TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12656:2019 VỀ THỰC PHẨM – ĐỊNH LƯỢNG NHANH STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG SẢN PHẨM THỊT VÀ THỦY SẢN SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILMTM 3MTM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12656:2019

THỰC PHẨM – ĐỊNH LƯỢNG NHANH STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG SẢN PHẨM THỊT VÀ THỦY SẢN SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM™ 3M™

Foods – Enumeration of Staphylococcus aureus in selected meat, fishery products using 3M™ Petrifilm™ staph express count plate

Lời nói đầu

TCVN 12656:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2003.11 Enumeration of Staphylococcus aureus in Selected Meat. Sea food, and Poultry-3M™ Petrifilm™ Staph Express Count Plate Method;

TCVN 12656:2019 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – ĐỊNH LƯỢNG NHANH STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG SẢN PHẨM THỊT VÀ THỦY SẢN SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM™ 3M™

Foods – Enumeration of Staphylococcus aureus in selected meat, fishery products using 3M™ Petrifilm™ staph express count plate

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm Petrifilm™ 3M™ để định lượng nhanh Staphylococcus aureus trong các sản phẩm thịt và sản phẩm thủy sản.

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận giá trị sử dụng và các kết quả đánh giá được nêu trong Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6507-2 (ISO 6887-2) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 2: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thịt và sản phẩm thịt

TCVN 6507-3 (ISO 6887-3) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản.

3  Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh. Môi trường Baird-Parker cải biến sinh màu trong đĩa là môi trường chọn lọc và đặc hiệu đối với S. aureus. Cho 1,0 ml huyền phù mẫu thử đã pha loãng vào mỗi đĩa. Để cho gel đông đặc sau khi cấy và ủ các đĩa ở 35 °C ± 1 °C hoặc 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h. Các khuẩn lạc đỏ-tím trên đĩa là S. aureus. Khi chỉ có các khuẩn lạc đỏ-tím thì đếm các khuẩn lạc này và kết thúc phép thử.

Nếu trong quá trình thử nghiệm có mặt hệ vi khuẩn nền thì sử dụng tấm phản ứng Petrifilm để nhận diện các S. aureus từ tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ. Sử dụng tấm Petrifilm 3M khi trên đĩa có mặt các khuẩn lạc không phải đỏ-tím, ví dụ: các khuẩn lạc màu đen hoặc xanh-xám. Tấm phản ứng Petrifilm này có chứa chất nhuộm màu và axit deoxyribonucleic. Enzym deoxyribonuclease (DNase) do S. aureus sinh ra sẽ phản ứng với chất nhuộm màu tạo thành quầng màu hồng. Đặt tấm phản ứng vào đĩa đếm, sau đó ủ từ 1 h đến 3 h ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C hoặc 37 °C ± 1 °C. S. aureus tạo quầng màu hồng. Đếm các quầng màu hồng được coi là các S. aureus mà không quan tâm đến kích thước của quầng tạo thành.

CHÚ THÍCH: Đôi khi là S. hyicus và S. intermedius có thể tạo quầng màu hồng và sinh độc tố.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1  Dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 M, vô trùng

Hòa tan 40 g NaOH trong nước và pha loãng đến 1 L.

Khử trùng dung dịch này bằng cách hấp 15 min trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.

4.2  Dung dịch đệm phosphat

4.2.1  Dung dịch gốc

Hòa tan 34 g kali dihydro phosphat (KH₂PO₄) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1 L, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit 1 M (4.1) và thêm nước đến vạch. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh.

4.2.2  Dung dịch pha loãng

Pha loãng 1,25 ml dung dịch gốc bằng nước đã đun sôi đến vạch 1 L và để nguội.

Khử trùng dung dịch bằng cách hấp 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 °C.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Đĩa đếm Petrifilm™ 3M™

Đĩa chứa môi trường Baird-Parker cải biến có sinh màu và chất tạo đông tan được trong nước lạnh.

5.2  Tấm phản ứng Petrifilm™ 3M™ nhận diện S. aureus, chứa ADN, chất chỉ thị Toluidine Blue-O.

5.3  Dụng cụ dàn mẫu cầm tay bằng chất dẻo được cung cấp cùng với đĩa đếm (5.1).

5.4  Pipet, đã được hiệu chuẩn, dung tích 1,0 ml, chia vạch đến 0,1 ml. Có thể dùng pipet tự động.

5.5  Thiết bị đếm khuẩn lạc, loại chuẩn hoặc loại có thể quan sát với độ khuếch đại tương đương.

5.6  Cân, có thể cân chính xác đến 0,1 g.

5.7  Thiết bị trộn tốc độ cao (16 000 r/min đến 18 000 r/min), có bình chứa vô trùng.

5.8  Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 35 °C ± 1 °C và 37 °C ± 1 °C.

