TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12628:2019 VỀ SỮA VÀ THỰC PHẨM CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12628:2019

SỮA VÀ THỰC PHẨM CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU

Milk and infant formula – Determination of choline content by colorimetric method

Lời nói đầu

TCVN 12628:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 999.14 Choline in infant formula and milk. Enzymatic colorimetric method;

TCVN 12628:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA VÀ THỰC PHẨM CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU

Milk and infant formula – Determination of choline content by colorimetric method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phân tích cholin trong các loại sữa và thực phẩm công thức dành cho trẻ sơ sinh bằng đo quang sau khi xử lý mẫu với enzym.

Giới hạn định lượng của phương pháp là từ 45 mg/100 g đến 175 mg/100 g.

Phương pháp này không phù hợp khi phân tích các mẫu sữa, sản phẩm công thức có chứa vitamin C với hàm lượng lớn hơn 100 mg/100 g vì ascorbat gây giảm cường độ màu.

2  Nguyên tắc

Thủy phân mẫu trong môi trường axit ở 70 °C để giải phóng cholin liên kết, riêng cholin liên kết với các phospholipid được giải phóng hoàn toàn bởi enzym phospholipase D. Sau đó, cholin tự do được phân giải bởi cholin oxidase và giải phóng hydro peroxit. Khi có mặt peroxidase, phenol bị oxy hóa và hợp chất màu quinoneimin được tạo thành khi sử dụng thuốc thử 4-aminoantipyrin. Đo độ hấp thu quang của dung dịch chất màu ở bước sóng 505 nm. Hàm lượng cholin được xác định và biểu thị ở dạng hydroxit.

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất, trừ khi có quy định khác.

3.1  Nước, độ dẫn điện >18 MΩ.

3.2  Dung dịch axit clohydric (HCl), 1,0 M

Lấy 85 ml axit clohydric đặc pha trong bình định mức 1 L (4.5) và pha loãng đến vạch bằng nước.

3.3  Dung dịch natri hydroxit (NaOH) 50 % (khối lượng/thể tích)

Hòa tan 50 g natri hydroxit trong khoảng 80 ml nước và thêm nước đến 100 ml.

3.4  Cholin bitartrat, ví dụ: Sigma C-2654 1).

Sấy khô khoảng từ 0,7 g đến 1,0 g cholin bitartrat ở 102 °C đến khối lượng không đổi. Bảo quản trong bình hút ẩm ở nhiệt độ thích hợp.

3.5  Dung dịch chuẩn gốc, 2 500 µg/ml tính theo cholin hydroxit

Cân chính xác khoảng 523 mg cholin bitartrat khô (3.4) vào bình định mức 100 ml (4.5). Hòa tan và định mức tới vạch bằng nước. Bảo quản ở 4 °C.

Dung dịch đã chuẩn bị bền trong một tuần.

3.6  Dung dịch chuẩn làm việc, 250 µg/ml tính theo cholin hydroxit

Lấy chính xác 10,00 ml dung dịch chuẩn gốc (3.5) và thêm nước đến 100 ml.

Chuẩn bị dung dịch trong ngày phân tích.

3.7  Đệm Tris (hydroxymetyl) aminometan (Trizma)

Thêm 6,057 g Tris (hydroxymetyl) aminometan (ví dụ: Sigma T-1503 ¹⁾) vào bình định mức 1 L (4.5) có chứa khoảng 500 ml nước. Chuyển về pH 8,0 với HCl 1 M (3.2) và định mức tới vạch bằng nước. Khi bảo quản ở 4 °C, dung dịch này ổn định trong 1 tháng.

3.8  Phospholipase D, ví dụ: Sigma loại IV, P-8023 ¹⁾, thu được từ Streptomyces chromofuscus, 150 U/mg

CHÚ THÍCH: Một đơn vị (U) hoạt độ enzym phospholipase D là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1,0 μmol cholin từ L-α-phosphatidyl cholin trong 1 h, ở pH 3,5 và nhiệt độ 30 °C.

Dạng phospholipase D này phù hợp hơn so với các loại enzym khác do hoạt tính của nó đối với sphingomyelin và lysophospholipid.

3.9  Cholin oxidase, ví dụ: Sigma C-5896 ¹⁾, thu được từ các loài Alcaligenes, 10 U/mg

CHÚ THÍCH: Một đơn vị (U) hoạt độ enzym cholin oxidase là lượng enzym cần thiết để tạo thành 1,0 μmol hydro peroxit với quá trình oxi hóa của 1,0 μmol cholin thành betain aldehyt trong 1 min ở pH 8,0 và nhiệt độ 37 °C.

3.10  Peroxidase, ví dụ: Sigma loại I, P-8125 ¹⁾, thu được từ horseradish, 80 U/mg

CHÚ THÍCH: Một đơn vị (U) hoạt độ enzym peroxidase là lượng enzym cần thiết để tạo thành 1,0 mg purpurogallin từ pyrogallon trong 20 s ở pH 6,0 và nhiệt độ 20 °C.

3.11  4-aminoantipyrin (C₁₁H₁₃N₃O), ví dụ: Sigma A4382 ¹⁾.

3.12  Phenol (C₆H₅OH).

3.13  Thuốc thử chromogenic

Cân lần lượt khoảng 75 đến 100 đơn vị phospholipase (3.8), 100 đến 120 đơn vị cholin oxidase (3.9), 250 đến 280 đơn vị peroxidase (3.10), 15 mg 4-aminoantipyrin (3.11) và 50 mg phenol (3.12) vào bình định mức 100 ml (4.5). Hòa tan và định mức tới vạch bằng dung dịch đệm Trizma 0,05 M (3.7). Chuẩn bị dung dịch trong ngày phân tích.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Máy quang phổ, có độ đọc 0,001 ở bước sóng 505 nm, sử dụng cuvet thủy tinh có chiều dài đường quang 10 mm hoặc cuvet dòng chảy liên tục.

