảng dưới đây thống kê các dữ liệu về độ chính xác được tính sau khi hiệu chỉnh các số liệu được báo cáo của mỗi phòng thí nghiệm với mức độ thu hồi trung bình rõ ràng của phòng thí nghiệm tương ứng. Bảng này được thêm vào chỉ phục vụ mục đích thông tin.

Bảng A.3 – Dữ liệu về độ chính xác sau khi điều chỉnh mức thu hồi

Mẫu	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi	Thức ăn chăn nuôi
Năm thực hiện hợp tác nghiên cứu	2008	2008	2008	2008	2008
Số lượng phòng thí nghiệm tham gia	16	16	16	16	16
Số lượng phòng thí nghiệm bị loại ra	0	0	0	0	0
Số phòng thí nghiệm không tuân thủ	4	4	4	4	4
Số kết quả được chấp nhận	12	12	12	12	12
Giá trị trung bình  (µg/kg)	4 160	6 760	7610	11 100	21 700
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, (µg/kg)	113	148	389	397	543
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, (%)	2,7	2,2	5,1	3,6	2,5
Giới hạn lặp lại r a, (µg/kg)	315	413	1 090	1 110	1 520
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, (µg/kg)	814	816	1 670	1 740	5 560
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDr, (%)	20	12	22	16	26
HORRAT	1,5	1,0	1,9	1,4	1,5
Giới hạn tái lập, Rb (µg/kg)	2 280	2 290	4 660	4 880	15 600
Độ thu hồi (%)	n.ac	100	n.a.c	100	n.a.c
a r = 2,8 x Sr b R = 2,8 x SR c không áp dụng

 

Phụ lục B

(tham khảo)

Ví dụ về các sắc ký đồ

Hình B.1 – Ví dụ sắc ký đồ có tạo dẫn xuất sau cột và các điều kiện quy định

Mẫu trắng thức ăn chăn nuôi được thêm chuẩn ở mức khoảng 5 mg/kg đối với tổng của FB₁ và FB₂. IAC rửa giải được làm khô và được hòa với 0,5 ml pha động.

Hình B.2 – Ví dụ sắc ký đồ có tạo dẫn xuất trước cột và các điều kiện quy định

Mẫu trắng thức ăn chăn nuôi được thêm chuẩn ở mức khoảng 5 mg/kg đối với tổng của FB₁ và FB₂. IAC chất rửa giải được làm khô và hòa với 0,5 ml pha động

Hình B.3 – Ví dụ sắc ký đồ có tạo dẫn xuất trước cột và các điều kiện quy định

Mẫu trắng thức ăn chăn nuôi được thêm chuẩn ở mức khoảng 5 mg/kg đối với tổng của FB₁ và FB₂ IAC dịch rửa giải được làm khô và hòa với 0,5 ml pha động.

Thức ăn chăn nuôi bị nhiễm tự nhiên ở mức khoảng 6 mg/kg cho tổng của FB₁ và FB₂. IAC rửa giải không được làm khô.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Quy định của Ủy ban (EC) số 152/2009 ngày 27 tháng 1 năm 2009 đưa ra các phương pháp lấy mẫu và phân tích để kiểm soát chính thức thức ăn, Tạp chí chính thức của Liên minh châu Âu, 26.2.2009, L54, trang. 1-130.

[2] AOAC International 1995, Chương trình Phương pháp AOAC, trang. 23-51

[3] Báo cáo theo sát nghiên cứu hợp tác: Xác định hỗn hợp của Fumonisin B₁ và B₂ đối với thức ăn chăn nuôi và bột ngô bằng phương pháp rửa cột ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) detector huỳnh quang, Breidbach, A., Bouten, K. , Kroeger, K., Stroka, J .. Ủy ban châu Âu

– Các nghiên cứu khoa học và kỹ thuật, EUR 23941 EN, ISSN 1018-5593.

http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/.