5.9  Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt độ ở 121 °C.

5.10  Giấy đo pH, đo được pH trong khoảng từ 6,0 đến 8,0.

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

7  Chuẩn bị mẫu thử

7.1  Chuẩn bị phần mẫu thử, theo TCVN 6507-2 (ISO 6887-2) hoặc TCVN 6507-3 (ISO 6887-3).

7.2  Chuẩn bị huyền phù mẫu thử

Dùng cân (5.6), cân một cách vô trùng, khoảng 50 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn. (5.7). Thêm 450 ml dung dịch pha loãng (4.2.2) và trộn đều trong 2 min với tốc độ từ 16 000 r/min đến 18 000 r/min.

Nếu tổng khối lượng mẫu không đủ 50 g thì cân phần mẫu thử thích hợp và thêm dung dịch pha loãng (4.2.2) cần thiết để có độ pha loãng 10^-1.

Khi cần, chỉnh pH của mẫu thử đã pha loãng đến khoảng từ 6,0 đến 8,0 bằng dung dịch natri hydroxit (4.1) (khoảng 0,1 ml/g phần mẫu thử). Không sử dụng dịch pha loãng có chứa xitrat, bisulfit hoặc thiosulfat vì chúng có thể ức chế vi sinh vật phát triển. Chuẩn bị tất cả các độ pha loãng thập phân, sử dụng 90 ml dung dịch pha loãng cộng với 10 ml huyền phù pha loãng trước đó. Dùng pipet (5.4) chuyển lượng dung dịch cần thiết. Lắc các dung dịch 25 lần với biên độ dao động 30 cm trong thời gian 7 s.

8  Cách tiến hành

Đặt đĩa Petrifilm 3M (5.1) lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm film lên và nhỏ 1 ml huyền phù mẫu thử (7.2) vào chính giữa đĩa. Đậy cẩn thận tấm film xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù trên diện tích phát triển khoảng 30 cm² bằng cách ấn nhẹ dụng cụ dàn mẫu (5.3). Để yên đĩa cho gel đông đặc lại. Ủ đĩa ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C hoặc 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h. Đặt đĩa vào tủ ấm (5.8) mặt cấy mẫu hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa. Sau đó tiến hành quan sát màu sắc của khuẩn lạc và đếm các đĩa bằng thiết bị đếm khuẩn lạc (5.5), như sau:

– nếu không có khuẩn lạc nào thì kết thúc thử nghiệm;

– nếu chỉ có các khuẩn lạc đỏ-tím xuất hiện sau 24 h ± 2 h thì đếm các khuẩn lạc đỏ-tím này trên đĩa là S. aureus và kết thúc thử nghiệm.

– nếu có mặt khuẩn lạc không phải đỏ-tím thì sử dụng tấm phản ứng Petrifilm 3M nhận diện S. aureus (5.2).

Đặt tấm phản ứng Petrifilm 3M nhận diện S. aureus (5.2) vào đĩa. Ấn nhẹ tấm phản ứng bằng ngón tay đeo găng dọc toàn bộ tấm phản ứng (gồm cả viền mép) để đảm bảo tiếp xúc đồng đều giữa tấm phản ứng và gel và đuổi hết bọt khí. Ủ các đĩa có chứa tấm phản ứng với mỗi chồng không quá 20 đĩa từ 1 h đến 3 h ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C hoặc 37°C ± 1 °C. Đếm các quầng màu hồng là S. aureus. Các khuẩn lạc không có quầng màu hồng thì không phải là S. aureus và không đếm.

CHÚ THÍCH: Các khuẩn lạc có quầng màu hồng thường là S. aureus nhưng có thể là S. hyicus hoặc S. intermedius.

9  Tính và biểu thị kết quả

Để tính số lượng vi khuẩn, nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm tổng vi khuẩn.

Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là “quá nhiều không thể đếm được”.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

– mọi thông tin càn thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng;

– kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

– ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm;

– ngày tháng thử nghiệm;

– các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

– mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 – Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm sử dụng đĩa đếm Petrifilm™ 3M™ và sử dụng thạch Baird-Parker để phát hiện Staphylococcus aureus trong thực phẩm