TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12620:2019 VỀ PHÂN BÓN – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NITƠ FORMOL VÀ HIỆU CHÍNH VỚI NITƠ AMONIAC

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12620:2019

PHÂN BÓN – XÁC ĐỊNH TỔNG HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NITƠ FORMOL VÀ HIỆU CHÍNH VỚI NITƠ AMONIAC

Fertilizers – Determination of free amino acids content by formaldehyde titration method and subtracting by ammoniacal nitrogen

Lời nói đầu

TCVN 12620:2019 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN – XÁC ĐỊNH TỔNG HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NITƠ FORMOL VÀ HIỆU CHÍNH VỚI NITƠ AMONIAC

Fertilizers – Determination of free amino acids content by formaldehyde titration method and subtracting by ammoniacal nitrogen

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định tổng hàm lượng axit amin tự do trong phân bón bằng phương pháp định lượng nitơ formol và hiệu chính với nitơ amoniac.

Tiêu chuẩn này không áp dụng cho các loại phân bón có chứa urê.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991), Phân bón rắn – phương pháp chuẩn bị mẫu để xác định các chỉ tiêu hóa học và vật lý.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Axit amin tự do (free amino acid)

Nhóm axit amin ưa nước, có liên kết chặt chẽ với môi trường nước và thường tạo liên kết hydro với môi trường và giữa các axit amin với nhau.

4  Nguyên tắc chung

Axit amin trong nước có môi trường trung tính, do hai nhóm chức axit cacboxylic (-COOH) và amin (-NH₂) đều yếu, quá trình điện ly kém, đồng thời hai nhóm chức này còn trung hòa lẫn nhau. Khi kết hợp với formol, nhóm amin tạo thành nhóm methylen, muối amoni trung tính tạo thành hexamethylen tetramin và HCl. Chuẩn độ lượng HCl được tạo ra trong phản ứng và nhóm COOH bằng dung dịch natri hydroxit 0,1 N cho đến khi pH dung dịch đạt 9,2. Dựa vào lượng kiềm tiêu tốn khi chuẩn độ để tính tổng hàm lượng nitơ amin và nitơ amoniac (gọi chung nitơ formol).

Muối amoni hòa tan trong nước và được kiềm hóa bằng magie oxit. Hàm lượng nitơ amoniac được định lượng bằng phương pháp Kjeldahl.

Hàm lượng nitơ axit amin được tính bằng cách hiệu chính hàm lượng nitơ formol với hàm lượng nitơ amoniac.

5  Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, trong quá trình phân tích chỉ sử dụng các hóa chất, thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích và nước cất phù hợp với TCVN 4851:1989 (ISO 3696 :1987) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (sau đây gọi là nước).

5.1  Magie oxit (MgO) thể rắn, không chứa cacbonat.

5.2  Dung dịch axit clohydric (HCl) chuẩn 0,1 N hoặc dung dịch axit sulfuric chuẩn (H₂SO₄) 0,1 N, được pha từ ống chuẩn.

5.3  Dung dịch natri hydroxit (NaOH) chuẩn 0,1 N: Pha từ ống chuẩn.

CHÚ THÍCH 1: Cần xác định lại nồng độ dung dịch NaOH chuẩn trước khi sử dụng bằng dung dịch axit chuẩn.

5.4  Thymolphtalein (C₂₈H₃₀O₄) thể rắn.

5.5  Dung dịch thymolphtalein 1 %: Hòa tan 1 g thymolphtalein (5.4) với 99 ml ethanol 95 %. Lắc đều.

5.6  Fomaldehyt (HCHO) đậm đặc.

5.7  Dung dịch fomaldehyt (formol) trung tính: Hút 50 phần thể tích dung dịch fomaldehyt đậm đặc (5.6) hòa tan với 1 phần thể tích dung dịch thymolphtalein 1 % (5.5), thêm từ từ dung dịch natri hydroxit 0,1 N (5.3) cho đến khi dung dịch có màu xanh nhạt.

5.8  Kali clorua (KCI) thể rắn.

5.9  Dung dịch kali clorua 1 mol/L: Hòa tan 74.5 g kali clorua (5.8) với khoảng 500 mL nước trong bình định mức dung tích 1000 mL. Thêm nước đến vạch và lắc đều.

5.10  Nhôm clorua (AlCl₃.6H₂O) thể rắn.

5.11  Dung dịch nhôm clorua 1 mol/L Hòa tan 240 g nhôm clorua (5.10) với khoảng 500 mL nước trong bình định mức dung tích 1000 mL. Thêm nước đến vạch và lắc đều.

5.12  Kali hydroxit (KOH) thể rắn.

5.13  Dung dịch kali hydroxit 170 g/L: Hòa tan 170 g kali hydroxit (5.12) với khoảng 500 mL nước trong bình định mức dung tích 1000 mL. Thêm nước đến vạch và lắc đều.