4.2  Nồi cách thủy, có thể ổn định nhiệt độ ở 37 °C ± 2 °C và 70 °C ± 2 °C.

4.3  Máy đo pH, đọc được đến 0,01 đơn vị, có đệm hiệu chỉnh pH 4,0 và 7,0.

4.4  Pipet, thủy tinh được hiệu chỉnh hoặc pipet tự động có thể phân phối từ 0,100 ml đến 3 00 ml.

4.5  Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml và 1 L.

4.6  Bình nón, dung tích 100 ml hoặc 150 ml, có nắp đậy hoặc ống nghiệm chịu nhiệt, kích thước 150 mm x 25 mm.

4.7  Ống nghiệm thủy tinh, dung tích 10 ml có nắp đậy, có khay đựng. Có thể sử dụng ống nghiệm polypropylen hoặc polystyren.

4.8  Giấy lọc tốc độ trung bình, cỡ lỗ 1,4 µm đến 2,9 µm (Whatman No.2 hoặc loại tương đương).

4.9  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.10  Máy lắc Vortex.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

LƯU Ý: Các bước thử nghiệm cần được tiến hành trong điều kiện ánh sáng chiếu sáng tự nhiên, tránh ánh sáng huỳnh quang hoặc ánh sáng trực tiếp.

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Trước khi tiến hành phân tích, mẫu được trộn đều hoặc đồng nhất kỹ bằng máy đồng nhất mẫu.

6.2  Thủy phân mẫu

Cân khoảng 5 g mẫu đã đồng nhất (6.1), chính xác đến 1 mg, cho vào bình nón 100 ml hoặc ống nghiệm chịu nhiệt (4.6). Thêm 30 ml dung dịch HCl 1,0 M (3.2), lắc mạnh bằng tay, sau đó lắc Vortex cho tới khi đồng nhất hoàn toàn. Thủy phân ở 70 °C trong 3 h bằng nồi cách thủy (4.2), lắc đều sau mỗi giờ. Làm nguội tới nhiệt độ phòng và điều chỉnh pH đến khoảng 3,5 đến 4,0 bằng dung dịch NaOH 50 % (3.3), chuyển vào bình định mức 50 ml (4.5). Định mức và lọc qua giấy lọc (4.8), thu dịch lọc sau khi bỏ đi 5 ml đến 10 ml dịch lọc đầu tiên. Đảm bảo dịch lọc trong suốt, nếu không, cần lọc lại. Dịch lọc có thể ổn định trong 3 ngày nếu được bảo quản ở 4 °C và tránh ánh sáng.

Với mỗi mẫu thử, làm song song mẫu trắng. Chuyển nhãn dán từ dụng cụ đựng dịch lọc sang ống nghiệm (4.7), mỗi ống nghiệm chứa chính xác 0,10 ml dịch lọc.

6.3  Dựng đường chuẩn

Lấy lần lượt 2 ml, 4 ml, 6 ml và 8 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.6) cho vào 4 bình định mức 10 ml (4.5) và thêm nước đến vạch.

Chuẩn bị dãy ống nghiệm dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 0,10 ml của từng dung dịch chuẩn 50 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml và 250 µg/ml vào các ống nghiệm (4.7) đã dán nhãn.

Ống nghiệm chứa mẫu trắng thuốc thử dùng 0,10 ml nước cất.

6.4  Xác định bằng enzym

Đối với mỗi mẫu trắng, thêm chính xác 3,0 ml nước. Thêm chính xác 3,0 ml thuốc thử Chromogenic (3.13) vào các ống nghiệm mẫu thử, 5 ống nghiệm dung dịch chuẩn và mẫu trắng thuốc thử.

Đặt các ống nghiệm trong nồi cách thủy 37 °C (4.2) trong 15 min tới khi xuất hiện màu hồng hoặc màu đỏ. Lấy ống nghiệm ra và để nguội đến nhiệt độ phòng trong 15 min. Chuyển ngay lượng chứa trong các ống nghiệm vào các cuvet thủy tinh có chiều dài đường quang 10 mm hoặc cuvet dòng chảy liên tục.

Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn (A_std), dung dịch thử (A’), dung dịch mẫu trắng (A_bl) và mẫu trắng thuốc thử (A_reag) ở bước sóng 505 nm.

7  Tính kết quả

Dựng đường chuẩn của độ hấp thụ thực (A_std – A_reag) theo các nồng độ cholin tương ứng. Sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất.

Lấy hiệu số của độ hấp thụ của mẫu trắng và mẫu trắng thuốc thử đối với mỗi mẫu thử để hiệu chỉnh nền. Độ hấp thụ thực của mẫu thử:

A = A’ – A_bl – A_reag

Hàm lượng cholin trong mẫu thử, X, biểu thị dưới dạng cholin hydroxit, tính bằng mg/100 g, được tính theo công thức sau:

Trong đó:

A là độ hấp thụ thực của mẫu thử;

S là độ dốc của đường chuẩn;

V là thể tích dịch thủy phân, tính bằng mililit (V = 50 ml);

w là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

1. a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
2. b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
3. c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;
4. d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
5. e) kết quả thử nghiệm thu được;
6. f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 – Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm xác định hàm lượng cholin trong sữa và sản phẩm công thức dùng cho trẻ sơ sinh

1) Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.