5.14  Axit clohydric (HCl) đậm đặc d = 1,184.

5.15  Dung dịch axit clohydric tỷ lệ 1:200: Pha loãng axit clohydric đậm đặc (5.14) với nước theo tỷ lệ 1:200 về thể tích.

5.16  Amoni sulfat [(NH₄)₂SO₄) thể rắn.

5.17  Dung dịch amoni sulfat 0,5 g N/L: Hòa tan 2,3571 g amoni sulfat (5.16) (đã được sấy ở 100 °C trong 2 h và để trong bình hút ẩm) vào cốc dung tích 100 mL, sau đó chuyển vào bình định mức dung tích 1000 mL. Thêm nước đến vạch và lắc đều. Bảo quản kín ở 20 °C.

5.18  Metyl đỏ (C₁₅H₁₅N₃O₂) thể rắn.

5.19  Dung dịch chỉ thị methyl đỏ 0,1 g/100 ml: Hòa tan 0,1 g metyl đỏ (5.18) với khoảng 50 mL ethanol 95 % trong bình định mức dung tích 100 mL. Thêm ethanol 95 % đến vạch và lắc đều.

5.20  Methylen xanh (C₃₇H₂₇N₃Na₂O₉S₃) thể rắn.

5.21  Dung dịch chỉ thị methylen xanh 1 g/100 mL : Hòa tan 1 g methylen xanh (5.20) với khoảng 20 mL ethanol 95 %, trong bình định mức dung tích 100 ml. Thêm ethanol 95 % đến vạch và lắc đều.

5.22  Hỗn hợp chỉ thị methyl đỏ – methylen xanh: Hòa tan 2 phần thể tích dung dịch methyl đỏ (5.19) với 1 phần thể tích dung dịch methylen xanh (5.21).

5.23  Thymol xanh (C₂₇H₃₀O₅S) thể rắn.

5.24  Dung dịch chỉ thị thymol xanh 1 g/100mL : Hòa tan 1 g thymol xanh (5.23) với khoảng 20 mL ethanol 95 %, trong bình định mức dung tích 100 mL. Thêm ethanol 95 % đến vạch và lắc đều.

6  Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ, thiết bị sau:

6.1  Cân phân tích, độ chính xác 0,0001 g.

6.2  Thiết bị chưng cất Kjeldahl.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị mẫu

7.1.1  Phân bón dạng rắn

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 10683:2015.

7.1.2  Phân bón dạng lỏng

Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được lắc đều.

Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

7.2  Xác định hàm lượng nitơ amin – amoniac (nitơ formol)

7.2.1  Cách tiến hành

Cân khoảng 5 g mẫu đã được chuẩn bị theo 7.1.1 và 7.1.2. chính xác đến 0,0001 g, và cho vào bình định mức dung tích 500 ml (không để mẫu dính ở cổ và thành bình). Đối với mẫu dạng lỏng (7.1.2), dùng pipet hút 5 mL dung dịch mẫu và cân chính xác đến 0,0001 g để xác định khối lượng (g), sau đó tiến hành tương tự như đối với mẫu rắn và mẫu lỏng dạng sền sệt.

Thêm khoảng 400 mL dung dịch kali clorua 1 mol/L (5.9), lắc đều trong khoảng 30 min với tốc độ lắc 30 r/min đến 40 r/min.

Thêm dung dịch nhôm clorua 1 mol/L (5.11) (3 mL AlCl₃ 1 mol/L cho mỗi 0,04 g P hay 0,1 g P₂O₅ trong dung dịch mẫu) và một vài giọt chỉ thị methyl đỏ 0,1 g/100 mL (5.19).

Thêm ngay lập tức (vừa lắc vừa thêm) dung dịch kali hydroxit 170 g/L (5.13) cho đến khi dung dịch chuyển thành màu vàng nhạt.

Thêm nước đến vạch mức, lắc đều và lọc.

Dùng pipet hút chính xác 20 mL dịch sau lọc cho vào cốc dung tích 250 mL, thêm nước đến thể tích khoảng 50 mL, trung hòa dịch lọc bằng dung dịch axit clohydric 1:200 về thể tích (5.15) cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt.

Thêm 20 ml dung dịch formol trung tính (5.7) vào rồi khuấy đều, để yên 5 min.

Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxit 0,1 N cho đến khi pH của dung dịch bằng 9,2 sử dụng máy đo pH hoặc dùng chỉ thị thymol xanh (5.24) đến khi màu dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu xanh.

Tiến hành xác định mẫu trắng với tất cả lượng hóa chất và các bước thử nghiệm như trên, thay dịch mẫu thử bằng 20 mL nước.

7.2.2  Tính kết quả

Tổng hàm lượng nitơ – formol, được tính bằng phần trăm khối lượng theo công thức (1):

(1)

trong đó

k          là hệ số hiệu chuẩn nồng độ dung dịch natri hydroxit 0,1 N;

V₁         là thể tích dung dịch natri hydroxit 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử, tính bằng mililit (mL);

V₂         là thể tích dung dịch natri hydroxit 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng mililit (mL);

m         là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

0,001401           là số gam nitơ tương ứng vời 1 mL dung dịch natri hydroxit 0,1 N;

500       là thể tích toàn bộ dịch lọc, tính bằng mililit (mL),

20         Thể tích dịch lọc dùng để xác định, tính bằng mililit (mL).

7.3  Xác định hàm lượng nitơ ammoniac

7.3.1  Lắp đặt, kiểm tra thiết bị chưng cất Kjeldahl

Tùy theo thực tế của mỗi thiết bị mà cách lắp đặt có thể khác nhau, nhưng phải tuyệt đối kín trong suốt quá trình hoạt động, có khả năng điều chỉnh được tốc độ cất và tốc độ ngưng.

Trước khi chưng cất mẫu phải kiểm tra thiết bị Kjeldahl bằng cách chưng cất 50 mL dung dịch amoni sulfat 0,5 g N/L (5.17) với kiềm. Thể tích chuẩn độ trong bình hứng hết 17,85 mL ± 0,1 mL dung dịch axit clohydric 0,1 N (5.2) là đạt yêu cầu, nếu ít hơn là do thiết bị cất bị hở, nếu lớn hơn có thể là do bị bắn kiềm từ bình cất hoặc do thiết bị không sạch, cần khắc phục và kiểm tra lại.

7.3.2  Chưng cất mẫu

Cân khoảng 0,7 g đến 3,5 g mẫu (lượng cân tùy theo lượng NH₃ trong mẫu) đã được chuẩn bị theo 7.1.1 và 7.1.2 chính xác đến 0,0001 g, và cho vào bình Kjeldahl (không để mẫu dính ở cổ và thành bình). Đối với mẫu dạng lỏng (7.1.2), dùng pipet hút 0,5 mL đến 3 mL dung dịch mẫu và cân chính xác đến 0.0001 g để xác định khối lượng (g), sau đó tiến hành tương tự như đối với mẫu rắn và mẫu lỏng dạng sền sệt.

Thêm 25 mL nước và ≥ 2 g magie oxit không chứa cacbonat (5.1).

Hút chính xác 10 mL axit sulfuric tiêu chuẩn 0,1 N (5.2) cho vào bình hứng.

Lắp bình vào bộ chưng cất sao cho đầu ra của ống sinh hàn thấp hơn bề mặt dung dịch axit, nếu cần cho thêm nước.

Tiến hành chưng cất cho đến Khi thu được khoảng 200 mL dung dịch ở bình hứng. Ngừng đun tháo ống sinh hàn, dùng bình tia tráng rửa ống sinh hàn, nước rửa thu vào bình hứng.

7.3.3  Chuẩn độ mẫu

Chuẩn độ lượng axit dư trong bình hứng bằng dung dịch chuẩn natri hydroxit 0.1 N (5.3) với hỗn hợp chỉ thị (5.22) và đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh tím sang xanh lá cây.

Tiến hành phép thử trắng trong cùng một điều kiện với cùng lượng các loại thuốc thử nhưng không có mẫu phân tích.

7.3.4  Tính kết quả

Tổng hàm lượng nitơ – amoniac, được tính bằng phần trăm khối lượng theo công thức (2):

(2)

trong đó

k          là hệ số hiệu chuẩn nồng độ dung dịch natri hydroxit 0,1 N;

V₁         là thể tích dung dịch natri hydroxit 0,1 N dùng để chuẩn độ lượng axit dư trong mẫu phân tích, tính bằng mililít (mL);

V₂         là thể tích dung dịch natri hydroxit 0,1 N dùng để chuẩn độ lượng axit dư trong mẫu trắng, tính bằng mililít (mL);

m         là khối lượng mẫu cân, tính bằng gam (g);

0,001401           là khối lượng nitơ tương ứng với 1 mL dung dịch natri hydroxit 0,1 N.

7.4  Hàm lượng nitơ – axit amin (N axit amin) tính bằng phần trăm theo công thức (3):

N_{axit amin} = N_formol – N_amoniac                                                          (3)

trong đó

N_formol   là hàm lượng nitơ formol được tính bằng phần trăm theo công thức (1);

N_amoniac là hàm lượng nitơ amoniac được tính bằng phần trăm theo công thức (2).

7.5  Hàm lượng axit amin tổng số tính bằng phần trăm theo công thức (4):

% Axit amin (tổng số) = N_{axit amin} x 6,25                                      (4)

trong đó

6,25      là hệ số chuyển đổi từ nitơ dạng axit amin sang axit amin.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm bao gồm ít nhất những thông tin sau:

1. a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;
2. b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;
3. c) Kết quả thử nghiệm;
4. d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;
5. e) Ngày thử nghiệm.